PROVOZ A BEZPEČNOST PRACE PRI PRAKTICKÝCH CVIČENÍCH Z MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE
V laboratoři se:
1. pracuje v ochranném oděvu, tj. v plášti + prezuvky
2. Na pracovních stolech jsou pouze pomůcky určené k provádění zadaných úkolů + návody + kalkulačka
3. Během cvičení je zákaz kouření, konzumace potravin a pití nápojů
4. Je třeba dbát pokynů vyučujících, aby nedošlo k poškození zařízení, pomůcek a znehodnocení chemikálií
5. Při práci s chemikáliemi typu žíravin, hořlavin a mutagenů
používat rukavice, při práci s UV zářením používat ochranné brýle, při práci s horkým roztokem v kádince používat ochranné rukavice
6. Udržovat čistotu na pracovních stolech a v prostorách laboratoře, důsledně třídit použitý materiál
7. JAKÝKOLI ÚRAZ IHNED NAHLÁSIT VYUČUJÍCÍMU
ZÁSADY PRO PRÁCI V MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÉ LABORATOŘI
1. Je třeba pracovat s ohledem na vlastní bezpečnost a na prevenci
kontaminace pracovních pomůcek.
2. Při práci s nastavitelnými automatickými pipetami je třeba dbát toho, aby byly
nastaveny v rozmezí povolených hodnot objemů (nepřetáčet nad ani pod limitní rozsah objemu). Ke každé pipetě použít vhodnou plastovou špičku.
3. U zmražených vzorků zásobních roztoků se musí nejprve rozpustit celý objem a pak teprve provést náběr sterilní špičkou.
4. Při každém náběru enzymů (roztoků) ze zásobního roztoku je třeba používat vždy nové sterilní špičky! Špičky po použití vyhazujeme do určených odpadních nádobek.
5. Zásobní roztoky enzymů se uchovávají při -20 °C a při použití je třeba je mít
uložené na ledu. Po náběru lehce otřít špičku o vnitřní stěnu zkumavky
(takto se zbaví přebytečného enzymu zachyceného vně špičky). Zkumavky s enzymy a zásobními roztoky po odebrání ihned uzavřít.
Přehled úloh řešených v praktiku
Izolace plazmidové DNA
Stanovení koncentrace DNA spektrofotometricky Reštrikční štěpení plazmidové DNA
Elektroforéza + reštrikční mapování genomové DNA
Transformace E. coli plazmidovou DNA
Příprava sacharózového gradientu a PCR
Izolace genomové DNA
Zápočtový test a zápočet
Kritéria pro zápočet
Absolvování všech úloh
Úspěch u malých testů během jednotlivých cvičení Odevzdané správné protokoly
-jméno, datum, název úlohy, stručně princip, „postup", výsledek, závěr
Zápočtový test
Příklady
Příprava roztoků Ředění roztoků Procenta versus molarita Počítání nejen roztoků
Jak připravíte 50 ml 2M roztoku NaCI (MW-58)?
Jak z tohoto 2M roztoku připravíte 100ml 0,5M?
Kolika procentní (w/v) je 2M roztok NaCI?
Určete jaké množství zásobního roztoku ampicilinu o koncentraci 100 mg/ml, se musí přidat do 100 ml LB bujónu, aby byla jeho výsledná koncentrace 100 |jg /ml.
V mikrozkumavce máte krev s 8 miliony leukocyty/1ml. Kolik ul krve použijete pro reakci, ve které musíte pracovat s 1 milionem leukocytu?
Plazmidy
Extrachromozomální molekuly dsDNA
Replikace nezávisle na bakteriálním chromozomu
Pro replikaci potřebují enzymy a proteiny hostitelské buňky
Udržují se v bakteriích v určitém počtu (1 až mnoho)
Při buněčném dělení přechází nezávisle do dceřiných buněk
Nesou geny poskytující bakteriím nějakou selekční výhodu (rezistence)
ori- počátek replikace inc- připojení na membránu
Využití - přenos dědičné informace - ovlivnění genové exprese
- konstrukce mutantů
_w =00    —__>
I   i   I . mM^r   ^cíC:^coQ.a3oocjooo Q -c; -Q c o c: .
