11
Jan Šmarda
Ústav experimentální biologie PřF MU
Buněčný cyklus
a cílený rozklad
proteinů
Přednáška kurzu Bi4010 Základy molekulární biologie, 2018/19
22
Co je buněčný cyklus?
uspořádaný sled makromolekulárních procesů, při kterých buňka
zdvojí svůj obsah a následně se rozdělí na dvě buňky dceřiné,
přičemž každá z nich ponese stejné chromozomy
hlavní cíl: reprodukce genetického materiálu pro příští generaci
33
Vysoké nároky na přesnost
bezchybná replikace
správné řazení fází
přesná segregace chromozomů
Nežádoucí rizika:
mitóza před replikací: ztráta genetické informace nejméně
u jedné buňky
dvojnásobná replikace části chromozomu před mitózou:
zvýšení poštu kopií genů
44
Řídící elementy cyklu
kinázy skupiny CDK
specifické degradační systémy
55
Kinázy CDK
heterodimerní proteinkinázy s regulační složkou (cyklinem)
a katalytickou složkou (cyklin-dependentní kinázou, CDK)
na řízení cyklu se podílejí fosforylací
klíčových regulátorů
66
Degradační systémy
pro řízený rozklad specifických proteinů cyklu, následkem je nevratný
posun fází cyklu v jednom směru
Ubikvitin ligázy:
SCF
„anaphase promoting complex“ = cyklozom (APC/C)
Zajistí specifické označení proteinů polyubikvitinovou značkou, která je
předurčí k proteazomové likvidaci
7
Proč rozkládat
proteiny?
buňky mohou v organismu žít různě dlouhou
dobu (dny – roky), ale jejich složky jsou
průběžně nahrazovány
„turnover“ - rovnováha mezi
syntézou a degradací proteinů
vychýlení k proteosyntéze
– anabolismus – výstavba tkání
vychýlení k degradaci
– katabolismus – ztráta tkání
při stárnutí se „turnover“
prodlužuje - zvýšení hladiny
poškozených proteinů
příčinu nebo následek stárnutí
organismu?
8
Konstitutivní turnover
udržovací funkce – pravidelné nahrazování starších molekul novými
přesné vyvážení syntetických a rozkladných procesů v buňce
vyjadřuje se jako poločas rozkladu, tj. doba, během které se rozloží
polovina molekul daného typu
poločas závisí na velikosti molekuly, náboji, termostabilitě, flexibilitě,
hydrofobicitě, způsobu složení a způsobu uspořádání (jde-li o
vícepodjednotkový protein)
poločas rozkladu proteinů se pohybuje od hodin do dnů
9
Regulovaný turnover
rychlý rozklad specifických cílových molekul, např. v přenosech
signálů, regulaci buněčného cyklu nebo při diferenciaci a vývoji
10
neregulovaná proteolýza by znamenala riziko poškození buňky
soustředěna do specifických buněčných kompartmentů:
- lysozomů
- proteazomů
Kde probíhá proteolýza?
11
Lysozomy
membránou ohraničené organely s rozkladnými enzymy
hlavní organely štěpení buněčných složek
12
Lysozomy
enzymová výbava: směs cca 40 kyselých
hydroláz
lysozomy poskytují nízké pH, při kterém
jsou kyselé hydrolázy optimálně aktivní
podmínkou aktivity hydroláz je jejich
štěpení – syntetizují se jako neaktivní
prekurzory o vyšší molekulové hmotnosti;
aktivující štěpení probíhá až v lysozomech
13
Proteolýza v lysozomech
nízké pH (4-5) je nezbytné pro účinnou degradaci:
podmínka aktivity enzymů, pomoc při denaturaci substrátů
kyselé pH se udržuje protonovými
pumpami
hydrolýzou ATP se uvolňuje energie,
která se využije pro transport H+
proteiny lysozomální membrány jsou
vysoce glykosylované, což zvyšuje
jejich odolnost k lysozomálním
proteázám
produkty rozkladu (aminokyseliny,
cukry, nukleotidy) se s pomocí transportních proteinů dostávají
z lysozomů do cytozolu a mohou se podílet na biosyntetických
procesech nebo být vyloučeny ven z buňky
14
Transport substrátů
a enzymů do lysozomů
pomocí váčků (vezikulů) z vnějšího i nitrobuněčného prostoru
