1
ULTRACENTRIFUGACE
Příprava preformovaného sacharózového gradientu
Ultracentrifugace je separační metoda používaná v molekulární biologii k identifikaci, izolaci,
purifikaci a charakterizaci biomakromolekul, buněčných organel, virů apod. Na rozdíl od klasické
nízkoobrátkové centrifugace se ultracentrifugací rozumí odstřeďování při vysokých otáčkách, tj.,
při 20 000 - 100 000 ot/min. Vysokému počtu otáček je přizpůsobena konstrukce ultracentrifugy;
nutné je intenzívní chlazení a snížení atm. tlaku v rotorovém prostoru. Rotory jsou vyrobeny z
ušlechtilých materiálů, centrifugační zkumavky jsou vyrobeny z hmot odolávajících vysokému
přetížení a vzorek ve zkumavce je hermeticky uzavřen. Nutné je přesné vyvážení protilehlých
centrifugačních zkumavek (přesnost hmotností se pohybuje řádově v jednotkách mg).
Z hlediska účelu lze centrifugaci rozdělit na:
a) preparativní, kdy cílem je izolace nebo purifikace biomakromolekul.
b) analytická, kdy cílem je identifikace případně charakterizace dané částice (např. stanovení její
velikosti (mol. hmotnosti), sedimentačního koeficientu, vznášivé hustoty apod.).
V obou případech je možné podmínky centrifugace zvolit tak, aby dělení částic probíhalo buď v
závislosti na jejich velikosti, nebo v závislosti na jejich hustotě.
Pokud mají být navzájem odděleny částice lišící se navzájem svou velikostí (molekulární
hmotností), probíhá centrifugace většinou v tzv. sacharózových gradientech, tj. v roztocích
sacharózy, jejichž koncentrace u dna centrifugační zkumavky je vyšší než u hladiny.
Nejčastěji se používají lineární gradienty 5 - 20% sacharózy. Vzrůstající hustota roztoku a tím i jeho
viskozita eliminují odstředivé zrychlení působící na částice, jehož hodnota se směrem od osy
otáčení zvyšuje. Gradient tak zajišťuje konstatní rychlost sedimentace částic, podmiňuje jejich
stabilitu a snižuje difúzi usazených částic do okolí. K přípravě gradientů lze použít rovněž dalších
látek, např. D2O, ficoll aj.
Sacharózových gradientů se velmi často používá pro stanovení molekulárních hmotností DNA a
proteinů.
V případě, že mají být vzájemně odděleny částice na základě své odlišné specifické hustoty,
používá se gradientů chloridu cesného. Roztoky CsCl se vyznačují vysokou hustotou a při
centrifugaci samovolně vytvářejí koncentrační a tím i hustotní gradient. Gradient je určen počáteční
koncentrací CsCl a rychlostí otáčení. K ustálení gradientu dojde během několika hodin.
Biomakromolekuly, které se na počátku centrifugace promíchají s roztokem CsCl, se při
centrifugaci usadí ve vrstvě roztoku (gradientu), odpovídající jejich vznášivé hustotě (její hustota je
poněkud odlišná od specifické hustoty).
Detekce biomakromolekul po centrifugaci.
V případě preparativní ultracentrifugace lze částice detekovat vizuálně, jako opalescenční pruhy
uvnitř zkumavky. Tyto lze pak odebrat (např. injekční stříkačkou) a dále zpracovat. V případě
analytické centrifugace se obsah zkumavky po centrifugaci rozdělí na jednotlivé frakce (např.
vykapáním) a každá frakce se odděleně analyzuje z hlediska fyzikálních vlastností (tj. hustota,
absorbance, radioaktivita, index lomu apod.). Číslo frakce udává současně i její vzdálenost od
povrchu (dna) zkumavky a tím i od středu otáčení. Srovnání fyzikálních veličin jednotlivých frakcí
umožní pak identifikovat polohu částic v gradientu a blíže je charakterizovat.
2
Příprava preformovaného gradientu CsCl
Příprava roztoků CsCl (100 ml) v pufru SM
Složení pufru SM: na objem 1 litr: 5,8 g NaCl; 2 g MgSO4 . 7 H2O; 50 ml 1M Tris.Cl (pH 7,5);
5 ml 2% želatiny (sterilizace autoklávováním).