POLYMERAZOVA ŘETĚZOVÁ REAKCE PCR (POLYMERASE CHAIN REACTIOn) 1983 Význam: PCR umožňuje získat požadovanou specifickou DNA sekvenci bez klonování. > Princip standardní PCR: Po připojení dvou primem ke komplementárním sekvencím ssDNA řetězce probíhá syntéza specifického úseku DNA in vitro. > PCR využívá základních rysů replikace DNA: • Jako templát slouží ssDNA (původně dsDNA po předchozí denaturaci). • Komplementárně navázaný primer vymezuje úsek DNA, který bude amplifikován. • Enzymatická syntéza za katalytického účinku DNA polymerázy > Teoreticky lze získat 2n řetězců (kopií) amplifiko-vaného úseku DNA. Polymerace F*CR : Polymerase Ch ain Reaction TTTTnTTlTrTrTTnTTTm 30 40 cycles of 3 steps : Step 1 : denaturation 1 minut 94 °C "•"mm.....^TTTTTTTTTrrrrrTTTrrrrTTrri11 i u n -m 3' 3' ilLjjJJJJJ—LLLL 5' 'nTrrrrnrrrTríTľ3' m Vm-?mi. Step 2 : annealing 45 seconds 5-4 °C forward and reverse primers II! rrnmrrr........"nrniri mi^TrrrrrrmrrTľi nurTmim n ir i i — 3-^JJl-U.JU.UXLL.UJJjlJjJlJ_U . I I v, -I 1 — s , I I 5' Step 3 : extension 2 minutes 72 C only dNTP's _tAiidy Vicreiraclf IVW'y reakční podmínky pcr Denaturace vzorku DNA Pro oddělení jednořetězců (94 °C, 5 min) Připojení primerů na řetězce DNA (30 - 65 °C, 1 min) Denaturace pro separaci řetězců DNA 25 — 35 * (94 °C, 30 s) Syntéza nových řetězců DNA polymerázou (72 °C, 45s - 2 min) REAKČNÍ SLOŽKY v PCR směsi o Templátová nukleová kyselina (DNA nebo RNA). Množství -méně než 1 \ig, závisí obvykle na její velikosti. Kvalita templátu ovlivňuje výsledek PCR. ■ velké množství RNA může vázat ionty Mg ■ znečištěný templát může obsahovat inhibitory PCR Zdroj: mikroorganizmy, buňky z tkáňových kultur, tělní tekutiny, bioptické vzorky, stery, vlasy, atd... o Primery. Syntetické oligonukleotidy (10-30 nt). o dNTP (dATP,dGTP,....) ve formě Na+ (Li+) solí o Mg2+ ionty tvoří rozpustný komplex s dNTP, který rozpoznává DNA polymeráza. Mg ionty ovlivňují aktivitu enzymu. o Termostabilní DNA polymeráza, rezistentní k 98 °C. ■ Taq Thermus aquaticus ■ Tth Thermus thermophilus ■ Pwo Pyrococcus woesei reakční podmínky v termocykleru standardní pcr 1. Počáteční denaturace dna: 95 °CI 2-5 min. rychlá renaturace DNA,- nespecifické vazby primem falešné výsledky. 2. Denaturační krok: 94 - 95 °c / 20 - 45 s (separace retezcu) nedostatečně denaturovaná DNA brání přístupu primerům, dlouhá doba denaturace snižuje aktivitu DNA polymerázy (stabilní cca 2 hod / 98 °C). 3. Připojení primerů (55 - 65 °c / 30 - 90 s) teplota určuje specifičnost reakce. Připojovací teplota Ta se optimalizuje v teplotním gradientu. (Ta ~Tm) Orientačně lze vypočítat Ta podle vztahu: Ta = 2(A+T) + 4(G+C) - 5°C = Tm - 5 °C 4. Prodlužování primeru probíhá při 72 °C /45 - 90 s. Taq DNA polymeráza syntetizuje cca 60 bází/s. Nově syntetizované řetězce slouží jako templáty pro další cyklus. Většinou se provádí 25 - 35 cyklů. 