POLYMERAZOVA ŘETĚZOVÁ REAKCE (POLYMERASE CHAIN REACTION) PCR PCR umožňuje získat specifickou DNA sekvenci 1983 - Kary Mullis (1993 - Nobelova cena) Metoda pro mnohonásobné zmnožení (amplifikaci) specifického úseku DNA in vitro založená na principu (enzymatické syntézy) replikace DNA. Replikace DNA in vivo vyžaduje mnoho enzymů Replikace DNA in vitro vyžaduje pouze jeden enzym Teoreticky lze získat 2n řetězců (kopií). DS 3_g- DNA i li mim n iiiiiini n mini n n mim i 51-3' DENATURATION ^ 95 °C 31____5' i ■ 111111 ■ i ■ i ■ i Mill 0 ANNEALING P1 P2 ~50 C lllllll.......J J : : I J lllllll'. Aň^vWWVWWWWWvW- EXTENSION o (A) Third cycle PCR - Enzymatická syntéza LJako templát slouží ssDNA, podle níž je syntetizován komplementární řetězec (PCR produkt - amplikon). 2. K zahájení reakce je zapotřebí primer, který se připojuje na komplementární úseky DNA. Tím je zároveň vymezen úsek DNA, který bude amplifikován. K enzymatické syntéze PCR produktu dochází po připojení dvou primem vázajících se na protilehlé řetězce DNA tak, že jejich 3'-OH-konce směřují proti sobě. 3. Jako templáty pro syntézu mohou sloužit oba řetězce dsDNA, po předchozí denaturaci. PCR - Složení reakční směsi 1. Templátová nukleová kyselina (DNA). Množství DNA jako výchozího materiálu je velmi nízké: obvykle postačuje méně než 1 |ug genomové DNA, Kvalita templátu ovlivňuje výsledek PCR. •znečištěný templát může obsahovat inhibitory PCR Zdroj: mikroorganizmy buňky z tkáňových kultur, tělní tekutiny, bioptické vzorky, stery vlasy, atd... 2. Primery. Syntetické oligonukleotidy o velikost 18-25 nt. 3. dNTP ve formě Na+ nebo Li+ solí 4. Mg2+ ionty tvoří rozpustný komplex s dNTP a vytvářejí substrát, který rozpoznává DNA polymeráza. 5. Termostabilní DNA polymeráza, která odolává teplotám až 98 °C. Taq Thermus aquaticus (S^-exonukleáza) Tth Thermus thermophilus (S^-exonukleáza) delší úseky Pwo Pyrococcus woesei (S^-exonukleáza) PCR - Podmínky standardní PCR reakce 1. Počáteční denaturace DNA. Důležitá je kompletní denaturace templátu, obvykle postačuje zahřátí směsi na 2 - 5 min / 95 °C. V případě, že dojde pouze k částečné denaturaci, molekuly DNA velice rychle renaturují a to vede k nespecifické vazbě primerů a možným falešným výsledkům. 2. Denaturační krok (oddělení řetězců):94 - 95 °C / 20 - 45 s. Nedostatečně denaturovaná DNA neumožňuje přístup primerům, naopak příliš dlouhá denaturace snižuje aktivitu DNA polymerázy (~ 2 hod / 98 °C). 3. Připojení primerů (55 - 65 °C / 30 - 90 s) teplota určuje specifičnost a závisí na Tm primem a templátu. Ta se optimalizuje v teplotním gradientu. 4. Prodlužování primem (syntéza PCR produktu) probíhá při 72 °C /45 - 90 s. Taq DNA polymeráza syntetizuje DNA při této teplotě rychlostí cca 60 bází/s. Nově syntetizované řetězce slouží jako templáty pro další cyklus. PCR se provádí se v termocyklérech, v 25 - 35 cyklech. 5. Závěrečná extenze se provádí obvykle po posledním cyklu (72°C / 5 min) a slouží k dokončení syntézy a renaturaci jed n o řetězcových produktů. Proces amplifikace Denaturace vzorku DNA Pro oddělení jednořetězců (94 °C, 5 min) ^Připojení primerů na řetězce DNA (30 - 65 °C, 1 min) Denaturace pro separaci řetězců DNA (94 °C, 30 s) Počet cyklu 25 - 35 x Syntéza nových řetězců DNA polymerázou (72 °C, 45s- 2 min) PCR - Optimalizace složek PCR DNA. Pro standardní PCR se doporučuje následující množství DNA podle velikosti templátu: lidská genomová DNA: 100 - 500 ng bakteriální DNA: 1 - 10 ng plazmidová DNA: 0,1 - 1 ng Primery. Sekvence a koncentrace primem významně ovlivňuje výsledek PCR. Optimální koncentrace je mezi 0,1 a 0,6 |uM. Nižší koncentrace vede k předčasnému vyčerpání primem a snížení výtěžku. dNTP. Výsledná