Translace a genetický kód
Jan Šmarda
Ústav experimentální biologie, PřF MU
Přednáška kurzu Bi4010 Základy molekulární biologie, 2018/19
2
Změna jediné aminokyseliny může
zásadně ovlivnit funkci proteinu
Srpkovitý tvar červených krvinek u srpkovité anémie:
důsledek záměny jedné aminokyseliny v molekule hemoglobinu
Srpkovitá anémie
3
Srpkovitá anémie –
historické souvislosti
1904: chicagský lékař James Herrick objevil v
krevním vzorku pacienta afrického původu se
zvětšeným srdcem, který trpěl slabostí, závratěmi
a únavou, buňky neobvyklého srpkovitého tvaru
- Herrick poprvé vyslovil hypotézu že srpkovité
červené krvinky by mohly být příčinou anémie
a dalších symptomů tohoto onemocnění
4
Srpkovitá anémie –
historické souvislosti
1927: důkaz, že změna tvaru normálních červených krvinek na srpkovité
souvisí s poruchou jejich funkce – transportu kyslíku v těle
1949: Linus Pauling, americký chemik (který jako první
aplikoval principy kvantové mechaniky v chemii a podílel
se rovněž na studiu prostorové stavby bílkovin), formuloval
hypotézu, že příčinou srpkovité anémie by mohla být
abnormální forma hemoglobinu, tj. hlavního proteinu,
který zodpovídá za vazbu kyslíku
- hypotéza byla úspěšně ověřena elektroforetickými
technikami
- Nobelova cena za chemii v roce 1954
1901-1994
5
Srpkovitá anémie –
historické souvislosti
1954: Vernon Ingram (1924-2006)
hemoglobin ze zdravých a srpkovitých buněk štěpen
trypsinem na fragmenty, které byly odděleny
elektroforézou a peptidovým mapováním nalezen jeden
odlišný peptid
trypsin štěpí proteiny za aminokyselinami lyzinem a
argininem, pokud po nich nenásleduje prolin
v sekvenci aminokyselin ß-řetězce hemoglobinu S
nalezena jediná záměna: valin (hydrofobní) nahradil
kyselinu glutamovou v pozici 6 na N-konci
hydrofobní valin v neoxygenované formě způsobuje
shlukování molekul hemoglobinu a deformaci krvinky
6
Bodová mutace může zásadně
ovlivnit fenotyp a funkci
7
Srpkovitá anémie – patofyziologie
molekuly hemoglobinu v mutantní formě se shlukují a deformují krvinku
z toho plynou rozmanité komplikace, včetně abnormální adherence
k endoteliálním buňkám cév, špatné zásobování tkání kyslíkem
8
Srpkovitá anémie – genetika
proč nebyla srpkovitá anémie eliminována selekčním tlakem?
k udržování mutantního genu v populaci přispívá selekční tlak proti
jinému faktoru
jedinci, kteří zdědí „zdravou“ alelu od jednoho rodiče a „srpkovitou“
od druhého mají jen jemnou formu anémie
následkem je vyšší míra odolnosti k původci malárie (plasmodium)
než u zdravých homozygotů
největší výskyt srpkovité anémie je v malarických oblastech
9
Struktura proteinů
proteiny jsou složené z 20 různých aminokyselin
tvoří 15 % nativní hmotnosti buněk
s výjimkou vody představují převládající složku živých organizmů
podílejí se na výstavbě a funkci jejich těl
10
Aminokyseliny
proteiny se skládají z polypeptidů, polypeptidy z aminokyselin
každý polypeptid je kódován genem a skládá se ze specifické
kombinace 50-1000 aminokyselin uspořádaných do dlouhých
řetězců, ve kterých jsou spojeny kovalentními vazbami
existuje 20 aminokyselin; všechny mají volnou aminoskupinu (NH2)
a volnou karboxylovou skupinu (COOH)
počet kombinací AK v různých polypeptidech je obrovský
(u peptidu se 7 AK existuje 207 kombinací)
aminokyseliny se od sebe odlišují postranními skupinami (R)
11
Postranní skupiny aminokyselin
zdroj jejich strukturní (a funkční) diverzity
4 typy:
hydrofóbní (nepolární)
hydrofilní (polární)
kyselé (negativně nabité)
bazické (pozitivně nabité)
