Regulace genové exprese
Přednáška kurzu Bi4010 Základy molekulární biologie, 2018/19
Jan Šmarda
Ústav experimentální biologie, PřF MU
Proč regulovat expresi genů?
produkty všech genů genomu nejsou v každém okamžiku života
buňky nezbytné
proměnlivost prostředí
proměnlivost buňky během buněčného cyklu
energetická náročnost procesu genové exprese
2
Konstitutivní genová exprese
stabilní (průběžná) exprese genů, které kódují složky buněk nutné pro
udržování základních - provozních - funkcí ("housekeeping functions")
provozní geny kódují např. rRNA, tRNA, ribozomové proteiny,
RNA-polymerázy, strukturní proteiny, proteiny zapojené do sestřihu
a proteosyntézy, atd.
konstitutivní geny se exprimují ve většině buněk
3
Inducibilní a represibilní
genová exprese
se zvyšuje nebo snižuje podle potřeby
týká se (inducibilních/represibilních) genů, jejichž produkty
jsou potřebné pouze za určitých podmínek
syntéza těchto genů je pod kontrolou speciálních regulačních
systémů
konstitutivní exprese těchto genů by znamenala zbytečnou
energetickou zátěž buňky (evoluční výhoda)
4
Pozitivní a negativní
regulace genové exprese
pozitivní: gen se exprimuje jen za přítomnosti aktivátoru, obvykle
transkripčního faktoru, který napomáhá RNA-polymeráze ve vazbě na
promotor – aktivita aktivátoru závisí na přijetí signálu
negativní: gen se exprimuje jen za nepřítomnosti represoru – pokud je
represor přítomen, váže se na operátor a znemožní expresi daného
genu - uvolnění represoru závisí na přijetí signálu
pozitivní i negativní regulace je tak závislá na malé molekule –
induktoru, který se váže k regulačnímu proteinu
signálů ovlivňujících expresi určitého genu může být větší počet
5
Pozitivní a negativní regulace
genové exprese
pozitivní: signál mění konformaci
inaktivního regulátoru do aktivního stavu,
který tak získá schopnost vazby do
regulační oblasti genu, což usnadní funkci
RNA-polymeráze
negativní: regulátor blokuje promotor
dokud nedojde vazbou signálu ke změně
jeho konformace – čímž se uvolní z DNA
a usnadní tak funkci RNA-polymeráze
aktivátory: proteiny, které posilují expresi
z určitých promotorů
represory: proteiny, které tlumí expresi
z určitých promotorů 6
Ekonomičnost
versus rychlost
z hlediska ekonomičnosti je výhodná
regulace na úrovni transkripce
z hlediska zajištění rychlosti je
výhodné zajistit produkci proteinu
v inaktivní formě a možnosti jeho
rychlého převedení do aktivního stavu
Regulační úrovně
heterochromatizace/euchromatizace
transkripce vedoucí ke vzniku primárního transkriptu
úpravy primárního transkriptu vedoucí ke vzniku zralé mRNA
stabilita mRNA, její náchylnost/odolnost k degradaci
translace mRNA vedoucí k vzniku polypeptidových řetězců
úpravy a sestavování polypeptidových řetězců
regulace aktivity proteinu
regulace degradace proteinu
regulace translokace proteinu
Typy
heterochromatinu
konstitutivní
vždy kondenzovaný
lokalizace v blízkosti centromery
a na koncích chromozomu
nepřístupný genové expresi
fakultativní
převoditelý na euchromatin
modifikacemi histonů (acetylace, fosforylace, ADP-ribozylace,
ubikvitinace) a tím zpřístupněn genové expresi
hranici mezi heterochromatinem a euchromatinem může ovlivnit
např. chromozomová translokace
9
Regulace u jednobuněčných a
mnohobuněčných organismů
u jednobuněčných: reakce na změny okolí (teplota, osmotický tlak,
dostupnost živin, atd.)
u mnohobuněčných: reakce na změny okolí + komunikace mezi
buňkami téhož organismu + vývojové procesy v rámci organismu
10
Regulační mechanismy
u prokaryot
řídí genovou expresi v reakci na změny okolí
poskytují metabolismu plasticitu: dosažení maximálního růstu
a reprodukce za nejrůznějších podmínek
předprogramované okruhy nebo kaskády genové exprese
podnět ovlivní expresi určitého genu, jehož produkt ovlivní expresi
sady dalších genů, jejich produkty zase další, atd.
