SKRIPTA KE CVIČENI Z OBECNÉ MIKROBIOLOGIE, CYTOLOGIE A MORFOLOGIE BAKTERIÍ Mgr. Jana Kopecká, Ph.D. Mgr. Gabriela Rotková, Ph.D. MASARYKOVA UNIVERZITA ELPORTÁL ii Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity Ústav experimentální biologie Vytvořeno ve spolupráci se Servisním střediskem pro e-learning na MU, http://is.muni.cz/stech/. Tiskový výstup publikace vydané na Elportále MU (http://elportal.cz/) http: //is.muni.cz/elportal/?id=111222 © 2017 Masarykova univerzita Obsah Úvod v Zásady bezpečné práce v mikrobiologické laboratoři vi I Obecná mikrobiologie 1 1 Příprava živných médií, kultivace mikroorganizmů, aseptická práce 2 2 Metody sterilní práce, očkování a uchovávání mikroorganizmů 8 3 Mikroorganizmy kolem nás 18 4 Úvod pro práci s mikroskopem 21 5 Makroskopické a mikroskopické pozorování mikroorganizmů, Gramovo barvení 27 6 Bakteriofág 37 7 Bakteriofág transdukce 42 8 Nepřímé stanovení počtu životaschopných bakterií plotnovou metodou 45 9 Přímé stanovení počtu buněk v Bůrkerově komůrce, vitální test, kvasinky 50 10 AP-test (test acidifikační schopnosti) 54 11 Fyzikální a chemické prostředky kontroly růstu mikroorganizmů 57 12 Vliv některých barviv a alkoholických nápojů na růst bakterií 64 13 Stanovení citlivosti mikroorganizmů k antibiotikům, stanovení koncentrace antibiotik 69 14 Bakteriociny 77 15 Průkaz a izolace některých půdních mikroorganizmů 80 16 Winogradského kolona 86 17 Pozorování bakteriálních endospor a jejich barvení, negativní barvení 89 18 Základní mikrobiologický rozbor vody 99 19 Úvod do identifikace bakterií, biochemické testy a standardizované identifikační systémy 107 iv_OBSAH II Cytologie a morfologie bakterií 117 1 Gramovo barvení, negativní barvení, nativní preparát 118 2 Struktury buňky (barvení inkluzí a pouzder) 126 3 Pohyb buněk 131 4 Acidorezistentní barvení 136 5 Sklíčkové kultury 139 6 Fluorescence 144 Úvod Bakterie, viry a kvasinky nepatří do stejné taxonomické rodinky. Se všemi se seznámíme a možná se i něco přiučíme. V praktiku je nutné aseptický pracovat, abychom se mohli z hezkých výsledků radovat. Při plotnové metodě by měly být výsledky ve shodě. Míchat vzorek se vždy musí, každý si to prakticky zkusí. Inhibiční zóny vznikají, když citlivé bakterie se s antibiotiky setkají. Při vitálním barvení docházíme k zjištění, barvu nepřijme buňka živá, protože je její membrána funkční a celá. Pokud s fágy pracujeme, pak i bakterie potřebujeme, aby se fágy mohly pomnožit a fázový lyzát či plaky vytvořit. Buď pozitivní modré či negativní červené, jsou buňky po „Gramoví" zbarvené. Při rozboru vody mají bakterie hody, kultivujeme je na selektivním médiu, a někdy vzorek médiem zaleju. Jde nám o enterokoky a bakterie koliformní, ve vodě není vhodný jejich výskyt enormní. Postupná identifikace a testy základní jsou pro správné určení vždycky to zásadní. Zásady bezpečné práce v mikrobiologické laboratoři 1. Vstup do laboratoře je povolen pouze osobám vykonávajícím cvičení. 2. V laboratoři vykonávejte pouze práci stanovenou obsahem cvičení. 3. V laboratoři je zakázáno jíst, pít a kouřit. 4. V laboratoři je nutné používat laboratorní plášť a prezuvky. 5. V laboratoři je zakázáno otevírat okna. Větrání je zajištěno pomocí klimatizace. 6. Před příchodem do laboratorního cvičení se seznamte s jeho obsahem. 7. Před započetím a po ukončení práce je třeba dezinfikovat pracovní plochu, umýt si a dezinfikovat ruce. 8. Na pracovní plochu pokládejte co nejméně osobních věcí. Na pracovní ploše může snadno dojít k jejich kontaminaci. Oblečení, batohy a tašky odkládejte v šatně. 9. Pracujte pečlivě a opatrně. Zabráníte tím kontaminaci materiálu a náhodnému potřísnění pracovní plochy a sebe mikrobiálními kulturami. 10. Nedotýkejte se zbytečně rukama obličeje, nenanášejte v laboratoři kosmetiku, nemanipulujte s kontaktními čočkami. 