MASARYKOVA UNIVERZITA
PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA
ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE
ODDĚLENÍ GENETIKY A MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE
KURZ BI 4035 PRAKTIKUM Z MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE
Vyučující: Mgr. TIBOR BOTKA, Ph.D.
tibor.botka@mail.muni.cz
Výuka je povinná a probíhá v jarním semestru akademického roku
ÚVODNÍ KURZ PRAKTIKA.
1. PROVOZ A BEZPEČNOST PRÁCE
2. ZÁSADY PRO PRÁCI V MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÉ
LABORATOŘI
PŘEDPOKLÁDANÉ PRAKTICKÉ ZNALOSTI POSLUCHAČŮ
1. MANIPULACE S PIPETMANY
2. NALÉVÁNÍ MISEK, ROZTĚRY KULTUR KLIČKOU A HOKEJKOU
KULTIVACE MISEK
3. KONTROLA STERILITY KULTURY KŘÍŽOVÝM ROZTĚREM
4. HODNOCENÍ KULTIVACE MIKROORGANISMŮ CPM
PŘEDPOKLÁDANÉ TEORETICKÉ ZNALOSTI POSLUCHAČŮ
1. MOLÁRNÍ ROZTOKY- PŘEVODY 1M na 1mM
2. OBJEMY 1 ml na 1 l
3. KONCENTRACE (% ní W/V ) ROZTOKY
4. KONCENTRACE (% ní V/V) ROZTOKY
5. SMĚŠOVACÍ PRAVIDLO
Nosit sebou plášť, protokoly, poznámkový sešit, psací potřeby a
kalkulačku.
Podepsat formulář o školení bezpečnosti práce.
PROVOZ A BEZPEČNOST PRÁCE PŘI PRAKTICKÝCH
CVIČENÍCH Z MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE
V laboratoři se:
1. Pracuje v ochranném oděvu, tj. v plášti.
2. Na pracovních stolech jsou pouze pomůcky určené k provádění
zadaných úkolů, tzn., na stolech nesmí být potraviny, nápoje apod.
3. Během cvičení je zákaz kouření, konzumace poživatin a pití
nápojů a rušení hlukem ostatních pracovníků a diplomantů na
katedře.
4. Je třeba dbát pokynů vyučujících, aby nedošlo k poškození
zařízení, pomůcek a znehodnocení chemikálií.
5. Při práci s infekčním materiálem zabránit vzniku alimentární
infekce, tzn., nepipetovat suspenze ústy, ale používat bezpečnostní
nástavce na pipety.
6. Při práci s chemikáliemi typu žíravin, hořlavin a mutagenů
používat bezpečnostní nástavce na pipety, při práci s mutageny
např. s EB používat rukavice, při práci s UV zářením používat
ochranné brýle.
7. Při práci s plynovými kahany dbát na to, aby nedošlo k požáru a
k ublížení na zdraví.
8. Udržovat čistotu na pracovních stolech a v prostorách laboratoře,
důsledně třídit použitý materiál třídit, tzn., sklo odkládat do
plastových kbelíků s dekontaminačním roztokem, zvláště odkládat
kovové zátky, použité plasty tj. špičky odkládat do zvláštních
nádobek a PVC sáčků.
9. Je třeba pracovat s ohledem na vlastní bezpečnost a na prevenci
kontaminace pracovních pomůcek.
10. Při práci s nastavitelnými automatickými pipetami je třeba dbát
toho, aby byly nastaveny v rozmezí povolených hodnot objemů
(nepřetáčet nad ani pod limitní rozsah objemu). Ke každé pipetě
použít vhodnou plastovou špičku.
11. U zmražených vzorků zásobních roztoků (enzymy, lysozym,
lysostafin, antibiotikum apod...) se musí nejprve rozpustit celý
objem a pak teprve provést náběr sterilní špičkou.
12. Při každém náběru enzymů ze zásobního roztoku je třeba
používat vždy nové sterilní špičky!
13. Zásobní roztoky enzymů se uchovávají při –20 °C a při použití je
třeba je mít uložené na ledu. Množství enzymů je určeno
v pracovních návodech a postupech a není vhodné s nimi plýtvat,
jsou drahé. Po náběru lehce otřít špičku o vnitřní stěnu
zkumavky (takto se zbaví přebytečného enzymu zachyceného
vně špičky). Zkumavky s enzymy a zásobními roztoky po
odebrání ihned uzavřít.
14. Směsný roztok fenolu a chloroformu (v poměru 1:1) je
převrstvený vodným roztokem (TE pufr), se kterým se nemísí. Je
třeba nabrat organickou směs pod hladinou TE pufru!
15. Některé roztoky používané pro izolace DNA je třeba připravit
čerstvé a některé je třeba uchovávat při 4 °C a těsně před a
během použití je chladit, nejčastěji na ledu.
16. Při přípravě pracovních roztoků nemísit navzájem koncentráty,
ale postupně přidávat do vodného roztoku a nakonec doplnit
vodou do výsledného objemu.
PŘEHLED KURZŮ A ÚLOH ZÁKLADNÍHO
PRAKTICKÉHO CVIČENÍ Z MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE
1. Bezpečnost práce + podpisy studentů , zásady práce v
laboratoři molekulární biologie, přehled základních pomůcek
a roztoků, výpočty a příprava roztoků. Teorie k izolaci
plazmidové dsDNA.
2. Izolace plazmidové DNA, vektoru pUC 18 z E. coli DH5
3. Stanovení koncentrace DNA spektrofotometricky, restrikční
štěpení dsDNA a PCR
4. Elektroforéza (ELFO) a restrikční mapování
5. Transformace E. coli plazmidovou DNA
6. Příprava sacharózového gradientu a zápočtový test
7. Vyhodnocení protokolů a zápočet.
Úloha 02_1 02_2
Bezpečnost práce (1300
-1430
) 21.2. (1500
-1630
)
1a) Izolace plazmidu 28.2. 7.3.
1b) Měření koncentrace pDNA
2a) Štěpení plazmidu a PCR
14.3. 21.3.
2b) ELFO a restrikční mapování 28.3. 4.4.
3) Transformace 11.4. 18.4.
4) Ultracentrifugace
Zápočtový test
25.4. 2.5.
Zápočet (1300
-1430
) 9.5. (1500
-1630
)
Protokol
➢ Nově k dispozici v IS (na praktikum si přinést vytištěný protokol)
➢ Název úlohy
➢ Princip metody
➢ Materiál
➢ Postup
➢ K doplnění:
▪ jméno, skupina, datum a číslo vzorku
▪ význam roztoků a jednotlivých kroků v postupu
▪ výpočty
▪ odpovědi na otázky
▪ závěr (výstižné, logické a smysluplné vyhodnocení
provedené úlohy)
➢ K přiložení:
▪ Graf absorbance vzorku DNA ze spektrofotometrického měření
(bude vyučujícím vložen do IS, není třeba tisknout)
▪ SPRÁVNĚ popsané elektroforetogramy
(fotografie vložené vyučujícím do IS upravit, popsat, vytisknout a
přiložit k protokolu č. 2)
Vytištěný protokol s přílohami odevzdat vyučujícímu na konci cvičení, příp.
následující praktikum.