enzymy jsou syntetizovány v ribozomech hrubého ER
a do lysozomů se přenášejí přes Golgiho aparát
15
Lysozomy jsou heterogenní
velikost a tvar značně rozmanité (ostatní organely uniformní)
důsledek rozmanitosti rozkládaných substrátů
pozůstatky různých mimobuněčných i nitrobuněčných struktur
fagocytované mikroorganismy
trávení molekul potravy
po rozložení většiny dodaného materiálu obsahují pouze
nedegradovatelné zbytky, které se vyloučí exocytózou
je známo více než 30 různých genetických chorob člověka,
které jsou důsledkem mutací v genech lysozomálních enzymů:
nerozložený materiál se v lysozomech hromadí
16
Gaucherova nemoc
Gaucherova (čti gošérova) nemoc
je dědičně vázané onemocnění, které způsobuje ukládání tukových
látek (především glukocerebrosidu) v lidských orgánech (slezina,
játra, plíce, kosti, někdy mozek), čímž se zhoršuje jejich fungování
příčinou je deficit gluko-cerebrozidázy, nedegradovaný materiál
se v lysozomech hromadí – zvětšování tkání
léčba: substituční enzymová terapie
Philippe Gaucher
(1854-1918)
17
Proteazom
druhý hlavní buněčný
kompartment proteolýzy
představuje až 1% všech
buněčných proteinů
tvar válce, uvnitř dochází ke štěpení proteinů na malé peptidy
poklopy ovlivňují přístupnost válce pro substráty
substráty jsou abnormální a špatně složené proteiny + normální
proteiny označené k likvidaci
18
Proteazomy
přítomny v jádře i cytozolu
sestaveny z mnoha proteinových podjednotek
regulační systémy ovládají otevření „poklopů“ a umožňují tak vstup
pouze vybraným molekulám
podmínkou přenosu molekul do proteazomu je jejich modifikace
připojením malého polypeptidu – ubikvitinu – k lyzinovým zbytkům
nutná energie ATP
19
Proteazom
a kontrola kvality proteosyntézy
proteosyntéza většinou produkuje řádně složené proteiny
neúplně složené proteiny jsou zacíleny chaperony díky obnaženým
hydrofobním sekvencím a buňka se snaží zajistit, aby dosáhly
správné konformace
nesložené proteiny se likvidují v proteazomu
nesprávná funkce proteazomu: proteiny s obnaženými hydrofobními
úseky agregují a narušují funkce tkání
20
Proteazom 26S
ATP-dependentní komplex proteáz
katalyzuje rozvolnění a proteolytický rozklad svých substrátů
složen z katalytického komplexu 20S, který je obklopen dvěma
regulačními komplexy 19S
21
Struktura proteazomu
Podjednotka 20S (jádro):
válec složený ze čtyř kruhů
(2xα, 2xβ)
vnitřní komora přístupná pouze
otvory na obou koncích
aktivní místa pro proteolýzu
soustředěna v podjednotkách β
- β1 štěpí kyselé zbytky (caspase-like activity)
- β2 štěpí zásadité zbytky (trypsin-like activity)
- β5 štěpí hydrofobní zbytky (chymotrypsin-like activity)
22
Jádro proteazomu (20S)
podjednotky α nemají
katalytickou aktivitu,
účastní se translokace substrátu
do proteolytické komory
vlastní hydrolýza molekul
substrátu na malé peptidy je
zajišťovaná podjednotkami β
a nevyžaduje ATP
ATP je potřeba pro rozvinutí proteinů, aby se do úzkého prostoru válce
mohly dopravit
23
Složeny z 15-20 jednotek:
jednotky n1-n12 bez ATPázové aktivity
tvoří poklop: rozeznávají ubikvitinem
označené proteiny a odstraňují
ubikvitinové značky pro recyklaci
ATPázy t1-t6 tvoří základnu: zajišťují
rozplétání proteinů a jejich transport
do podjednotky 20S
obsahuje víko („lid“) a základnu („base“)
regulační funkce: rozeznávají a rozplétají substrátové proteiny
Struktura proteazomu:
podjednotka 19S
24
Postupný rozklad
proteinů v proteazomu
víko proteazomu rozeznává příslušný substrát
substrát se rozplétá a za spotřeby ATP se translokuje
do válce; v rané fázi se odštěpuje ubikvitin pro recyklaci