11. Při barvení mikroorganizmů používejte jednorázové ochranné rukavice, pokud je to možné, pracujte v digestoři. Ochranné rukavice není nutné používat při manipulaci s mikroorganizmy, pokud se však budete cítit bezpečněji, použijte je. 12. Kahany nechávejte hořet pouze po dobu, kdy je užíváte. 13. Použité sklo a zbytky mikrobiálních kultur odkládejte na určená místa. V žádném případě nevylévejte kultury do odpadu! Veškerý kontaminovaný materiál je před likvidací a mytím nutno dezinfikovat nebo sterilizovat (týká se i rozbitého skla), případně vyhodit do koše na nebezpečný odpad (např. buničitá vata použitá k likvidaci rozlité kultury). 14. Dojde-li k náhodnému potřísnění pokožky mikrobiální kulturou či poranění pokožky, oznamte tuto skutečnost ihned vyučujícímu. Pokožku je nutno ošetřit vhodným dezinfekčním prostředkem (ajatin, Septoderm), aby nedošlo k infekci. 15. Stejné zásady jako v bodě 14 platí i v případě znečištění pracovní plochy nebo pracovního oděvu. 16. V případě jakékoli nejistoty se informujte o správném postupu u svého vyučujícího. 17. Označte všechna média a kultury ve zkumavkách, baňkách a Petriho miskách názvem média a kultury, svým jménem a pracovní skupinou. Misky popisujte na dno! K označení používejte popisovače na sklo. 18. Všechny pracovní postupy, obzvláště pak použité bakteriální kultury, množství pipetovaných roztoků a postupy při ředění si pečlivě zaznamenávejte. 19. Po ukončení práce odneste použité pomůcky na určené místo, ukliďte pracovní plochu a vydezinfikujte ji dezinfekčním roztokem. 20. Před odchodem ze cvičení si dobře umyjte ruce a vydezinfikujte dezinfekčním prostředkem. V případě, že potřebujete krátkou přestávku v průběhu cvičení, umyjte a vydezinfikujte si ruce před opuštěním laboratoře. Část I Obecná mikrobiologie 1 Příprava živných médií, kultivace mikroorganizmů, aseptická práce Cíl cvičení Příprava a sterilizace živných médií (agar na Petriho miskách, šikmý agar a bujón). Seznámení se se zásadami aseptické práce v laboratoři. Úvodní slovo Zásady přípravy mikrobiologických půd Nutno pracovat se sterilním nádobím ve sterilním prostředí, co nejrychleji na úkor objemové přesnosti (tzv. aseptická práce). Ožehávat hrdla baněk i zkumavek. Při práci nemluvit. Nádoby s již sterilním médiem otevírat co nejméně. Kultivace Kultivace mikrobů je základním postupem sloužícím k jejich přímému průkazu. Charakter růstu bakterie je důležitým identifikačním znakem; nevýhodou je doba kultivace (např. Mycobacterium tuberculosis roste 9 týdnů, většina bakterií pouze 24-48 hodin). Mikroorganizmy (bakterie, vláknité houby, kvasinky) se v mikrobiologických laboratořích kultivují na sterilních živných médiích, které splňují všechny požadavky na výživu a mají optimální pH, osmotické poměry a re-doxpotenciál. Samozřejmostí je dostatek vody pro životní pochody a přítomnost živin: zdroje energie (organotrof- organická látka; fototrof- světlo; litotrof- anorganická látka), uhlíku (hete-rotrof - organická látka; autotrof - CO2), dusíku (amonné ionty, dusičnanové ionty, aminokyseliny, bílkoviny nebo jejich částečné hydrolyzáty) a biogenních prvků (anorganické soli), přičemž hodnoty uvedených podmínek musí zůstat optimální po celou dobu kultivace. Živná média Dle složení lze média dělit do dvou základních skupin: média syntetická (definovaná) s přesně definovaným složením (ústojné roztoky, zdrojem uhlíku obvykle glukóza, zdrojem dusíku (NEL^SC^ nebo NH4CI, čisté aminokyseliny, vitamíny a růstové faktory) a média přirozená (komplexní), které mají ve svém základu živný bujón a nejsou chemicky definované. Jsou tvořeny složkami získanými po kyselé hydrolýze kaseinu, želatiny nebo po enzymatické hydrolýze masa (pepsin, trypsin, pankreatin). Podle konzistence rozeznáváme média tekutá (mléko, masopeptonový bujón, cukrová média, sladina), polotekutá, ztužená a tuhá. Výhodou tekutých médií je snadný přístup vody a živin, mikroorganizmy v nich snáze