GelovGelováá elektroforelektroforéézaza -- GELY
Jako nosiče se používá agaróza (100 – 50 000 bp)
nebo polyakrylamid (10 – 1 000 bp)
nosiče vytvářejí síťovou strukturu polymerních molekul s póry
Agaróza je lineární polymer (původ z mořské řasy)
Separace biomolekul (proteinů, NK) v gelech
Polyakrylamid
Velikost pórů lze ovlivnit složením roztoku a koncentrací polymeru
Optimální velikost separovaných molekul
– agarózové gely 100 bp až 50 000 bp
– polyakrylamidové 10 až 1000 bp
0,005 – 0,2 kb4,0%
0,05 – 0,5 kb3,0 %
0,1 – 2 kb2,0 %
0,2 – 3 kb1,5 %
0,4 – 4 kb1,2 %
0,5 – 7 kb0,9 %
0,8 – 10 kb0,7 %
1 – 20 kb0,6 %
5 – 60 kb0,3 %
Rozsah dělení ds DNAKoncentrace agarózy
PAGE gely
– rozlišení až 1 nukleotid - sekvenace
Uspořádání elektroforézy
- Horizontální (agarózové gely)
- Vertikální (PAGE)
PrincipPrincip DNA ELFODNA ELFO
pohyb DNA s negativním nábojem v neutrálním gelu
a elektroforetickém pufru v elektrickém poli k anodě
SloSložžky geluky gelu
+
- jamkyjamky
DNADNA
ELFO pufry:ELFO pufry:
TRISTRIS--acetacetáátový (TAE): 0,04 M Tristový (TAE): 0,04 M Tris--acetacetáát, 0,002 M EDTAt, 0,002 M EDTA
TRISTRIS--fosffosfáátový (TPE): 0,08 M Tristový (TPE): 0,08 M Tris--fosffosfáát, 0,008 M EDTAt, 0,008 M EDTA
TRIS-borátový (TBE): 0,089 M Tris-borát, 0,089 M kyselina boritá, 0,002 M EDTA
AGARÓZOVÁ GELOVÁ ELEKTROFORÉZA – příprava gelu
Nanášecí (barvící pufr) - 6× koncentrovaný
- barevný
- Hustý - 40% (w/v) sacharóza
- Ficol 400
- glycerol
Faktory ovlivňující rychlost migrace v gelu
• Konformace DNA
• Složení elektroforetických pufrů (iontová síla-TAE a TBE)
• Složení bazí a teplota (u PAGE)
• Přítomnost interkalačních barviv
• Směr elektrického pole (PFGE > 50 kb)
• Napětí (5V/cm)
• Koncentrace gelu
• Velikost DNA
Pohyb fragmentů DNA v gelu a jejich separace
Metody detekce
• Interkalační barviva (ethidium bromid)
• Indolová a imidazolová barviva (DAPI)
• Stříbro
• Kyaninová barviva (SYBR Gold, SYBR Green)
• Radioaktivní značení NK
Ethidium bromid
Mutagen a karcinogen
Interkalace do dsDNA (vazba i na helixy ssDNA a RNA)
Po interkalaci – 20-30x větší flourescence (fixní pozice v DNA)
Transiluminátor (UV ~ 302 nm), EtBr-DNA emise 590 nm
Citlivost 1-5 ng
Postup přípravy gelu pro ELFO a nanášení vzorků
• Navážit agarózu a smíchat s 1×TAE pufrem, tak
aby vznikl 1% gel
• Rozvařit agarózu v mikrovlnce.
• Opatrně promíchat a vytemperovat na 50 °C
• Nalít do tvořítka, tak, aby nevznikly bubliny a výška
gelu odpovídala 5 mm
• Nechat gel utuhnout (20 - 30 min)
• Přelít gel 1 × konc. TAE pufrem
• Opatrně vysunout hřeben z gelu
• Nanášet vzorky do kterých byl přidán nanášecí pufr
• Provést elektroforézu
Plazmid pUC18 -2,69 kbp
OCOC
Lds DNALds DNA
CCCCCC
RNARNA
bpbp
10 00010 000
3 0003 000
2 0002 000
1 0001 000
500500
100100