hydrolýza je důkladná: na malé peptidy
25
Značení proteinů pro
proteazomovou likvidaci
regulačním prvkem je vstup do válce proteazomu
substráty, kterým má být povolen vstup do proteozomu se
opatří specifickou značkou (protein-tagging) – ubikvitinem
ubikvitin se k cílovém proteinu připojuje kovalentní vazbou
pomocí specifických enzymů
26
Významné cíle
proteazomové degradace
regulátory buněčného cyklu a růstu
složky buněčných signálních kaskád
transkripční faktory
enzymy zapojené do metabolických reakcí
varianty proteinů vytvořené v důsledku mutace nebo defektní
proteosyntézy
antigeny hlavního histokompatibilitního komplexu třídy I
vyřazení funkce proteazomu je pro buňky letální
27
Ubikvitin
protein o nízké molekulové hmotnosti (76 AK)
kompaktní globulární struktura
evoluční konzervativnost
vyskytuje se ve všech tkáních všech eukaryotických organismů
v buňce se vyskytuje jako volná molekula nebo kovalentně
připojená k jiným proteinům
váže se k aminoskupině lyzinu cílového proteinu
vazbou dalších molekul ubikvitinu vzniká polyubikvitinový
řetězec, který je vstupenkou do proteazomu
28
Značení molekul ubikvitinem
aktivace ubikvitinu
katalyzovaná ubikvitin-aktivujícím enzymem E1
reakce je závislá na ATP
výsledkem je ubikvitin připojený svým C-koncem k proteinu E1
následně se ubikvitin přenáší z E1 na ubikvitin-konjugující enzym E2
enzym E2 funguje v komplexu s enzymem E3; tento komplex se
označuje jako ubikvitin-ligáza
29
Značení molekul ubikvitinem
u savců existují stovky ubikvitin-ligáz, které rozeznávají degradační
signály (tzv. degrony) na cílových proteinech prostřednictvím části E3
- rozeznání substrátu
ubikvitin-ligázy zajišťují vznik polyubikvitinových řetězců připojených
k lysinu cílového proteinu
30
Proteiny s navázaným Ub
podléhají degradaci v proteazomu
Průběh:
vazba substrátu označeného poly-Ub k
Ub-receptorové podjednotce proteazomu
odštěpení Ub prostřednictvím izopeptidáz
vázaných na poklop
rozvinutí a translokace substrátu do válce
proteazomu
degradace substrátu na malé peptidy
31
Řízená destrukce proteinů
- příklady
likvidace špatně složených nebo jinak abnormálních proteinů
likvidace normálních proteinů, jejichž poločas rozpadu je z nějakého
důvodu potřeba zkrátit (např. v souvislosti se změnou stavu buňky,
buněčným cyklem, apod.)
existují proteiny s přirozeně krátkým poločasem rozpadu, jiné se
rychle rozkládají jen podmínečně, jinak jsou stabilní
např. cykliny se v určité fázi buněčného cyklu rychle rozkládají
3232
Aktivita komplexů cyklin-CDK
koncentrace cyklinů kolísá v průběhu cyklu
koncentrace CDK je stabilnější, ale jejich aktivita je bez cyklinu nulová
cykliny spolurozhodují o výběru substrátu pro fosforylaci kinázou CDK
3333
Cykliny a fáze cyklu
Cyklin fáze G1: cyklin D
Cyklin fáze G1/S: cyklin E
Cyklin fáze S/G2: cyklin A
Cyklin fáze M: cyklin B
3434
Tři funkční stavy Cdk
A) inaktivní - bez cyklinu, aktivní místo Cdk je blokováno částí proteinu
zvanou T-smyčka
(B) částečně aktivní - po navázání cyklinu opouští T-smyčka aktivní
místo Cdk a částečně jej tak aktivuje
(C) plně aktivní - fosforylace treoninu T smyčky Cdk kinázou CAK
(Cdk-activating kinase): konformační změna, zvýšení afinity pro
příslušné substráty
3535
Regulace aktivity Cdk: fosforylace
vazba cyklinů primárně určuje aktivitu Cdk
pomocné mechanismy přispívají jemné regulaci aktivity Cdk:
- fosforylace dvojice aminokyselin v blízkosti aktivního místa
kinázou Wee1 inhibuje aktivitu komplexu cyklin/Cdk
- defosforylace těchto aminokyselin fosfatázou Cdc25 zvyšuje
aktivitu komplexu cyklin/Cdk