12
13
Spojení aminokyselin:
peptidová vazba
aminokyseliny jsou v peptidech spojeny kovalentními peptidovými vazbami
peptidová vazba vzniká reakcí mezi aminoskupinou jedné AK
a karboxylovou skupinou druhé AK při současném uvolnění molekuly vody
(kondenzace)
14
Uspořádání proteinů v prostoru
4 úrovně organizace struktury proteinů:
primární struktura: určena sekvencí aminokyselin (kódována genem)
sekundární struktura: lokální prostorové uspořádání polypeptidového
řetězce - určeno prostorovými vztahy a vazbami několika po sobě
následujících aminokyselin v částech polypeptidu
terciární struktura: celkové složení polypeptidu v trojrozměrném prostoru
kvartérní struktura: vyplývá ze spojení dvou nebo více polypeptidů
ve vícepodjednotkovém proteinu
15
Uspořádání proteinů v prostoru
16
Nejběžnější typy
sekundární struktury proteinů
alfa-šroubovice a beta-struktura
obě jsou stabilizovány vodíkovými vazbami
alfa-šroubovice: řetězec AK se skládá do
tvaru válce, ve kterém se vodíkové vazby
tvoří mezi atomy podílejícími se na
peptidových vazbách, vzdálenými 3-4 AK
17
Nejběžnější typy sekundární
struktury proteinů: beta-struktura
beta-struktura
důsledek interakce mezi aminokyselinami
v rovnoběžně uspořádaných peptidech
spojení vodíkovými vazbami mezi skupinami
CO a NH
vzniká „skládaný list“, kdy zbytky R vyčnívají
kolmo k rovině listu
18
Terciární struktura proteinů
celkové složení polypeptidu (konformace)
hydrofilní AK: obvykle na povrchu proteinů
hydrofobní AK: interagují vzájemně ve vnitřních oblastech proteinu
terciární strukturu stabilizují hlavně nekovalentní vazby:
- iontové
- vodíkové
- hydrofobní interakce
- Van der Waalsovy síly
jediný typ kovalentní vazby
- disulfidické můstky
19
Nekovalentní vazby
iontové vazby: mezi skupinami s opačným nábojem
vodíkové vazby: mezi elektronegativními atomy (které mají částečný
negativní náboj) a atomy vodíku
hydrofobní interakce: mezi nepolárními skupinami
Van der Waalsovy interakce: nastávají mezi atomy, které jsou v těsné
vzájemné blízkosti (slabé, 1/1000 síly vazby kovalentní), důležité pro
udržování konformací makromolekul
20
Kvartérní struktura proteinů
týká se jen proteinů složených z více než jednoho polypeptidu
(např. hemoglobin)
21
Take home message
většina genů realizuje svou funkci (vliv na fenotyp)
prostřednictvím proteinů
proteiny jsou makromolekuly složené z polypeptidů
každý polypeptid je polymer složený z různých aminokyselin
aminokyselinová sekvence každého polypeptidu je určena
nukleotidovou sekvencí genu
funkční diverzita proteinů je z velké míry důsledkem složitých
trojrozměrných struktur, které proteiny zaujímají
22
Principy translace
překlad genetické informace z mRNA do sekvence aminokyselin pomocí
genetického kódu
do procesu je zapojeno:
- více než 50 proteinů
- mRNA
- 3 až 5 typů rRNA v ribozomech
- 20 enzymů pro aktivaci aminokyselin (aminoacyl-tRNA syntetázy)
- 40 až 60 různých tRNA
- řada rozpustných proteinů
translační systém představuje dominantní část metabolického aparátu
každé buňky
23
Celkový přehled proteosyntézy
24
Genetický kód
systém, podle kterého se určuje specifita AK řazené
do polypeptidového řetězce podle nukleotidové sekvence mRNA
každá AK je určena kodónem v mRNA
každý kodón obsahuje tři nukleotidy (triplety)
ze 64 možných tripletů: 61 určuje aminokyseliny + 3 terminaci
translace
kodóny v mRNA jsou rozeznávány (a dočasně vázány na základě
párování bází) komplementárními sekvencemi (antikodóny) v tRNA,
které nesou specifické aminokyseliny
