Mutace a opravy DNA Jan Šmarda Ústav experimentální biologie, PřF MU Přednáška kurzu Bi4010 Základy molekulární biologie, 2018/19 Mutace: zdroj genetické variability dědičné změny v genetickém materiálu: - změny struktury nebo počtu chromozomů - změny na úrovni jednotlivých genů (záměny párů bází, inzerce, delece) nezaměňovat se změnami genotypu (a tím i fenotypu), které jsou výsledkem nových kombinací již existujících genetických variant (rekombinace) základ evoluce 2 Výskyt a rozdělení mutací u jednobuněčných organizmů se každá mutace duplikuje při replikaci a předává se do další buněčné generace u mnohobuněčných se mutace předávají potomstvu jen pokud se objeví v genomu buněk zárodečné linie mutace v DNA somatických buněk se objeví jen v jejich potomstvu Klasifikace mutací: gametické: pouze u buněk zárodečné linie, mohou způsobit dědičné choroby somatické: pouze u buněk somatických 3 Diploidní stav chrání před škodlivými účinky mutací u diploidních organizmů má každý gen 2 kopie při poškození jedné z nich, může druhá poskytnout správnou informaci zabránění defektu (pokud mutace není dominantní) odhad: každý člověk nese tolik škodlivých mutací, které by v haploidní konfiguraci znamenaly osminásobnou letalitu díky hromadění mutací během staletí jsou dnešní lidé geneticky poněkud odlišní od svých předků 4 Co ovlivňují mutace? strukturu genů (a tím jejich produktů) nebo regulačních oblastí v DNA strukturu chromozomů (chromozomové aberace: duplikace, delece, inverze, translokace) strukturu genomu: aneuploidie – změna počtu určitých chromozomů euploidie – změna počtu chromozomých sad 5 Typy mutací bodová: týká se jedné báze nulová: zcela inaktivuje gen těsná („tight“): jasný fenotypový projev (např. úplná ztráta schopnosti růstu za určitých podmínek nebo znemožnění tvorby produktu dané biochemické dráhy) netěsná („leaky“): částečná aktivita genového produktu zachována (např. zbytková aktivita enzymu umožní alespoň pomalý růst za určitých podmínek) 6 Typy mutací substituce: báze nahrazena jinou inverze: úsek DNA převrácen, zůstává ve stejném místě duplikace: úsek DNA duplikován, druhá kopie obvykle zůstává v sousedství původní delece: z DNA odstraněna jedna nebo více bází inzerce: do DNA včleněna jedna nebo více bází translokace: úsek DNA přenesen z původního místa do jiného – buď stejné nebo jiné molekuly DNA 7 Substituce bází tranzice: pyrimidin nahrazen jiným pyrimidinem (T za C a naopak) nebo purin nahrazen jiným purinem (A za G a naopak) transverze: pyrimidin nahrazen purinem nebo naopak 8 Jsou mutace užitečné nebo škodlivé? jak které.... většinou škodlivé s negativním vlivem na funkci genového produktu poškozeným genovým produktem nemusí být vždy protein, ale také RNA (tRNA, rRNA, atd.) mutace mohou poškodit také nekódující, ale důležité signální sekvence většina mutací nemá významný vliv na přežití organismu – jsou neutrální vzácně má mutace pozitivní vliv na přežití a reprodukci organizmu hromadění těchto prospěšných mutací umožní organizmu vývoj v měnícím se prostředí 9 Závažnost mutací závisí na jejich typu a umístění 10 mutace měnící smysl kodonu („missense mutation“) jsou nejběžnější vedou k záměně jedné aminokyseliny v molekule proteinu za jinou pokud je mutací původní aminokyselina nahrazena chemicky příbuznou – obvykle bez vážných následků (konzervativní substituce) následky jsou vážné, pokud změní způsob složení proteinu nebo strukturu aktivního místa (radikální substituce) 11 Některé mutace jsou letální jen v určitých podmínkách např. teplotně senzitivní (ts) protein se skládá správně jen v nižší (permisivní) teplotě užitečné pro experimentování (letální mutace je obtížné studovat) Nesmyslné mutace mutace, kterými se kodóny kódující aminokyseliny mění na kodóny nesmyslné – terminační (UAA, UAG, UGA) způsobují předčasné ukončení syntézy polypeptidového