- další aktivační fosfát přidává CAK na T smyčku
Kináza Wee1 – inhibuje komplexy cyklin Cdk
Fosfatáza Cdc25 – aktivuje komplexy cyklin-
Cdk
3636
Regulace aktivity Cdk:
inhibiční proteiny CKI
vážou se na komplexy cyklin/Cdk a inhibují je v důsledku změny
konformace aktivního místa Cdk
3737
Inhibitory CDK: rodina Cip/Kip
tři členové u savců: p21Cip1, p27Kip1, p57Kip2
p21 se indukuje při poškození DNA pomocí proteinu p53,
pozastavuje cyklus ve fázích G1 a G2
3838
Inhibitory CDK: rodina INK4
p16INK4A
p15INK4B
p18INK4C
p19INK4D
Společné znaky:
inhibice tvorby komplexů cyklinů D a CDK4/CDK6 a inaktivace již
vytvořených komplexů
zastavení buněčného cyklu ve fázi G1 (před bodem restrikce)
39
Kontrolní body cyklumolekulární
brzdy
Kontrolují :
iniciaci fáze S
iniciaci mitózy
rozdělení dceřiných chromozomů
v anafázi
začátek telofáze a cytokineze
celistvost DNA
zajišťují, aby hlavní události cyklu probíhaly v pevně daném pořadí
sensory sledují klíčové děje cyklu a poskytují řídícímu systému zpětnou
vazbu
je-li zaznamenána chyba, řídící systém prodlouží danou fázi, aby chyba
mohla být opravena
zajišťují extrémní přesnost buněčného dělení (příjem správného počtu
řádně replikovaných chromozomů dceřinou buňkou)
40
41
Princip fungování
kontrolních bodů
kontrolují aktivity komplexů cyklin-CDK a ubikvitinligáz SCF a APC/C
různé mechanismy:
regulace syntézy a
degradace cyklinů
fosforylace CDK
v inhibičních a
aktivačních místech
regulace syntézy a
stability inhibitorů CDK
4242
Buněčný cyklus reaguje na signály
z vnějšího i vnitřního prostředí
Vnější podněty:
signální molekuly
živiny a růstové faktory
Vnitřní podněty:
stupeň dokončení předchozích fází
poškození DNA
Na základě těchto podnětů může být buněčný cyklus pozastaven.
4343
Důkaz existence regulátorů
cyklu: fúze savčích buněk
spojení buněk v různých fázích cyklu: G1 + S
sledován průběh replikace DNA inkorporací značeného tymidinu
značka se objevila v DNA buňky fáze G1 i S: buňka ve fázi G1
zahájila replikaci okamžitě po fúzi
(Johnson a Rao, 1970)
buňka G1
+
buňka S
Heterokaryon
DNA jádra G1 se replikuje
Závěr: v S-fázové buňce existuje faktor, který indukuje replikaci
v jádře ve fázi G1
44
Důkaz existence regulátorů
cyklu: fúze savčích buněk
spojení buněk v různých fázích cyklu: G1, G2 nebo S + M
buňka G1, G2 nebo S
+
buňka M retrakce jaderné membrány,
chromozomy kondenzují
Závěr: v M-fázové buňce existuje
faktor, který indukuje mitózu
45
Výhody kvasinkového modelu
dostupnost údajů o sekvenci genomu
haploidní status - usnadnění genetických analýz
snadná kultivace, vysoká rychlost cyklu
snadné vizuální vyhodnocení fáze buněčného cyklu mikroskopickou
analýzou morfologie buněk:
- u pučících kvasinek (Saccharomyces cerevisiae) nepřítomnost
pupene – značí fázi G1, přítomnost pupene menšího než u
rodičovské buňky – značí fázi S, přítomnost pupene podobné
velikosti jako u rodičovské buňky – značí fázi G2
- u štěpících se kvasinek (Schizosaccharomyces pombe) lze na fázi
cyklu usuzovat z délky buněk
Výzkum buněčného
cyklu u kvasinek
46
Kvasinky: buněčný cyklus je sled
navazujících fází
nová fáze cyklu může nastat až po
dokončení fáze předchozí – dominový efekt
mutace v genech nutných pro průchod
danou fází cyklu (cdc) se projeví
synchronizací celé populace kvasinkových
buněk – jejich cyklus se zastaví ve stejné
fázi
Geny cdc jsou esenciální, proto kvasinky
defektní v cdc nejsou životaschopné –
připraveny podmínečně letální mutanti
47
Identifikace genů řídících cyklus
48
Buněčný cyklus
krok za krokem
růst
kopírovat DNA
kondenzovat
chromozomy
