Separace molekul nukleových kyselin centrifugací Centrifugace se používá v molekulární biologii k izolaci, čištění a charakterizaci biopolymerů a nadmolekulárních útvarů. Přináší též informace o vznášivé hustotě a sedimentačním koeficientu, pomocí kterého lze za určitých podmínek vypočítat molekulovou hmotnost biopolymeru. Během centrifugace působí na částici odstředivá síla F1 = m 2 r = 2πn n = rpm - úhlová rychlost n – počet otáček d =hustota částice = hustota kapaliny F2 = vztlak F3 = třecí síla (odpor prostředí) Relativní odstředivá síla RCF = m 2 r m . g = 2 r g (jednotka = g) RCF se uvádí v násobcích gravitačního zrychlení g nebo počtem otáček za minutu. g = 980 cm/s2 RCF = 1.119 . 10-5 . n2 . r Parametry centrifugace se nejčastěji vyjadřují relativní odstředivou silou RCF. Rozdělení centrifugačních technik a) Diferenciální centrifugace - separace směsi heterogenních částic v homogenním roztoku b) Zonální centrifugace - separace směsi částic s podobnými vlastnostmi v gradientním roztoku Izokinetická – podle rychlosti sedimentace - stanovení sedimentačního koeficientu Izopyknická – podle hustoty částic - stanovení vznášivé hustoty ZÁKLADNÍ TYPY CENTRIFUGACE zonální centrifugace v hustotním gradientu Diferenciální centrifugace částice s různou velikostí, hmotností – jiná rychlost sedimentace Opakovaná centrifugace se zvyšujícími otáčkami – frakce př. buněčná jádra, ribozomy, mitochondrie … Izokinetická centrifugace Vhodné podmínky – konstantní rychlost sedimentace Vzorek nanášíme na povrch gradientu Rychlost sedimentace ovlivněna - velikost, tvar - hustota - vlastnosti prostředí - podmínky centrifugace Využití k charakterizaci částic – př. určení velikosti př. sacharózový gradient – 16S rRNA, 5S rRNA Stanovení sedimentačního koeficientu Hodnota sedimentačního koeficientu se udává ve Svedbergových jednotkách 1 S =10-13 s. Využití: charakterizace informačních makromolekul buněčných organel apod. Hodnoty S (v rozpětí 10-13 - 200 × 10-13) např. 30S = 30 × 10-13 s 23S RNA, 16S RNA, nebo ribozómy 30S, 50S Sedimentační koeficient dr/dt = S× 2 × r r - vzdálenost částice od osy otáčení t - doba centrifugace S - sedimentační koeficient - úhlová rychlost rotoru Příprava lineárního sacharózového gradientu Izopyknická centrifugace Na začátku může být směs látek Během centrifugace se samovolně vytváří koncentrační (hustotní) gradient – částice se pohybují oběma směry dokud nedosáhnou polohy, kdy je jejich hustota shodná s hustotou roztoku Gradient CsCl - separace různých forem plazmidové DNA (ccc vs oc vs lineární) - separace molekul DNA s různým množstvím G+C