11
Trans- a cis-regulační
elementy
trans-aktivační molekuly (obvykle proteiny)
jsou schopny opustit místo své syntézy a volně se pohybovat,
aby si našly svou cílovou molekulu
cis-aktivační elementy (obvykle sekvence DNA)
fungují výlučně jako sekvence, které neopouštějí molekulu,
jejíž jsou součástí (např. promotory, terminátory)
genová exprese je řízena specifickými interakcemi
trans-aktivačních molekul s cis-aktivačními sekvencemi
12
Regulátorové a strukturní
geny
strukturní gen kóduje jakýkoliv protein bez regulační funkce
regulátorový gen kóduje takový protein (nebo RNA),
který se zapojuje do procesu regulace genové exprese
13
Regulátorový protein může genovou
expresi zapnout nebo vypnout
Regulace transkripce u prokaryot:
alternativní sigma faktory
sigma faktor umožňuje RNA-polymeráze specifickou vazbu na promotor
několik skupin genů má promotory bez typických sekvencí -35 a -10:
rozeznávány alternativními sigma faktory
každý alternativní sigma faktor zajišťuje expresi celých skupin genů
(50 a více), jejichž produkty jsou zapotřebí za určitých podmínek
(např. stacionární fáze růstu, nedostatek dusíku, atd.)
14
Alternativní sigma faktory
se uplatňují při sporulaci
spóry se tvoří asymetrickým
dělením mateřské buňky za
nepříznivých podmínek
primitivní forma diferenciace
prokaryotických buněk
tvorba spór je řízena čtyřmi
alternativními sigma faktory
mezi geny rozeznávanými
jedním sigma faktorem jsou i geny
kódující jiné sigma faktory
15
Anti-sigma faktory
proteiny, které vážou sigma
faktory a tím je inhibují: ztratí
schopnost vazby na
RNA- polymerázu
anti-anti sigma faktory se
podílejí na regulační kaskádě
Negativní kontrola
v blízkosti promotoru je další
„cis-element“ - operátor
operátor je místo vazby pro
represor
vazba represoru na operátor
brání RNA-polymeráze
iniciovat transkripci
exprese genu vypnuta
běžné u bakterií
Pozitivní kontrola
pro iniciaci transkripce je nutný
transkripční faktor, který asistuje
RNA-polymeráze
bez pozitivního signálu je gen
inaktivní, RNA-polymeráza
nemůže iniciovat transkripci
běžná u bakterií i eukaryot
1818
Regulace změnou
koncentrace substrátu
bakterie reagují rychle na změny svého okolí
změny v dostupnosti klíčových živin mohou nastat kdykoliv,
rychlé přepnutí metabolismu je podmínkou přežití
produkce nepotřebného enzymu je zbytečná zátěž
bakterie netvoří enzymy pro zpracování substrátu, pokud tento
není k dispozici, ale jsou připraveny jejich produkci nastartovat,
pokud se substrát objeví
19
Využití různých zdrojů
energie u bakterií
využitelné jsou různé cukry, E. coli preferuje glukózu
za přítomnosti laktózy a nepřítomnosti glukózy buňky E. coli:
zahájí syntézu dvou enzymů: β-galaktozidázy a β-galaktozidpermeázy
β-galaktozidpermeáza zajistí transport laktózy do buňky
β-galaktozidáza laktózu štěpí na glukózu a galaktózu
za nepřítomnosti laktózy v okolí, buňky E. coli tyto enzymy nesyntetizují
20
Indukce genů
pro využití laktózy
exprese obou genů je za nepřítomnosti
glukózy a přítomnosti laktózy indukována
rychle
proces zapnutí genové exprese látkou
dodanou do prostředí, ve kterém buňka roste,
se nazývá indukce
geny, jejichž exprese je takto regulována, se
nazývají inducibilní
indukce nastává na úrovni transkripce a mění
počet molekul příslušných proteinů (nikoliv
aktivitu proteinů již existujících)
typickými inducibilními enzymy jsou enzymy
zapojené do katabolických (rozkladných)
drah
21
Operón
u prokaryot jsou geny s příbuznou funkcí často umístěny za sebou
a jsou regulovány společně – tvoří operóny
operón: soubor genů, které jsou společně přepisovány do jediné
molekuly mRNA (polycistronové mRNA) a podléhají kontrole
jediným regulátorem
geny v operónu spolu funkčně souvisejí: např. kódují enzymy,
které se účastní stejné biochemické dráhy
u eukaryot se každý gen přepisuje samostatně
22
Transkripce operónu:
polycistronová mRNA
23
Operóny - historie