5. Závěrečná extenze se provádí obvykle po posledním cyklu (72°C/5 min) a slouží k dokončení syntézy a renaturaci jednořetězcových produktů. KONCENTRACE JEDNOTLIVÝCH SLOŽEK ve standardní PCR o Množství DNA. doporučení: ■ lidská genomová DNA: 100 - 500 ng ■ bakteriální DNA: 1 - 10 ng ■ plazmidová DNA: 0,1 - 1 ng o Primery. Optimální koncentrace je 0,1 a 0,6 jnM. U některých systémů může být vyšší koncentrace (až 1 jnM). Nižší koncentrace vede k předčasnému vyčerpání primem a snížení výtěžku. o dNTP. Výsledná koncentrace 50 - 500 jnM (pro každý nukleotid) Medián je 200 jnM. Při zvýšení koncentrace dNTP je třeba zvýšit koncentraci Mg2+. o MgCl2. Pro dosažení nej lepšího výsledku vždy stanovujeme koncentraci Mg2+ experimentálně. Optim, konc. Se může nacházet od 1 mM do 5 mM. Nejčastěji používaná koncentrace je 1,5 mM (pro 200 uM dNTP). o DNA polymeráza je 0,5- 2,5 jednotek / 50 ul. o pH je dané reakčním pufrem, obvykle je pH 8,3 - 9,0. o Přídatné látky ovlivňuj ít účinnost a specifičnost PCR o Jejich vliv se obvykle určuje experimentálně: • albumin z bovinního séra (BSA) (100 ng/50 ul) • dimetylsulfoxid (DMSO) (2-10 % v/v) - redukce nespecifické vazby primeru • detergenty (Triton X-100, Tween 20) • betain (0,5 - 2 M) • želatina • glycerol (1 - 5 % v/v) • spermidin • protein 32 genu fága T4 o Minerální olej - zabraňuje vypařování během reakce Optimalizace: 1. gradient Ta 2. gradient koncentrací MgCl2 3. počet cyklů 4. při multiplex PCR • nejdříve každý pár zvlášť, poté dohromady • upravit množství j ednotlivých primem detekce amplifikovaného produktu pcr 1. Stanovení fyzikální velikosti produktu gelovou elektroforézou (agaróza, polyakrylamid). Detekce obarvením etidiumbromidem a pozorování pod UV světlem. 12 3 4 Příklad standardní gelové elektroforézy s produkty PCR (amplikony) v agarózovém gelu. 1 = hmotnostní standard 2 - 4 = produkty PCR •v 2. Štěpení produktu restrikčními enzymy a posouzení spektra vznikajících restrikčních fragmentů (PCR-RFLP) 3. Elektroforetická separace produktů za specifických podmínek pro detekci sekvenčních polymorfizmu • DGGE - denaturační gradientova gelová elektroforéza • SSCP - analýza polymorfizmu konformace jednořetěz-cových forem. 4. Detekce produktu hybridizací se značenou sondou (po elektroforéze nebo in situ) Modifikace PCR používané v diagnostice Multiplex PCR (mnohonásobná PCR) Při multiplex PCR je použito více párů specifických primem. Dochází k amplifikaci více cílových sekvencí při jedné reakci. Použití a výhody: • Vyhledávání změn na dlouhých úsecích DNA • Testování vzájemně nesouvisejících oblastí na DNA • Amplifikace vnitřních kontrol současně se vzorky • Nižší cenové náklady než při samostatných amplifikacích Používané aplikace: • Detekce specifických toxinů produkovaných některými organizmy (Clostridium difficile, Staphylococcus aureus) - může být detekováno až 7 různých genů kódujících toxiny. • Detekce více genů kódujících rezistenci k různým antibiotikům. • Detekce více druhově specifických genů - identifikace organizmů • ko-amplifikace vnitřních kontrol Příklad detekce lyzogenie v genomu bakterie Staphylococcus aureus pomocí multiplex PCR profág serol. skupiny A -» profág serol. skupiny F -» profág serol. skupiny B -» vnitřní kontrola -» využití metod pcr 1. Základní výzkum - izolace genů nebo jejich částí - sekvencování DNA - mutageneza in vitro - modifkace konců DNA - analýza (selekce) klonů z genových knihoven - příprava značených sond 2. Aplikovaný genetický výzkum - prenatální diagnostika (dědičných chorob) - detekce mutací v genech - studium polymorfizmu genů (např. RAPD) - populační genetika 3. Využití v klinických disciplinách - detekce patogenních mikroorganismů (baktérií, virů, prvoků, hub) - identifikace onkogenů - typizace nádorů - stanovení pohlaví 