• Spektrofotometrické stanovení koncentrace DNA je založeno na poznatku, že roztoky DNA pohlcují UV záření. • Záření je pohlcováno pyrimidinovými a purinovými bázemi DNA. Dochází k excitaci jejich chemických vazeb, což má za následek postupnou degradaci DNA. Absorpční maxima jednotlivých nukleotidů se navzájem poněkud liší: dATP ... 259 nm, dCTP ... 271 nm, dGTP ... 253 nm, dTTP ... 267 nm. DNA absorbuje maximálně UV záření o vlnové délce 260 nm. • Množství pohlceného UV záření je přímo úměrné koncentraci DNA v roztoku a vyjadřuje se hodnotami absorbance • Bez problémů pro roztoky čisté DNA • Při izolaci DNA - kontaminace proteiny, aromatické aminokyseliny také absorbují v UV oblasti • Kontaminaci RNA nejsme schopni obvykle pomocí UV spektrofotometrie odlišit (agarózová elektroforéza) • Výhodou spektrofotometrického stanovení je jeho přesnost a současná možnost posoudit čistotu preparátu. Čistotu DNA lze stanovit z poměrů absorbancí při různých vlnových délkách. Pro čistou DNA platí tyto hodnoty: • A280/A260 = 0,550 A260/A280 = 1,8 až 1,9 • A230/A260 = 0,455 A260/A230 = 2,20 • Stupeň znečištění DNA lze posoudit rovněž proměřením absorbance vzorku v rozsahu vlnových délek 230 - 300 nm a vyhodnocením získané křivky. n—i—i—l—i—I—i—i—i—i—i—r 230 240 250 260 270 260 290 300 310 320 330 340 Wavelength (nm) STANOVENÍ KONCENTRACE A ČISTOTY DNA SPEKTROFOTOMETRICKA METODA Je to vhodná metoda pro měření vzorků nukleových kyselin, které jsou dostatečně čisté bez významného množství kontaminant. Nukleové kyseliny absorbují UV záření s maximem absorbance v oblasti vlnové délky okolo 260 nm. Z hodnot optické hustoty lze koncentraci a čistotu vzorku stanovit podle empirických vztahů. množství vcházejícího světla A = log množství světla propuštěného Nejpřesnější je stanovení absorbance v rozmezí od 0,1 do 1,0. SPEKTROFOTOMETRICKA METODA - 2 Při stanovení koncentrace DNA platí: ds DNA A260 = 1 odpovídá 50 u.g/ml ss DNA A260 = 1 odpovídá 33 u.g/ml Oligonukleotidy A260 = 1 odpovídá 20 ng/ml ss RNA A260 = 1 odpovídá 40 |ig/ml Tyto vztahy platí pro optickou dráhu 1 cm (šířka kyvety) Stupeň čistoty nukleových kyselín se stanovuje z pomeru absorbance pri 260 a 280 nm. Pro DNA platí: A260/A280 = 1,80 až 1,90 Pro RNA platí: A260/A280 = 1,90 až 2,1 proteiny a aromatické 1 >85 masivní látky (fenol) kontaminace RNA PŘEČIŠTĚNI VZORKU DNA • odstranění fenolu: dialýza, extrakce chloroformem • odstranění proteinů: opakovaná deproteinace chloroformem. Lze použít rovněž enzymové degradace proteinů pomocí pronázy nebo proteinázy. Přečištění na chomatografických kolonkách. • odstranění RNA: enzymová degradace pomocí RNázy Alternativní metody • Využití flouroforů, které se váží na DNA a intenzita jejich fluorescence je úměrná koncentraci DNA-vysoká citlivost • Využití v např. v lyzátech buněk (silné znečištění proteiny -vazba na DNA musí bý specifická) • př. Hoechst 33342, ethidium bromid, PicoGreen, ... • Měříme proti nějakému standardu o známé koncentraci Hoechst 33342 R = CH2CH3 Figure 1. Chemical structure of Hoechst 33258 and Hoechst 33342 used in this study • Necitlivé na znečištění ale zároveň nás na znečištění neupozorní Postup měření koncentrace DNA Plazmidovou DNA nejprve důkladně promíchejte, a nařeďte 5 x v TE pufru - výsledný objem 10 jlxI Změřte jeho koncentraci na Nanodropu (objem 2 ul) Určete koncentraci a čistotu DNA v