objevitelé operónu: Francois Jacob a Jacques Monod (1961)
Nobelova cena za medicínu v roce 1965 (s André Lwoffem)
24
Laktózový (lac) operón
tři strukturní geny: lacZ, lacY a lacA + regulační oblast proti směru
transkripce
lacZ kóduje ß-galaktozidázu
(rozklad laktózy)
lacY kóduje ß-galaktozidpermeázu
(membránový protein, zajišťující
transport laktózy do buňky)
lacA kóduje ß-galaktozidacetylázu
(přenos acetylové skupiny z
acetylkoenzymu A na laktózu)
lacI kóduje represor lac operónu
(přepisuje se v opačném směru)
25
Lac operón
ß-galaktozidáza je potřeba jen za přítomnosti laktózy a nedostatku
glukózy
v opačném případě je transkripce
lac operonu utlumena Lac represorem
když se objeví laktóza, postačuje
i malé množství rozkladných enzymů
k jejímu rozštěpení na glukózu
a galaktózu
glukóza a galaktóza se spojují za vzniku alolaktózy, která inaktivuje
Lac represor (induktor lac operónu)
26
Operátor:
vazebné místo pro represor
vazebné místo pro represor LacI v promotoru lac operónu
za nepřítomnosti induktoru se LacI váže na operátor a blokuje vazbu
RNA-polymerázy na promotor
za přítomnosti laktózy (vlastním induktorem je izomer laktózy –
alolaktóza) dojde k uvolnění represoru (změna konformace, ztráta
schopnosti vazby na DNA)
27
28
Katabolická represe
jiný mechanismus kontroly lac operónu, zprostředkován cAMP
a pozitivním regulačním proteinem CRP („cAMP-receptor protein“),
někdy rovněž zvaným CAP („catabolite-activator protein“)
cAMPse váže na CRP/CAP, čímž se mění jeho konformace do podoby
umožňující pevnou vazbu na DNA v místě promotoru a díky interakci
s RNA-polymerázou aktivuje transkripci lac operónu
glukóza je lepší zdroj energie než laktóza, proto za současné
přítomnosti laktózy a glukózy se inaktivuje adenylátcykláza
a snižuje se produkce cAMP
29
Katabolická represe
lac promotor obsahuje kromě operátoru také vazebné místo pro CAP/CRP
vazbou CAP/CRP na promotor se aktivuje transkripce lac operónu
glukóza brání indukci lac operónu inaktivací adenylátcyklázy: bez cAMP
se CRP/CAP inaktivuje, čímž se redukuje transkripce lac operónu
tím je zajištěno přednostní využití glukózy místo méně účinných
energetických zdrojů
30
Katabolická represe
CAP se na promotor váže pouze za přítomnosti cAMP
hladina cAMP je pod kontrolou glukózy (glukóza brání aktivaci
adenylátcyklázy, tj. enzymu, který katalyzuje tvorbu cAMP)
Za přítomnosti glukózy
adenylátcykláza je inaktivní
hladina cAMP je nízká
CAP/CRP se nemůže vázat na
lac operón
strukturní geny lac operónu se
neexprimují
Za nepřítomnosti glukózy
adenylátcykláza je aktivní
hladina cAMP je vysoká
CAP/cAMP se váže na lac
operón
strukturní geny lac operónu
se exprimují
31
Operón trp
je negativně regulován hladinou svého produktu, tj. aminokyseliny
tryptofanu (přidání trp do růstového média zastaví jeho biosyntézu)
tryptofan aktivuje represor trpR
represor trp se váže na několik operátorů
nejdůležitější je operátor trpEDCBA řídící tvorbu enzymů, kterými se
syntetizuje tryptofan
mechanismus represe je ve všech případech založen na zabránění
iniciace transkripce operónu
32
Operón trp
trp represor se syntetizuje
v inaktivní formě
při represi se uplatní tryptofan:
dvě molekuly tryptofanu se vážou
k dimeru trp represoru a změní
jeho konformaci do stavu, kdy je
schopen aktivní vazby na operátor
vazba represoru znemožní vazbu
RNA-polymerázy k promotoru a
iniciaci transkripce
33
Take home message
lac operón E. coli je regulační systém obsahující tři strukturní geny,
které se účinně přepisují pouze za přítomnosti laktózy a
nepřítomnosti glukózy
za nepřítomnosti laktózy se Lac represor váže na lac operátor a
brání RNA-polymeráze v iniciaci transkripce operónu
trp operón využívá represoru pro zastavení transkripce genů pro
biosyntézu tryptofanu
34
Dvousložkové regulační
systémy
regulaci aktivity enzymů nebo transkripčních faktorů často zajišťují
signální molekuly nebo chemické skupiny (fosfát, metyl, acetyl,
AMP, atd.)