4. Využití v praxi - archeologie - soudnictví - kriminalistika ŘEŠENÍ PROBLÉMŮ PŘI STANDARDNÍ PCR Problém Možná příčina Doporučení Nevzniká produkt Nevyvážená reakce • Kontrola koncentrace jednotlivých složek Teplotní podmínky • Kontrola nastavení cyklů Nízká koncentrace templátu • Zvýšit koncentraci templátové DNA Koncentrace primem nebo jeho sekvence • Optimalizovat koncentraci primem • Navrhnout primer s novou sekvencí Různé faktory • Testovat reakci s pozitivní kontrolou a funkčními primery • Začít s novými roztoky, H20 a enzymem Nízká kvalita templátu (degradovaný, kontaminovaný, obsahující inhibitiry) • Použít primery, které amplifikují kratší úseky • Přidat pomocné látky (DMSO) • Optimalizovat koncentraci Mg2+ • Připravit nový templát • Zamezit častému zmrazování a rozmrazování templátu Nízká účinnost polymerázy • Používat pozitivní kontrolu • Zvýšit počet cyklů • Zvýšit koncentraci enzymu • Použít jinou polymerázu Produkt není čistý Vzniká sekundární amplifikační produkt • Kontrola koncentrace složek reakce • Optimalizovat koncentraci Mg2+ • Optimalizovat koncentraci primem • Snížit počet cyklů • Smížit koncentraci templátu Vznikají četné nespecifické produkty Nespecifická vazba primem • Použít vyšší teplotu Ta • Optimalizovat koncentraci primem • Použít „hot start" • Narhnout nové primery Zásady při přípravě PCR směsi a detekci PCR produktů 1. Při přípravě PCR směsi nejlépe v PCR-boxu je nutno používat ochranné rukavice 2. Směs připravit na ledu (obzvlášť u složitějších reakcí a u reakcí o velkém počtu vzorků, které trvá déle namíchat). Polymeráza musí být vždy na ledu, ostatní reagencie se nechají roztát a případně po té se dají na led. 3. Pipety a plasty k tomu určené jsou vyčleněny pouze pro PCR. 4. První se pipetuje do zkumavky voda, jako poslední polymeráza 5. Používat deionizovanou vodu, taje vysterilizovaná v čisté sklenici a následně rozpipetovaná do ependorfek a uložena v mrazničce. Vodu po rozmražení používat jednorázově - po použití zbytek vyhodit. 6. Do reagencií a obzvláště primem jít jen vhodnou sterilní špičkou, což zaručí, že se pipeta nedotkne stěny zkumavky. 7. Jako kontrolu čistoty reagencií vždy přidávat do jednoho vzorku vodu místo DNA - negativní kontrola. 8. Malé objemy pipeto vat pod hladinu, vizuálně kontrolovat správný objem v pipetě. 9. Místnost, určená pro PCR reakce, je pravidelně svícena UV zářením a pracovní plochy se omývají dezinfekcí. Zde nikdy nepracovat s PCR produkty. 10. Detekce amplifikovaných sekvencí se provádí v jiné místnosti, vybavené pro elektroforézu. Protokol pro standardní PCR Název: Program č. Režim PCR: (Tden 94 °C /60 s; Ta = 57°C/60 s; Text 72°C / 60 sec; Poř. Slož. Složky Zásobní koncentrace Výsledná koncentrace v25ul Množ. uJ na jeden vzorek (25uJ objem) Množství (xl na 8. vzorků 1. H20 (sterilní deion.) 2. Pufr pro PCR 10* 3. MgCI2 0 mM (25 mM) 4. BSA 10 mg/ml 5. Primer F 100 pmol/uJ 6. Primer R 100 pmol/uJ 7. dNTP 10* (2mM každý) 8. Taq polymeráza 5U/uJ 9. Matricová DNA různá ug/ml Velikost PCR produktu: 300 (bp) ELFO: Gel 1,5% ELFO pufr: 1*TAE Režim: 5 V/cm Velik. standard: 100 bp (BioLabs) 100-1500 bp Ml: H20, primery, dNTP M2: H2Q, pufr, MgC12, Taq DNA polymeráza Templátová DNA se do zkumavky přidává naposledy: Pro závěrečný protokol bude třeba znát koncentraci izolované DNA plazmidu pUC18.