řetězce zkrácený polypeptid se nemůže správně poskládat obvykle podléhá degradaci Inzerce včlenění úseku DNA do kódující sekvence obvykle způsobí její inaktivaci účinek závisí na rozsahu a umístění (kratší inzerce mohou umožnit alespoň částečnou aktivitu původního proteinu) Častá příčina inzercí: mobilní genetické elementy (transpozony) 14 Inzerce může aktivovat genovou expresi změna vazebného místa pro represor změna v promotoru – např. převedení genu pod kontrolu transpozonového promotoru 15 Mutace měnící čtecí rámec báze se čtou po třech jako kodóny zařazení nebo odstranění 1 nebo 2 bází zásadně mění genetickou informaci – vede k ztrátě funkce proteinu inserce nebo delece 3 bází čtecí rámec nemění – protein má o 1 AK více nebo méně, jeho funkce obvykle není zásadně změněna Inverze obrácení úseku DNA přeruší-li kódující sekvenci – ztráta funkce genu jsou-li koncové sekvence obráceného úseku v intergenových oblastech (inverze zahrnuje i promotor) – gen zůstává intaktní, i když bude přepisován v obrácené orientaci jeho funkce ztracena nebude 17 Translokace vyčlenění úseku DNA z původního místa a jeho inzerce do místa nového téhož nebo jiného chromozomu je-li kódující sekvence intaktní – funkce proteinu nemusí být ztracena začleněním části jednoho genu do genu jiného – ztráta nebo změna funkce 18 Duplikace zdvojení úseku DNA originál a kopie umístěny za sebou (tandemová duplikace) může generovat dvě kopie genů – následná divergence umožňuje vznik nových genů v průběhu evoluce násobné duplikace (amplifikace) mohou podstatně zvýšit počet kopií genu a tak i hladinu jejich produktů 19 Tiché mutace nemění fenotyp v nekódujících mezigenových oblastech v intronech (nesmí postihnout kritická místa pro sestřih) mutace neměnící kódující smysl kodónu (např. kyselinu glutamovou kódují 2 kodóny: GAA, GAG, pro alanin existují 4 kodóny: GCU, GCC, GCA, GCG) 20 Mutace spontánní a indukované spontánní: bez zjevné vnější příčiny – důsledek metabolických poruch v organismu, chyb při replikaci DNA nebo přítomnosti neznámé látky v prostředí indukované: působením známých fyzikálních, chemických nebo biologických faktorů – mutagenů 21 22 Bruce Ames (*1928) americký bakteriolog koncem 60. let v Berkeley studuje mutace u Salmonel pozoruje, že mutace v určitých genech znemožňují růst bakterií na Petriho misce pokud se v tomto kmeni odehraje další mutace, která schopnost růstu za těchto podmínek obnoví - vznikne na misce bakteriální kolonie čím více kolonií, tím větší mutagenní schopnost použité látky, možnost kvantifikace 23 Amesův test cytotoxicity látek 24 Mutagenicita = karcinogenicita Ames testuje tisíce chemikálií a vytváří katalog látek, zvyšujících frekvenci mutací učiněno důležité pozorování: látky označené jako mutageny mají tendenci být i karcinogeny dosud neměřitelné se stává měřitelným funguje i pro rentgenové záření, tabákový kouř Chemické mutageny ovlivňující strukturu DNA oxidační činidla (peroxidy, kyslíkové radikály) deaminující látky (dusitany) alkylační činidla (yperit) interkalační látky (akridiny) aromatické aminy (benzidin, naftylamin) poškozující buněčný aparát pro rovnoměrné rozdělování genetické informace při buněčném dělení kolchicin 25 Chemické mutageny látky vyvolávající mutace bez ohledu na to, zda probíhá replikace DNA (např. alkylační látky, kyselina dusitá) látky vyvolávající mutace pouze při replikaci DNA (analogy bází, akridinová barviva) 26 Mutagenní analogy bází strukturně podobné normálním bázím začleňují se do DNA při replikaci strukturní odlišnosti od normálních bází zvyšují četnost chybného párování a tím vznik mutací např. 5-bromuracil: analog tyminu – indukuje tranzice z AT na GC (jiné rozložení náboje – zvýšení četnosti tautomerního přesmyku do enolformy, která se páruje s guaninem) 27 Akridinová barviva např. proflavin, akridinová oranž