koncentrace se může pohybovat v rozmezí 50 - 500 jlxM (pro každý nukleotid) Nejběžnější koncentrace dNTP je 200 mM. Při zvýšení koncentrace dNTP je třeba zvýšit koncentraci Mg2+ iontů. PCR - optimalizace koncentrace MgCI2 MgCI2 Volné Mg2+ ionty ovlivňují aktivitu enzymu a zvyšují hodnotu Tm u dsDNA. Pro dosažení nejlepšího výsledku vždy stanovujeme koncentraci Mg2+ experimentálně. Optimální koncentrace může kolísat od 1 mM do 5 mM Nejčastěji používaná koncentrace je 1,5 mM (pro 200 mM dNTP) CM CM Cl E El E E £ E ID w> I o in o o" *" ** O. oí cl co co PCR - optimalizace reakce DNA polymeráza. Obvyklá koncentrace je 0,5 - 2,5 jednotek / 50 jlxI. pH je dané reakčním pufrem, obvykle odpovídá pH 8,3 ■ 9,0. Příklad složení pufru pro PCR: 10 mM Tris; pH 8.3 50 mM KCI 1,5 mM MgCI2 Přídatné látky mohou v některých případech ovlivnit účinnost a specifičnost PCR reakce. Jejich vliv se obvykle určuje experimentálně: albumin z bovinního séra (BSA) (100 ng/50 |jl) dimetylsulfoxid (DMSO) (2-10 % v/v) - redukce nespecifické vazby primem detergenty (Triton X-100, Tween 20) Minerální olej - zabraňuje vypařování během reakce PCR - optimalizace teploty Teplota pro připojení primem (annealing temperature) zkr.Ta. Teplota používaná pro teplotní hybridizaci molekul primem a matricové DNA in vitro. Orientačně lze vypočítat Ta podle vztahu: 7a = 2(AT) + 4(GC) - 5 °C = Tm - 5 °C kde AT je počet AT-párů a GC je počet GC párů v sekvenci Ta = 0.3 x(Tm of primer) + 0.7 x(Tm of product) - 25 Návrh primerů http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ Enter accession, (ji, or FASTA sequence (A refseq record is preferred) i@ Clear Range Forward primer Reverse primer From To Or, upload FASTA file Procházet... Soubor nevybrán. ■Q Clear PCR product size ° of primers to return Primer melting temperatures 70 1000 10 Milt Opt Max Tm diffeience 57.0 60.0 63.0 3 m Specificity check Search mode Database 0 Enable search for primer pairs specific to the intended pcr template® Automatic Refseq mRNA Organism Homo sapiens Enter an organism name, taxonomy id or select from the suggestion list as you type.@ - netvoří sekundární struktury, nejsou komplementární navzájem, nemají více vazebných míst na DNA, ... Chybovost PCR Taq polymeráza - chyba s frekvencí 2x10-4 - problém při klonování DNA —> mutace - buňka má opravné mechanismy - In vitro - použití dvojice DNA polymeráz, z nichž jedna má schopnost proofreading IU rZLL; a VJMWA JUU 1—F\ 5' Incorporation of G instead of A 3' 5' i - Polymerase excises mismatched C via 3'—*~5' exonuclease V_ 5'j Synthesis proceeds with incorporation of correct base (A) vv a v v v THE CELL, PduiIJS e,*rjDjrr Figura G.ll .\KM ir,- *r.> ,m fisrjx .v'.. Inr Multiplex PCR (mnohonásobná PCR) Při použití více párů specifických primerů, dochází k amplifikaci více cílových sekvencí v jedné reakci. - stanovení několika mikroorganismů v jediné reakci S 1 2 3 4 5 6 78 9 10 1112 13 141516 17 18 PCR-využití metod PCR 1. Základní výzkum izolace genů nebo jejich částí sekvencování DNA mutageneze in vitro modifikace konců DNA analýza (selekce) klonů z genových knihoven příprava značených sond 2. Aplikovaný genetický výzkum prenatální diagnostika (dědičných chorob) detekce mutací v genech studium polymorfizmu genů populační genetika 3. Využití v klinických disciplinách detekce patogenních mikroorganizmů (baktérií, virů, prvoků, hub) identifikace onkogenů typizace nádorů stanovení pohlaví 4. Využití v praxi archeologie soudnictví kriminalistika Složení PCR reakce: destilovaná voda 16,5 ul lOx PCR pufr 2,5 ul 1 OmM směs dNTP 0,5 ul 20uM forward primer 2ul 20uM reverse primer 2ul 100 ng plazmidové DNA 1 ul Taq polvmeráza (5U/ul) 0,5 ul celkem 25 ul