vytvořit vřeténko
rozdělit se
49
Fáze G1
nejdelší a nejvariabilnější
biosyntetické procesy, sestavování organel
monitorování vnějších a vnitřních podmínek před zahájením S-fáze
dostatek živin a růstových faktorů: růst buňky, vysoká metabolická
aktivita
nedostatek živin nebo anti-proliferační signál: zpomalení postupu
fází G1 nebo opuštění cyklu do fáze G0
na konci kontrolní bod restrikce/Start
5050
Fáze G1
buňka schopna reagovat na mimobuněčné signály: mitogenní
a anti-mitogenní (TGF-ß) růstové faktory
růstové faktory přítomny a protirůstové nepřítomny: překonání bodu
restrikce do další fáze
S-fáze probíhá i za nepřítomnosti růstových faktorů
stejnému signálu jsou vystaveny
sousedící buňky – koordinace
51
Fáze G0
fáze, ve které se nachází většina buněk mnohobuněčných organismů:
jsou diferencované a specializované k výkonu určité funkce, nedělí se
možnost opětného vstupu do buněčného cyklu po přijetí prorůstového
signálu
Neurony a buňky kosterního svalstva jsou terminálně diferencované
(fáze G0) - exprese genů nutných pro buněčný cyklus je zcela vypnuta;
opětné nastartování cyklu téměř nemožné
Jaterní buňky: udržují schopnost rychlého obnovení
funkcí cyklu, např. v případě poranění
Fibroblasty a lymfocyty: přecházejí do G0 a znovu
se vracejí do cyklu několikrát během svého života
52
Návrat do cyklu z fáze G0
přidání růstových faktorů aktivuje transkripci genů ve dvou fázích:
geny okamžité reakce (early-response genes) a geny opožděné
reakce (delayed-response genes)
transkripce raných genů se indukuje během minut (např. jun, fos,
myc)
exprese genů opožděné reakce závisí na produktech genů okamžité
reakce (např. cyklin D)
53
Proteiny E2F
E2F jsou transkripční faktory, které aktivují expresi genů
kódujících proteiny pro replikaci DNA, cykliny pozdní fáze
G1, S a CDK fáze S
Nepřítomnost mitogenů:
exprese genů řízených E2F je
znemožněna interakcí mezi
E2F a proteinem Rb
Přítomnost mitogenů:
G1-CDK fosforyluje Rb
tím se uvolní vazba Rb-E2F
E2F následně zajistí expresi cílových genů
54
Přechod bodu restrikce:
účast Rb
Rb protein je jedním z
nejdůležitějších substrátů
komplexů cyklin-CDK fáze G1
fosforylace Rb brání jeho asociaci
s E2F – následkem je posun do
fáze S
fosforylace Rb se v průběhu cyklu
dále zvyšuje
fosfatázou PP1 přechází Rb zpět
do hypofosforylovaného stavu ve
fázi G2
55Šmarda: Bi7090_2010 55
Mitogeny
prorůstové signální molekuly,
které nitrobuněčnými
signálními kaskádami aktivují
geny okamžité reakce
produkty genů okamžité
reakce aktivují geny opožděné
reakce (např. cyklin D)
cyklin D/CDK fosforyluje Rb
pozitivní zpětné vazby: E2F
posiluje transkripci vlastního
genu; G1/S-Cdk a S-Cdk
zvyšují fosforylaci Rb
56
Fáze G2
buňka má dvojnásobný obsah DNA než v G1
sesterské dvoušroubovice drženy v komplexu kohezinem
kontrola celistvosti DNA a příprava mitózy
v případě, že je nalezena nereplikovaná nebo poškozená DNA,
nebo nedošlo k duplikaci centrozomu kontrolní body znemožní
zahájení mitózy
57
Kondenzace chromatid
replikovaná DNA ve fázi S má podobu dlouhých vláken,
jejichž oddělení by znamenalo riziko poškození
proto buňka postupně reorganizuje chromatidy do
kompaktnějších struktur, které mohou být rozděleny
snadněji
na konci metafáze mají chromatidy podobu tyčinkovitých
struktur, které jsou pevně spojeny v oblasti centromery
58
M-Cdk
jediná kináza zajišťující všechny procesy mitózy:
sestavení vřeténka
připojení sesterských chromatid k opačným pólům
kondenzaci chromozomů do tyčinkovitých struktur
degradaci jaderné membrány
změna uspořádání aktinových vláken, atd.