jsou pozitivně nabité, včleňují se mezi báze DNA vyvolávají posunové mutace (změnu čtecího rámce) zpevňují a mění konformaci dvoušroubovice DNA při replikaci dochází k delecím nebo inzercím jednoho nebo více párů bází – často posunovým mutacím 28 Kyselina dusitá způsobuje oxidativní deaminaci aminoskupin u adeninu, guaninu a cytozinu: aminoskupiny se tím mění na ketoskupiny adenin se deaminací mění na hypoxantin, který se páruje s cytozinem Kyselina dusitá cytozin deaminuje na uracil, který se páruje s adeninem 30 Kyselina dusitá guanin se deaminuje na xantin, který se páruje s cytozinem (deaminace guaninu není mutagenní) 31 Hydroxylamin a alkylační látky Hydroxylamin specifický účinek: hydroxylace aminoskupiny cytozinu vzniklý hydroxylaminocytozin se páruje s adeninem (tranzice GC na AT) Etylmetansulfonát a yperit (hořčičný plyn) alkylační látky přenos metylové nebo etylové skupiny na báze DNA, což způsobuje změnu párování bází alkylací guaninu yperit způsobuje změny, které blokují replikaci a buněčné dělení (úvahy o využití v léčbě rakoviny) indukuje všechny typy mutací (tranzice, transverze, posunové mutace i chromozomové aberace) 32 Fyzikální mutageny ionizující záření (rentgenové, gama, kosmické): vyvolává zlomy DNA neionizující záření (UV): specifická absorbce při vlnové délce 260 – 280 nm, tvorba dimerů tyminu stupeň poškození DNA odpovídá dávce absorbovaného záření 33 Mutace indukované ionizujícím zářením kratší vlnové délky a větší energie než u světla viditelného proniká hluboko do tkání, naráží do atomů, uvolňuje elektrony, vznikají pozitivně nabité radikály a ionty, které vyvolávají vznik dalších iontů (proces ionizace) 34 UV záření nižší energie než u ionizujícího záření proniká jen do svrchních vrstev, silný mutagen u jednobuněčných organismů nezpůsobuje ionizace energie záření je zachycena atomy, jejichž elektrony přecházejí do excitovaného stavu – zvýšení reaktivity atomů a molekul v DNA tím dochází k vzniku mutací největší mutagenní účinky při 254 nm (maximum absorpce bází při této vlnové délce) 35 UV záření a pyrimidiny po pohlcení UV se stávají pyrimidiny velmi reaktivními a mění se na pyrimidinové hydráty a dimery tyminové dimery porušují strukturu DNA a narušují replikaci 36 Biologické mutageny viry mobilní genetické elementy 37 Mutace indukované mobilními elementy transpozony: oblasti DNA, které se mohou v genomu přemísťovat inzerce transpozonu může gen inaktivovat (mutagenní účinek) Mechanismy oprav DNA enzymy vyhledávají poškození DNA a aktivují opravu rozšířené od bakterií po člověka oprava chybného párování („mismatch repair“) excizní oprava oprava závislá na světle (fotoreaktivace) – jen u bakterií postreplikační oprava oprava náchylná k chybám („error-prone“) 39 40 Frekvence chyb Oprava chybného párování 41 „mismatch repair“ – oprava chybného párování opravné mechanismy opraví 99% chybně spárovaných bází opravné proteiny chybné páry naleznou, navážou se na ně, zajistí odstranění nespárované oblasti a resyntézu Excizní oprava probíhá ve třech krocích: DNA-endonukleáza rozezná poškozenou bázi v DNA, naváže se na ni a vyštěpí ji DNA-polymeráza zaplní mezeru s využitím nepoškozeného komplementárního vlákna jako matrice DNA-ligáza spojí zlomy ponechané DNA-polymerázou 42 Excizní oprava existuje ve dvou variantách: bázová excizní oprava odstraňuje abnormální nebo chemicky modifikované báze z DNA nukleotidová excizní oprava odstraňuje rozsáhlejší defekty v DNA obě varianty fungují ve tmě a jsou k dispozici u většiny organismů 43 Bázová excizní oprava DNA-glykozyláza rozeznává abnormální báze v DNA a štěpí glykozidickou vazbu mezi poškozenou bází a deoxyribózou tím vznikají apurinová nebo apyrimidinová místa (AP-místa) AP-endonukleázy rozeznají AP-místa, která společně s fosfodiesterázami štěpí – dojde k přerušení cukr-fosfátové kostry