rostou. Nevýhodou je růst mikroorganizmů projevující se zakalením, sedimentem nebo blankou (dle nároků na kyslík). V tekutém médiu nelze určit, zda se jedná o čistou kulturu nebo směs více druhů, rodů. Pro přípravu ztužených půd se k bujónovému základu přidává většinou agar (směs polysacharidu z mořských řas, není využíván jako zdroj živin), méně pak želatina (nižší teplota tání, okolo 35 °C) či křemičité gely. Výhodou kultivace na pevném médiu na Petriho misce je možnost pozorování izolovaných kolonií (klonů jedné buňky), tedy izolovaných kmenů. Kolonie bakteriálního druhu je taxonomicky významný makroskopický znak. Úvodní slovo 3 Média univerzální svým složením vyhovují požadavkům na výživu širokého spektra organizmů (např. masopeptonový bujón, sladinový agar). Média selektivní svým složením zvýhodňují růst jednoho druhu nebo cílové skupiny organizmů, růst ostatních druhů je inhibován (např. Ashbyho agar - bezdusíkaté médium, rostou na něm jen organizmy schopné fixace vzdušného dusíku). Selektivní média obsahují inhibiční složku nebo naopak některá základní složka chybí, což zvýhodňuje a cíleně izoluje prokazované rody a druhy. Média selektivně diagnostická svým složením potlačují růst většiny mikroorganizmů a umožňují růst jen velmi malé skupině. Charakteristický růst se projeví změnou barvy média či kolonií vlivem biochemické reakce mikroorganizmu (např. Endova půda). Příklady kultivačních půd Masopeptonový agar (MPA) obsahuje výtažek z masa, pepton, sůl a agar, bývá základem pro další média. Krevní agar (KA) připravuje se přidáním 5-10 % deribrinované zvířecí krve k vhodnému základu (např. MPA), nejvíce používaná půda, roste na ní většina bakterií, na KA lze odečítat hemolýzu, pokud bakterie tvoří hemolyziny - vznik úplného projasnění, u neúplné hemolýzy není projasnění úplné. Endova půda (Endoagar, EA) selektivně diagnostická půda pro střevní bakterie (čeleď Enterobacteriaceae), obsahuje laktózu. Indikátorem jejího kvašení je bazický fuchsin odbarvený siřičitanem sodným. Je-li laktóza kvašena, mění se barva světle rialovočervená do temné fialové vlivem změny pH. Bakterie, které kvasí laktózu, mají tmavě fialově zabarvené kolonie. Bakterie, které laktózu nezkvašují, mají kolonie růžové. XLD agar půda pro záchyt patogenních střevních bakterií (Salmonella), obsahuje laktózu. Laktózu kvasící bakterie jsou žluté. Lze rozpoznat tvorbu H2S - černý střed kolonií. Sabouraudova půda pro záchyt kvasinek a plísní, obsahuje glukózu nebo maltózu, pH 5,0. Fortnerova půda pro záchyt anaerobů (obsahuje redukující substance). Lowenstein-Jensenova půda pevná půda pro záchyt mykobakterií, obsahuje vaječnou emulzi, glycerin, škrob, malachitovou zeleň. Slanetz-Bartley agar (SB) selektivně diagnostická půda pro bakterie rodu Enterococcus, chudá na živiny (enterokoky jsou nenáročné oproti jiným bakteriím), kolonie enterokoků mají v masivním nárůstu fialovohnědou barvu. Wilson-Blairova půda selektivní půda pro salmonely (černě kovově lesklé kolonie s černým okolím). Claubergova půda diagnostická půda pro Corynebacterium diphtheriae (černé kolonie s kovovým leskem). Čokoládový agar obsahuje krev přidávanou do horkého základu pro krevní agar (80°C), slouží ke kultivaci náročných mikrobů. Mueller-Hinton agar využívá se pro testování citlivosti a rezistence k antibiotikům a pro primární izolaci neisserií. 