59
Mitóza
oddělení chromatid a jejich distribuce do dceřiných jader, každá
s úplnou kopií genomu
cytokineze
Pro regulaci jsou zásadní dva procesy:
prudké zvýšení aktivity M-Cdk v kontrolním bodě G2/M, které
vede k procesům rané mitózy (sestavení vřeténka a jeho
připojení sesterským chromatidám)
ubikvitinligáza APC/C zajistí likvidaci (a) sekurinu: štěpení
kohezinu a oddělení chromatid, (b) cyklinu M-fáze: inaktivace a
defosforylace cílových proteinů (anafáze, telofáze, cytokineze)
6060
Pozitivní zpětná vazba
při aktivaci MPF
61
Dokončení M-fáze
jakmile je každý kinetochor připojen k vláknům vřeténka, faktor Cdc20
aktivuje ubikvitin ligázu APC/C
APC/C katalyzuje vazbu ubikvitinu
na cyklin M-fáze a sekurin
následuje rozklad označených
proteinů proteazomem
absence cyklinu B inaktivuje MPF
a zakončuje mitózu
62
Dokončení M-fáze
sekurin (inhibitor anafáze) chrání vazby, které udržují sesterské
chromatidy pohromadě na počátku mitózy (kohezin)
rozklad sekurinu při přechodu
metafáze/anafáze aktivuje separázu
separáza oddělí chromatidy a umožní
anafázi
po připojení kinetochorů k dělícímu
vřeténku Cdc20 aktivuje APC/C
ubikvitin ligáza APC/C označí
sekurin
degradací sekurinu se aktivuje
separáza
separáza rozloží kohezin, který spojuje chromatidy - nastává anafáze
63
Kontrolní body
64
Hlavní kontrolní body cyklu
65
chyby při replikaci, záření nebo chemikálie poškozují DNA
oprava nutná před replikací nebo segregací
kontrolní systém: detekce poškození DNA a zastavení cyklu
v kontrolních bodech před začátkem S-fáze nebo M-fáze
detekci poškození DNA zajišťují kinázy ATM a ATR,
které fosforylují své cílové proteiny, včetně kináz Chk1 a Chk2
fosforylace proteinů těmito kinázami zastavuje cyklus
hlavním cílovým genem je p53
fosforylovaný p53 stimuluje transkripci genu p21
protein p21 jedním z inhibitorů (CKI) komplexů G1-Cdk
a G1/S-Cdk
Kontrolní body monitorující
poškození DNA
66
p53
p53 je nestabilní protein, v nepoškozených
buňkách přítomen v nízké koncentraci
důsledek jeho interakce s ubikvitinligázou Mdm2,
jejíž expresi sám aktivuje
Mdm2 zprostředkovává rozklad p53 v proteazomu
67
p53
fosforylace p53 v poškozených buňkách
omezuje jeho interakci s Mdm2, tím se
stabilizuje a může aktivovat transkripci genu
p21
68
Poškození DNA a rakovina
hromadění neopravovaných poruch v DNA zvyšuje riziko
vzniku nádorotvorných mutací
mutace, které vyřadí z činnosti systém reakcí na poškozenou
DNA jsou velmi nebezpečné
absence funkčního p53 provází alespoň polovinu lidských
nádorů, protože umožňuje hromadění mutací
69
Ataxia telangiectasia
vzácné genetické
neurodegenerativní onemocnění
důsledek defektu ATM, tj. kinázy
určené pro reakci na poškození
DNA (reparační mechanismy
oslabeny)
pacienti jsou velmi citliví na
záření a mají zvýšené riziko
vzniku rakoviny
70