dvousložkové systémy využívají připojení fosfátu:
- první složkou je regulační protein se schopností vazby k DNA
pouze ve fosforylovaném stavu
- druhou složkou je transmembránová kináza, která podle změn
okolí přechází do aktivního stavu, fosforyluje napřed sebe samu,
následně i regulační protein
35
Dvousložkový
systém
membránová složka: kináza závislá na podmínkách
vnějšího okolí
cytoplazmatická složka: regulační protein závislý na
fosforylaci
36
Regulace
transkripce u eukaryot
složitější než u prokaryot
vysoký počet genů, které jsou různě exprimovány v různých tkáních
chromatin
kompartmentalizace buňky (DNA v jádře, regulátory tvořené v
cytoplazmě)
37
Vlastnosti transkripčních
faktorů
cíleně ovlivňují expresi genů
reagují na specifické signály
jsou schopny přechodu z cytoplazmy do jádra
rozeznávají a vážou specifické sekvence DNA
zprostředkovávají kontakt s transkripčním aparátem
mají doménovou strukturu: jedna zajišťuje vazbu na DNA, druhá
interaguje s transkripčním aparátem (např. protein GAL4 kvasinek)
38
Dvouhybridní systém
metoda analýzy meziproteinových interakcí
využívá umělého spojení testovaných proteinů s oddělenými doménami
transkripčního aktivátoru GAL4
GAL4 má modulární strukturu:
doménu pro vazbu na DNA (DBD)
a aktivační doménu (AD)
interakce obou domén vede k aktivaci
transkripce reportérového genu
(kovalentní propojení domén není
nutné)
39
Dvouhybridní
systém - princip
Testování interakce proteinu 1 s proteinem 2
doména pro vazbu na DNA (DBD) transkripčního
faktoru GAL4 se spojí s proteinem 1
aktivační doména (AD) transkripčního faktoru
GAL4 se spojí s proteinem 2
oba fúzované geny se exprimují v kvasinkových
buňkách obsahujících příslušný reportérský gen
stabilně začleněný do genomu
interakce testovaných proteinů se projeví aktivací
reportérského genu
40
Negativní regulace
interakcí s inhibitorem
transkripční faktor MyoD
indukuje expresi genů potřebných pro
svalové buňky
obsahuje doménu šroubovice-smyčkašroubovice
(HLH) pro dimerizaci a
doménu pro vazbu na DNA
funguje jako heterodimer složený z
tkáňově specifického proteinu HLH
(MyoD) a obecného proteinu HLH
(proteinu E)
heterodimerizace s inhibitorem
postrádajícím DNA-vazebnou doménu
(Id) blokuje vazbu komplexu na DNA
(inhibice svalové diferenciace)
41
Přístupnost DNA v chromatinu
hustě složená DNA v chromatinu zabraňuje
RNA-polymeráze v přístupu k promotoru
acetylace histonů ovlivňuje kompaktnost
chromatinu: neacetylované histony tvoří velmi
kondenzovaný chromatin, acetylované histony
méně kondenzovaný chromatin
strupeň acetylace určují enzymy:
histonacetlytransferázy (HAT) a histonové
deacetylázy (HDAC)
42
Regulátory mění acetylaci
histonů
koaktivátory transkripce mají aktivitu HAT např. proteiny CBP/p300
korepresory transkripce mají aktivitu HDAC
koaktivátory a korepresory se nevážou na DNA přímo,
ale interagují s transkripčními faktory
43
Komplexy remodelující
chromatin
doplňují změny nukleozomů plynoucí z acetylace histonů
posunují nukleozomy po molekule DNA a obnažují její sekvence
pro transkripci
mění uspořádání histonů do volnější podoby, která DNA zpřístupňuje
44
Aktivace transkripce
eukaryotického genu
vazba transkripčního faktoru k DNA
vazba HAT k transkripčnímu faktoru
HAT acetyluje histony v okolí a uvolňuje vazbu nuklozomů k DNA
komplexy remodelující chromatin mění uspořádání nukleozomů –