Izolace a purifikace NK
Růst buněk - vhodné médium
- event. odběr tkáně, rostlinky, ...
- izolace plazmidové DNA - ANTIBIOTIKUM
Lyže buněk - detergenty (dodecylsulfát sodný)
- enzymy (lysozym)
- mechanicky (drtiče, homogenizátory)
- sonikace
- varem
- opakované zamražení/zmražení
- kombinace více metod
Izolace a purifikace NK
Odstranění RNA - RNáza
Ribonucleic Acid Base A = Cytosine or Uracil
3'-Phosphate nucleotides
Izolace a purifikace NK
Phase separation Isopropanol precipitation
Deproteinace - fenol a chloroform
- enzymy (proteinaza K)
- chromatografie
- ultracentrifugace v gradientu CsCI
„Srážení DNA" - vychlazené roztoky alkoholů - etanol
- izopropanol
Rozpuštění (případně eluce) DNA
- 10 mM Tris, pH=8
- TE pufr, pH=8 (10 mM Tris, 1 mM EDTA)
Izolace plazmidové DNA - postup
Naočkovat jednu bakteriální kolonii do LB média s ampicilinem (100 jig/ml). Inkubovat přes noc při 37°C.
Přenést bakteriální kulturu do mikrocentrifugační zkumavky a centrifugovat při 5 000 RPM/5 min/4 °C.
Odpipetovat supernatant a sediment resuspendovat ve 200 \i\ pufru P1
s přídavkem RNAzy ve výsledné koncentraci 100 jig/ml a lysozymu 500 |ug/ml.
Přidat 200 jal roztoku P2. Opatrně promíchat několikerým převracením zkumavky. Inkubovat 5 minut (ne déle) při pokojové teplotě.
Přidat 200 jal vychlazeného roztoku P3. Promíchat několikerým převracením zkumavky. Zkumavku umístit na led na 10 minut. Centrifugovat při 10 000 RPM/10 min/4 °C.
Supernatant přenést do čisté mikrocentrifugační zkumavky, přidat 1/10 objemu 3M octanu sodného, promíchat a DNA srážet 2 objemy vychlazeného 96% etanolu 10 minut při teplotě -80 °C. Centrifugovat při 10 000 RPM/10 min/4 °C.
Opláchnout sediment 1ml 70% etanolu, inkubovat 5 minut
Odstranit roztok etanolu, sediment osušit a rozpustit ve 40 |ul TE pufru
Složení a funkce roztoků
Ampicilin -100 mg/ml, penicilinové antibiotikum, blokuje syntézu buněčné stěny
Lysozym - 10 mg/ml, enzym - manipulace na ledu, rozklad polysacharidu buněčné stěny bakterií
RNáza - 10mg/ml, enzym - manipulace na ledu, degradace RNA
P1 - 50mM glukóza, 25mM Tris-HCI (pH 8,0), 10mM EDTA
- pufr, EDTA je inhibitor nukleáz, váže dvojmocné ionty Mg2+, které působí jako kofaktory nukleáz
P2-0,2M NaOH, 1%SDS
- lyzační, zvyšuje pH, denaturace chr. IdsDNA, plazmidová cdsDNA denaturuje částečně a reverzibilně
P3 - 5M octan draselný, pH = 5,2
- neutralizuje hydroxid, renaturace DNA, srážení proteinů
3M octan sodný - zvyšuje iontovou sílu roztoku, usnadňuje srážení DNA 96% etanol - sráží DNA
70% etanol - odstraňuje soli ze sedimentu DNA (přecházejí do vodné fáze 70% etanolu)
Izolace pomocí chromatografických kolonek
- komerční kolonky - různé objemy (ml až stovky ml)
- membrána z materiálu schopného vázat NK (silica, DEAE, ...)
- vazba ovlivněna podmínkami (pH pufru, konc. solí)
Postup:
1. Lyže
2. Srážení proteinů + genomové DNA
3. Odstranění sraženiny
4. Vazba DNA na kolonce
5. Promytí
6. Eluce čisté DNA