původním neředěném vzorku Enzymy, jejichž substrátem jsou NK A. Podle typu substrátu - DNA enzymy - RNA enzymy B. Podle typu reakce - enzymy syntetizující NK (anabolické) = polymerázy - enzymy odbourávající NK (katabolické) = nukleázy - enzymy modifikující NK - enzymy spojující molekuly NK = ligázy DNA Nukleázy rozkládaná molekula typ degradace název enzymové třídy specifita Příklad zdrojový organismus DNA od konců Exonukleázy ss Exonukleáza III E. coli ds Bal 31 Alteromonas espejiani uvnitř molekuly Endonukleázy ss SI nukleáza Aspergillus oryzae ds reštrikční endonukleázy bakterie DNáza I Hovězí Pankreas Štěpení DNA restrikčními endonukleázami Reštrikční endonukleázy (restriktázy - zkr. RE) sekvenčně specifické endonukleázy štěpící fosfo-diesterovou vazbu DNA v určité sekvenci nukleotidů (často palindromy). Původ: produkty bakterií EcofíX {Escherichia coli) - 37° C (kmen/serotyp) Sma\ (Serratia marcescens) - 25 °C Maelll (Methanococcus aeolicus) - 55 °C Funkce: odbourávání cizorodé DNA (např. fágy). - vlastní DNA chráněna metylací Typy RE: I, II,.... Typ II: na dsDNA má stejné rozpoznávací místo (4-8 bp) s místem štěpení. EcoRI 5'- G IA A T T C- 3'. 3'- C T T A A G- 5' Orientace je důležitá 5 ... NGAATTCN... 3 ... NCTTAAGN... 5 ... NCTTAAGN... 3 ... NGAATTCN... EcoRI WĚ^ ... NG ... NCTTAAp pAATTCN... GN... ... NCTTAAGN... ... NGAATTCN... (no digestii 5 ... NCTTAAGN... 3 ...NGAATTCN... Afin ma^ .. NC NGAATTp pTTAAGN... |CN... 5GAATTC 3^ EcoRI má relaxovanou specifitu - za neoptimálních podmínek může 5'GGATTC 3' štěpit DNA v příbuzných sekvencích 5GGATTT 3' (HF - high fidelity mutanti) 5 AGATTT 3 3 typy RE-fragmentů: • a) s tupými konci • b) přesahujícími 5"- konci • c) přesahujícími 3A- konci EcoR\ Psft 3' □ □ G □ 3' G LJ □ 5' i Smal CCCGŮGÉID 3' 5" □ 3' Sticky ends 3' 5' □ ■ m Č Č Č 5r 3 3' I 5' 3' □ G G G - 5 3' Blunt ends CCC0D 5' Reštrikční štěpení DNA Jednotka enzymu = množství RE, které rozštěpí 1 mg dsDNA (obvykle DNA fága I) za 1 hod. při optimální teplotě a optimálních podmínkách uvedených pro každou RE IZOSCHIZOMERY - různé restriktázy se stejným rozpoznávacím místem Isoschizomers I 'roducts + Kas] .;'! pH G pGCGCG "' (4 bp 5'overhang) il CCGCGp 5' ...GGCGCC., 3' ...CCGCGG... GG pCGCC... CCGCp ~| GG + Narl (2 bp 5'overhang) Klíčové faktory pro průběh reakce Teplota Iontová síla Složení restrikčních pufrů Pufr NaCl Tris.Cl (pH 7,5) MgCl2 Nízká iontová síla 0 10 mM 10 mM Střední iontová síla 50 mM 10 mM 10 mM Vysoká iontová síla 100 mM 50 mM 10 mM Složky restrikčního pufru Výsledná koncentrace v mM (1:10 řeď. pufru) A B L M H Tris acetate 33 - - - - Tris-HCL - 10 10 10 50 Mg-acetate 10 - - - - MgCI2 - 5 10 10 10 K-acetate 66 - - - - NaCl - 100 - 50 100 Dithioerythritol (DTE) - - 1 1 1 Dithiothreitol (DTT) 0,5 - - - - 2-Mercaptoethanol - 1 - - - pH při 37 °C 7,9 8,0 7,5 7,5 7,5 Pufry a enzymy se uchovávají při -20 ®C Pracujeme s nimi na ledu Štěpení více restriktázami R1 i R2 ve stejném pufru R1 R2 pufr s nízkou iont silou.. pufr s vyšší iont. silou Využití restrikčního štěpení: RE- spektra - DNA otisky - stanovení příbuznosti Reštrikční mapování Příprava molekulárních sond - hybridizační sondy Klonování DNA Detekce mutací a polymorfismů Úloha 3 Hindlll - 5'...A^AGCTT...3' 3'...TTCGA^A...5' Smal- 5. ..C CC 3'... GGG GGG...3' CCC .. .5' Reakční smés (20 ul): voda ? ul lOx puf r 2 ul DNA lug enzým 5U