přístupnost DNA je zvýšena
vazba dalších transkripčních faktorů
vazba RNA-polymerázy k DNA
45
Genovou expresi u eukaryot
ovlivňuje i metylace DNA
metylace cytozinu u vyšších eukaryot: 10-30%
katalyzována metyltransferázou
rozeznávací sekvence krátké: GC u živočichů a GNC u rostlin
metylace DNA zeslabuje genovou expresi
provozní geny nemají ostrovy GC metylované
metylové skupiny vyčnívají do velkého žlábku DNA a tak brání řádné
vazbě transkripčních faktorů
46
Epigenetické změny
a genová exprese
47
Regulace na úrovni translace
vzácná u bakterií, běžná u vyšších organismů
založena na vazbě regulátoru k RNA
regulátorem je obvykle malá molekula RNA, která se může párovat
s komplementární oblastí cílové mRNA
regulační možnosti:
řízení stability mRNA
přeměna mRNA do netranslatovatelné formy
řízení translace regulačními proteiny nebo prostismyslnou RNA
48
Stabilita RNA
mRNA má krátký poločas rozpadu,
po splnění své funkce podléhá
rozkladu ribonukleázami
citlivost k RNázám závisí na
sekundární struktuře
ta může být ovlivněna regulačními
signály, které indukují vazbu
regulačních proteinů na RNA
49
Regulace translace
místo pro vazbu ribozomů (RBS)
na mRNA může být skryto
sekundární strukturou
odštěpením části mRNA RNázou
se přístupnost RBS obnoví
50
RNA interference
(RNAi)
sekvenčně specifický mechanizmus
umlčování genů vyvolaný dvouřetězcovou
RNA na posttranskripční úrovni
inhibičními elementy jsou malé molekuly
RNA (miRNA, siRNA), které vznikají
štěpením větších molekul pre-miRNA
ribonukleázami Drosha (v jádře) a DICER
(v cytoplazmě)
DICER se spolu s RNA a proteiny Argonaut
stává součástí multiproteinového komplexu
RISC (RNA-induced silencing complex)
51
RNA interference (RNAi)
po úpravách zůstává s komplexem
RISC spojena ssRNA
ta umožní sekvenčně specifickou
vazbu celého komplexu na cílovou –
komplementární mRNA
nukleázová aktivita komplexu RISC
tuto mRNA rozštěpí
původně ochrana buňky proti virům
běžná v eukaryotických buňkách
využitelná pro cílenou inaktivaci
genů: výzkum genových funkcí
52
Dráhy RNAi
nukleáza DICER katalyzuje vznik malých molekul RNA (siRNA nebo
miRNA) o délce 21 – 28 pb z větších ds molekul pre-miRNA
siRNA a miRNA jsou spárovány po celé délce s výjimkou 3´-konců,
kde zůstávají 2 nukleotidy
nespárovány
v cytoplazmě se siRNA
a miRNA začleňují do
komplexů RISC
53
Dráhy RNAi
dsRNA je v RISC rozpletena helikázovou aktivitou a jedno z jejích
vláken je přednostně odstraněno
zbývající řetězec RNA interaguje se specifickými molekulami mRNA
interakce plyne z párování obou molekul
54
Dráhy RNAi
mRNA se tak nemůže podrobit translaci
mRNA vázaná v RISC se buď rozštěpí a degraduje nebo zůstane
v ds komplexu
její translace znemožněna
55
miRNA versus siRNA
obě RNA negativně regulují translaci
miRNA je endogenní, siRNA je exogenní (např. virového původu)
miRNA může, ale nemusí být úplně komplementární určitému
transkriptu, proto jedna miRNA může blokovat translaci
několika/mnoha transkriptů (desítky až stovky)
při úplné komplementaritě dochází k RNA interferenci vedoucí k
degradaci mRNA
při neúplné komplementaritě k degradaci nedochází, ale translace
je blokována
56
Objev RNA interference:
Nobelova cena
Andrew Fire a Craig C. Mello získali za objasnění RNA interference
u hlístice Nobelovu cenu za fyziologii a lékařství v roce 2006
57