DNA-polymeráza nahradí chybějící nukleotid podle komplementárního řetězce DNA-ligáza obnoví cukr-fosfátovou kostru 44 Nukleotidová excizní oprava specifická endonukleáza (tzv. excinukleáza) vytvoří zářezy z obou stran úseku poškozených nukleotidů vyštěpení oligonukleotidového fragmentu obsahujícího poškozené báze mezera je odstraněna DNA-polymerázou a DNA-ligázou 45 Poškození DNA ultrafialovým zářením v důsledku kovalentních křížových vazeb mezi sousedními tyminy vznikají v DNA po UV záření tyminové dimery 46 Fotoreaktivace oprava závislá na světle odstraňuje tyminové dimery zajištěna enzymem DNA-fotolyázou, který je aktivován viditelným světlem DNA-fotolyáza dimery rozpoznává, naváže se na ně a rozštěpí kovalentní křížové vazby s využitím světelné energie vazba na dimery nastává i ve tmě, štěpení jen po aktivaci světelnou energií Na opravách DNA závisí stabilita genů opravné mechanismy vycházejí z existence dvou kopií genetické informace v dvoušroubovici DNA poškozený řetězec je opraven podle nepoškozeného poškozený řetězec je identifikován podle atypických struktur DNA mutace v genech kódujících reparační proteiny zvyšují frekvenci mutací, často vedou k predispozici k rakovině 48 Dědičné choroby způsobené poruchami opravy DNA xeroderma pigmentosum – extrémní citlivost k slunečnímu záření, vznik nádorů kůže důsledek poruchy v opravě DNA po UV záření (tyminových dimerů) mutace v genech kódujících proteiny zapojené do nukleotidové excizní opravy často je postižena excinukleázová aktivita 49 Dědičné choroby způsobené poruchami opravy DNA Cocaynův syndrom – opožděný růst, poruchy mentálních schopností trichothiodystrofie – krátké končetiny, lomivé vlasy, šupinatá pokožka, psychomotorická retardace důsledek poruch v nukleotidové excizní opravě 50 Dědičné choroby způsobené poruchami opravy DNA Ataxia-telangiectasia Fanconiho anémie Bloomův syndrom Wernerův syndrom vysoká citlivost k ionizujícímu záření chyby v opravách DNA vysoká četnost chromozomových aberací vysoké riziko malignit 51 Mezidruhová příbuznost DNA 52 díky opravným mechanismům se změny ve struktuře DNA v průběhu evoluce hromadí pomalu mezi člověkem a šimpanzem je asi 5 milionů let divergence, ale jejich nukleotidové sekvence v DNA jsou z 96% identické díky přesnosti procesů replikace a reparace došlo během 100 milionů let jen k minimálním změnám genetické informace Rekombinace DNA výměna úseků molekul DNA mezi chromozomy nastává často během meiozy při pohlavním rozmnožování – výměny částí homologních chromozomů zvětšení genetické diversity u potomstva – evoluční výhoda existuje i v prokaryotických buňkách (po přenosu cizorodé DNA transformací, transdukcí nebo konjugací) 53 Rekombinace homologní a nehomologní homologní výměna genetického materiálu mezi chromozomy, které jsou natolik podobné, že mezi nimi může dojít k párování bází běžná mezi dvěma kopiemi téhož chromozomu (v meioze) a při opravách zlomů v DNA nehomologní nevyžaduje sekvenční homologii Molekulární základ homologní rekombinace vzájemné rozeznání homologních úseků dvouřetězcových DNA přerušení jednoho řetězce každé dvoušroubovice výměna řetězců znovuspojení za vzniku Hollidayovy struktury reakce zprostředkovány rekombinačními enzymy 55 Dokončení rekombinace Hollidayova struktura může izomerizovat oddělení rekombinantních molekul rezolvázou Místně specifická rekombinace mezi nehomologními sekvencemi mechanismus, kterým se přesouvají mobilní genetické elementy řízená enzymy, které rozeznávají krátké sekvence na koncích mobilních elementů, nevyžadují rozsáhlejší homologie DNA 57 Transponovatelné genetické elementy sekvence DNA, které se mohou přemísťovat v genomu (náhodně) neexistují samostatně jako plazmidy nebo viry vymezeny koncovými sekvencemi významný zdroj genomové nestability 58 Transponovatelné elementy: celkový přehled výskyt v