25
Ribozomy
místa syntézy proteinů
nespecifické (dokážou syntetizovat jakýkoliv peptid kódovaný mRNA
pocházející i z jiných buněk či organizmů)
molekula mRNA může být současně překládána několika ribozomy:
tvorba polyribozomů (polyzomů)
v buňce E. coli je cca 200 000 ribozomů (tj. 25% suché hmotnosti
buňky)
všechny molekuly zapojené do proteosyntézy dohromady tvoří 1/3
suché hmotnosti buněk, vysoká energetická náročnost
26
Ribozom
komplex proteinů a RNA poměru přibližně 1:1
složen ze dvou podjednotek: velké a malé
každá podjednotka obsahuje velkou složenou molekulu RNA,
na které se sestavují ribozomové proteiny
velikosti ribozomů se často vyjadřují podle rychlosti sedimentace
(Svedbergovy jednotky "S")
27
Ribozomy prokaryot a eukaryot
Prokaryota:
velikost 70S (20 x 25 nm)
malá podjednotka 30S: rRNA 16S + 21 proteinů
velká podjednotka 50S: rRNA 5S a 23S + 31 proteinů
Eukaryota:
obvyklá velikost 80S (určitá mezidruhová variabilita)
v mitochondriích a chloroplastech 60S
malá podjednotka 40S: rRNA 18S + 33 proteinů
velká podjednotka 60S: rRNA 5S, 13S, 28S + 49 proteinů
28
Sestavování ribozomů
rRNA vznikají transkripcí DNA
u eukaryot rRNA vzniká v jadérku
transkripcí RNA-polymerázou I
29
uspořádány za sebou v mnoha kopiích a odděleny mezigenovými
oblastmi (mezerníky)
transkripce těchto genů je velmi účinná
Geny pro rRNA
30
transkripcí genů pro rRNA obvykle vznikají delší prekurzory,
které se posttranskripčními úpravami modifikují do konečné podoby
Transkripce genů pro rRNA
E. coli Savci
31
malé RNA (4S, 70-95 nukleotidů)
fungují jako adaptéry mezi aminokyselinami
a kodóny v mRNA
obsahují antikodón - sekvenci tří nukleotidů
komplementárních ke kodónu mRNA
k 3’-konci tRNA je kovalentně připojena určitá
aminokyselina
v tRNA se často objevují modifikované nukleotidy
(vznikají posttranskripčními úpravami, napomáhají správnému
skládání a interakcím tRNA)
Transferové RNA (tRNA)
32
vysoká specifita: enzymatické zajištění
20 aminoacyl-tRNA syntetáz (pro každou z 20 AK)
vazba se tvoří mezi karboxylovou skupinou AK a 3´-OH koncem tRNA
vazba AK (tj. aktivace, nabití tRNA) probíhá ve dvou krocích,
katalyzovaných aminoacyl-tRNA syntetázou:
1. aktivace AK energií z ATP:
AK + ATP —› AK-AMP + P-P
2. reakce s tRNA:
AK-AMP + tRNA —› AK-tRNA + AMP
aminoacyl-tRNA jsou vlastními substráty proteosyntézy na ribozomech
(zajišťují správnou kombinaci AK a kodónu, přístupnost antikodónu pro
reakci s kodónem, prezentují AK v takové prostorové konformaci, která
umožňuje tvorbu peptidových vazeb)
Vazba mezi aminokyselinou a tRNA
33
Struktura tRNA
ovlivněna vodíkovými vazbami mezi komplementárními nukleotidy uvnitř
téže molekuly
antikodón se nachází uvnitř nespárované smyčky ve střední části molekuly
34
Specifita tRNA
musí mít správnou sekvenci antikodónu
(aby reagovala na správný kodón)
musí být rozeznána správnými aminoacyl-tRNA syntetázami
(aby nesla správnou AK)
musí se vázat na správné místo v ribozomu
(aby mohla realizovat svou adaptérovou funkci)
35
Vazba tRNA k ribozomům
na každém ribozomu jsou tři
vazebná místa:
A (aminoacylové): váže
aminoacyl-tRNA
P (peptidylové): váže tRNA,
ke které je připojen rostoucí
peptid
E (místo exitu): váže tRNA
zbavenou AK před opuštěním
ribozomu
36
Vazba tRNA k ribozomům
při pohybu ribozomu podél mRNA se ve vazebných místech objevují
nové kodóny, které určují specifitu tRNA
samotná vazebná místa na ribozomu (za nepřítomnosti mRNA) jsou
otevřená - mohou vázat jakoukoliv aminoacyl-tRNA
37
Tři fáze translace:
iniciace, elongace, terminace
Iniciace: všechny děje, které zajišťují sestavení ribozomu
a připojení iniciační tRNA na mRNA
Zapojené molekuly u prokaryot:
ribozom
iniciátorová tRNA
mRNA
tři rozpustné iniciační faktory: IF-1, IF-2, IF-3
jedna molekula GTP
38
Iniciace translace u prokaryot
Tvorba 2 komplexů:
malá podjednotka se váže na
mRNA + IF-3 (interakce
Shineovy-Dalgarnovy
sekvence s 16S rRNA)
iniciační metionyl-tRNAf
Met
+ IF-2: nese antikodón k
iniciačnímu kodónu AUG a
metionin, jehož aminoskupina
je blokována formylovou
skupinou
oba komplexy se spojují,
připojují se IF-1 a GTP:
vzniká 30S iniciační komplex
39
Iniciace translace u prokaryot
po uvolnění IF-3 se
k iniciačnímu
komplexu připojuje
velká podjednotka
vzniká ribozom 70S
s metionyl-tRNAf
Met
připojenou přímo do
místa P
štěpí se GTP a
uvolňují IF
40
Elongace translace u prokaryot
Elongace zahrnuje všechny reakce od dokončení první peptidové vazby
po přidání poslední aminokyseliny; ribozom se pohybuje po mRNA a
každý kodón využije k translaci
41
Terminace translace u prokaryot
Terminace zajišťuje rozeznání terminačního kodónu ribozomem
a uvolňovacím faktorem, odštěpení dokončeného polypeptidu
od poslední peptidyl-tRNA a disociaci ribozomu z mRNA
42
Shineova-Dalgarnova sekvence
vazebné místo pro ribozomy na prokaryotické mRNA, definuje začátek
translace
umístěna 7 nukleotidů proti směru translace od iniciačního kodonu AUG
je komplementární sekvenci 3´-konce 16S rRNA
párování bází mezi SD sekvencí a 16S rRNA je podmínkou translace u
prokaryot
John Shine (*1946)
Lynn Dalgarno (*1935)
43
Translace je častým terčem antibiotik
44
Iniciace translace u eukaryot
složitější než u prokaryot
zapojeno několik rozpustných iniciačních faktorů
začíná neformylovaným iniciačním metioninem
iniciační aminoacyl-tRNA (tRNAiMet) je jiná než tRNA
používaná pro vnitřní metioninové kodóny
iniciační komplex se tvoří na 5’-konci mRNA modifikované
čepičkou (ne v oblasti Shine-Dalgarno/AUG)
http://www.youtube.com/watch?v=5bLEDd-PSTQ;
45
Iniciace translace u eukaryot
protein CBP (cap-binding protein) se váže na čepičku na 5´-konci mRNA
po dokončení syntézy a sestřihu mRNA se CBP podílí na translokaci do
cytoplazmy
Iniciace translace u eukaryot:
skenovací model
zde je CBP nahrazen iniciačními faktory
vazba malé podjednotky 40S ribozomu
s metionyl-tRNAi
Met k 5´konci mRNA s čepičkou
komplex se pohybuje ve směru 5´- 3´po mRNA
a hledá iniciační kodón AUG
v místě AUG: iniciační faktory se odpoutají,
připojuje se velká podjednotka 60S
metionyl-tRNAi
Met je připojena přímo do místa P
vzniká iniciační komplex
navržen Marilyn Kozakovou
47
Elongace translace
postupné připojování aminokyselin k rostoucímu polypeptidu
probíhá obdobně jako u prokaryot
Sled událostí:
vazba aminoacyl-tRNA do místa A ribozomu
přenos syntetizovaného peptidu z tRNA v místě P na tRNA v místě A
vytvořením nové peptidové vazby
posun ribozomu po mRNA, vedoucí k umístění dalšího kodónu do místa A
současný posun tRNA nesoucí vznikající polypeptid z místa A do místa P
přesun "prázdné" tRNA z místa P do místa E
48
aminoacyl-tRNA se váže k místu A
antikodón aminoacyl-tRNA se musí párovat s kodónem mRNA v místě A
nutná přítomnost
elongačního faktoru EF-Tu
a GTP
po hydrolýze GTP na
GDP se EF-Tu uvolňuje
Elongace translace
49
Elongace translace
tvorba peptidové vazby mezi
NH2-skupinou aminoacyltRNA
v místě A a COOH
skupinou rostoucího
polypeptidového řetězce
připojeného k tRNA v místě P
řetězec se tím připojí k
tRNA v místě A
katalyzováno
peptidyltransferázovou
aktivitou velké podjednotky
(současná hydrolýza GTP)
50
Elongace translace
Ribozom se po mRNA posune o jeden
kodón směrem k 3´-konci:
- peptidyl-tRNA se přesunuje z místa A
do místa P
- prázdná tRNA se přesunuje z místa P do
místa E
nutná přítomnost EF-G a
energie hydrolýzy GTP
místo A je prázdné a
připraveno pro příjem další
aminoacyl-tRNA
51
Elongace translace
52
Terminace translace
nastává v okamžiku, kdy do místa A vstoupí terminační kodón
(stop kodón): UAA, UAG nebo UGA
zároveň se do místa A váže uvolňovací faktor
ke karboxylovému konci vzniklého polypeptidu se naváže molekula
vody, což vede k terminaci
53
Terminace translace
stop kodóny jsou rozeznány
uvolňovacími faktory (RF)
k terminačnímu kodonu v místě A
se váže RF
RF mění aktivitu peptidyltransferázy:
přidává molekulu vody k C-konci
uvolnění polypeptidu z tRNA v místě
P, translokace prázdné tRNA do místa E
uvolnění mRNA z ribozomu
disociace podjednotek ribozomu
54
Take home message
genetická informace uložená v sekvencích nukleotidů mRNA se
překládá do sekvencí aminokyselin v polypeptidech pomocí ribozomů
a složitého aparátu
translační proces je složitý a vyžaduje účast mnoha různých RNA a
proteinů
tRNA slouží jako adaptéry zprostředkující interakce mezi
aminokyselinami a kodóny v mRNA
translace probíhá ve fázích iniciace, elongace, terminace podle
genetického kódu
55
Genetický kód
určuje typ aminokyseliny, iniciaci a terminaci translace
tripletový nepřekrývající charakter
56
Vlastnosti genetického kódu
složen z tripletů nukleotidů
triplety se nepřekrývají
neobsahuje interpunkční znaménka
je degenerovaný
obsahuje kodóny pro začátek a konec translace
je téměř univerzální
57
1966:
Rozluštění genetického kódu
H.G. Khorana R. Holley M. Nirenberg
Pomocí bezbuněčného systému odvozeného z E. coli prováděli translaci
s využitím přirozených a syntetických mRNA o definovaných sekvencích
a následně určili sekvence vytvořených peptidů
Nobelova cena za fyziologii a medicínu 1968
58
Genetický kód je tripletový
Inzerce/delece jednoho/dvou páru bází mění čtecí rámec
59
Genetický kód je tripletový
Supresorová mutace obnovuje původní čtecí rámec
60
Genetický kód je tripletový
Inserce/delece 3 párů bází čtecí rámec nemění
61
Supresorové mutace
některé mutace v genech pro tRNA mění strukturu antikodónů
a proto vedou k chybné interpretaci kodónů v mRNA
tyto mutace byly původně nalezeny jako supresorové mutace,
které potlačovaly účinek jiných mutací
příklad: mutace tRNA, které suprimují mutace amber způsobující
terminaci řetězce v UAG
62
Mutace amber (UAG) –
předčasná terminace translace
63
Translace mutace amber za
nepřítomnosti supresorové tRNA
64
Translace mutace amber za
přítomnosti supresorové tRNA
některé supresorové mutace mění antikodóny tRNA tak, že mutantní
tRNA reagují na terminační kodóny
tím se do polypeptidů začleňují aminokyseliny (na místo terminace
translace)
65
66
Genetický kód
Iniciační a terminační kodony:
- iniciační: AUG
- terminační: UAA, UAG, UGA
téměř univerzální (výjimky: mitochondrie a někteří prvoci)
67
Take home message
každá z 20 aminokyselin v proteinech je určena jedním
nebo několika nukleotidovými triplety v mRNA
z 64 možných tripletů vytvořených ze 4 bází v mRNA,
61 určuje aminokyseliny a 3 signalizují terminaci řetězce
kód je nepřekrývající (každý nukleotid patří k jedinému
kodónu), degenerovaný (většina AK je určena 2-4
kodóny)
kód je téměř univerzální; s minimálními výjimkami má 64
tripletů stejný význam u všech organizmů
68