genomech mnoha druhů (bakterie, houby, rostliny, živočichové) často tvoří jejich významnou součást (4% u kvasinek, 70% u některých obojživelníků a rostlin) nesou gen kódující enzym pro vlastní transpozici ovlivňují strukturu chromozomů a genovou expresi strukturní a funkční odlišnosti: 3 třídy - transpozony „cut and paste“ - replikativní transpozony - retrotranspozony 59 Transponovatelné elementy „cut and paste“ 60 nereplikativní vyštěpení a přesun oba kroky řízeny enzymaticky v donorovém místě zůstává DNA přerušena, což může být letální pokud nedojde k opravě nutná transponáza Replikativní transpozony transpozice provázena replikací jedna kopie transpozonu zůstává v původním místě a jedna kopie se začleňuje do nového místa nutná transponáza a rezolváza vzácnější než „cut and paste“ 61 Retrotranspozony kódují zpětnou transkriptázu šíří se procesem retropozice, který je zprostředkován RNA intermediátem a má duplikativní charakter do genomu se začleňuje kopie transpozonu vytvořená zpětnou transkripcí při retropozici se střídá transkripce se zpětnou transkripcí na rozdíl od retrovirů se netvoří virové částice – pouze nitrobuněčný cyklus 62 Transponovatelné elementy u bakterií přemísťují se v rámci bakteriálního chromozomu nebo mezi chromozomem a plazmidem obklopeny přímými repeticemi v důsledku transpozice a obrácenými repeticemi (vymezujícími konec elementu) Hlavní typy: - IS-elementy - obsahují pouze geny pro transpozici - složené transpozony a Tn3-elementy - obsahují navíc geny, které kódují produkty nesouvisející s procesem transpozice 63 IS-elementy obvykle menší než 2,5 kb ohraničeny krátkými obrácenými koncovými repeticemi mutace v koncových repeticích eliminuje přemísťovací schopnost obsahují pouze geny pro zajištění a regulaci transpozice kódují transponázu: váže se ke koncům elementu, kde štěpí oba řetězce DNA – uvolnění elementu 64 IS-elementy v místě začlenění nastává duplikace části cílové DNA duplikované oblasti dlouhé 2-13 pb se nacházejí po obou stranách elementu a mají charakter přímých repetic - důsledek doplnění ssDNA na dsDNA mohou ovlivnit expresi genu, do kterého se začlení 65 66 Složené transpozony (Tn) obdobné koncové struktury nesou rezistenční markery Transpozon Tn3 obsahuje geny, které nejsou pro transpozici nezbytné na koncích jsou jednoduchá obrácená opakování v cílovém místě nastává duplikace Struktura: gen pro transponázu/rezolvázu a jejich represor gen pro beta-laktamázu (rezistence k Amp) 68 Význam bakteriálních transpozonů v lékařství často obsahují geny pro rezistenci k antibiotikům geny se mohou snadnou šířit a zvyšovat odolnost patogenních bakterií k antibiotikům komplikace léčby infekčních onemocnění šíření rezistence umožňuje nadužívání antibiotik, šíření rezistenčních genů transpozony a konjugací 69 Transpozony u eukaryot rozšířené elementy „cut and paste“ a retrotranspozony P-elementy u drozofily Ty elementy u kvasinek u člověka retrotranspozony LINE tvoří asi 15% genomu (většinou imobilní „fosilie“, které kvůli mutacím nejsou schopny transpozice) některé si pohyblivost udržují a mohou způsobit choroby 70 Sekvence Alu v genomu člověka retrotranspozony krátká sekvence (350 pb) 1 milion kopií, 11% lidského genomu řazeny do „junk“ DNA, ale zřejmě hrají roli v určitých buněčných pochodech (např. představují místo vazby kohesinových komplexů, které udržují replikované chromozomy u sebe před segregací) 71 Význam transponovatelných elementů pro organizaci genomu jeho podstatná součást zvyšují četnost mutací (u drozofily se odhaduje, že vyvolávají až polovinu spontánních mutací) indukce chromozomových přestaveb vyvolaná rekombinací mezi transpozony 72 Význam transponovatelných elementů pro evoluci přirozené nástroje genového inženýrství šíří se a tím mohou svým hostitelům poskytovat selekční výhodu jiné jsou genovými parazity 73