4 Příprava živných médií, kultivace mikroorganizmů, aseptická práce Uchování médií Až na výjimky se média uchovávají v lednici tak, aby nevysychaly - dnem vzhůru a zabalené a to po stanovenou dobu exspirace. Čerstvá média nesmí mít před očkováním bakterií mokrý povrch - před začátkem práce se dávají na několik hodin sušit. Dezinfekce, sterilizace, dekontaminace Odstranění mikroorganizmů z prostředí (dekontaminace) může být zabezpečeno různými způsoby a tomu odpovídá též dosažený efekt. Prostý úklid, mytí, praní a žehlení snižuje výskyt mikroorganizmů až o 90 %. Tím se zvyšuje účinnost následně prováděné dezinfekce nebo sterilizace. Dezinfekce s použitím chemických látek nebo fyzikální je definována jako ničení či zneškodňování vegetativních buněk patogenních mikroorganizmů na neživých předmětech, ve vnějším prostředí (ve vodě, ve vzduchu apod.) a v infekčním materiálu. Cílem dezinfekce je učinit předměty (zevní prostředí) neinfekční. Účinnost dezinfekce je závislá na rezistenci mikroorganizmů vůči těmto prostředkům, které by měly mít baktericidní účinek na většinu patogenních mikroorganizmů. Antisepse je zneškodňování patogenních zárodků v prostředí živých tkání, v ranách, na sliznicích a na kůži s použitím antiseptik. Je namířena hlavně proti mikrobům vyvolávajícím hnisání. U antiseptik není striktní požadavek na baktericidní účinek jako u dezinfekčních prostředků, stačí bakteriosta-tické působení. Antiseptika musí splňovat požadavek nejedovatosti a dobré snášenlivosti živými tkáněmi. Na rozdíl od dezinfekčních prostředků proto podléhají schválení jako každý jiný zdravotnický prostředek. U antiseptik není nutná dobrá rozpustnost ve vodě. Asepse je souhrn opatření vedoucích ke stavu, kdy je v prostředí minimum mikroorganizmů. Asepse má zabránit přístupu mikroorganizmů k živým tkáním při chirurgických operacích používáním sterilních nástrojů, obvazových látek, šicího materiálu, pryžových rukavic, přípravou operačního pole, dezinfekcí chirurgových rukou, používáním ústenek apod. Pojem asepse zahrnuje také laboratorní a výrobní metody, u nichž je snaha zabránit mikrobiální kontaminaci např. u mikrobiologických laboratorních prací a při výrobě léků. Sterilizace je zničení všech živých mikroorganizmů, včetně vysoce rezistentních bakteriálních endospor fyzikálními nebo chemickými postupy. Sterilizace nasycenou vodní parou pod tlakem (v autoklávu) se provádí nejčastěji za přetlaku 100 kPa při teplotě 120 °C po dobu 15-30 minut. Tento způsob sterilizace umožňuje zničit bezpečně všechny formy mikroorganizmů. Autokláv je tlakový sterilizátor opatřený vodoznakem pro stav vody ve vyvíječi páry (pokud není přímo napojen na přívod páry z centrálního zdroje). Dále je vybaven pojistným ventilem, dvěma manometry (jeden k měření přetlaku páry ve vyvíječi, druhý v pracovním prostoru), odvzdušňovacím ventilem, vodní vývevou a teploměrem. Dokonalé odvzdušnení pracovního prostoru na začátku sterilizace je předpokladem úspěšné sterilizace (směs páry se vzduchem při 120°C a 30 minutové expozici nemá spolehlivý sterilizační efekt). V autoklávu lze sterilizovat různé roztoky, kovové laboratorní nástroje, pryžový materiál. Při sterilizaci bakteriologických půd je třeba dát pozor na možnost hydrolýzy disacharidů a poškození termolabilních látek. Seznam přístrojů a mikroorganizmů 5 Seznam přístrojů a mikroorganizmů • komerční masopeptonové médium (MPB - meat pepton broth) • agar, destilovaná voda • sterilní Petriho misky • skleněné biologické zkumavky, Erlenmeyerovy baňky • vatové zátky, odměrný válec, autokláv Postup • Práce probíhá ve dvojici. Popsat své zkumavky a misky zespodu. • Do Erlenmeyerovy baňky navážit 2,6 g masopeptonového bujónu. • Doplnit do 200 ml destilovanou vodou, důkladně rozmíchat a změřit pH (pH papírkem, případně upravit). • Pipetovat po 5 ml do dvou zkumavek, uzavřít vatovou či kovovou zátkou. Takto jsou zkumavky s bujónem připravené ke sterilizaci. • Ke zbytku roztoku média přidat 3,6 g agaru a promíchat. Médium zahřívat do rozvaření agaru (v autoklávu či mikrovlnné troubě), poté pipetovat opět do dvou zkumavek po 5 ml, uzavřít vatovou či kovovou zátkou. Zkumavky jsou připravené pro sterilizaci - šikmý agar. • Zbytek média v baňce uzavřít vatovou zátkou a společně se zkumavkami umístit do autoklávu. Sterilizace probíhá 20 min při tlaku 0,15 MPa a teplotě 121 °C. • Po sterilizaci v autoklávu je již médium sterilní, nutno dodržovat zásady aseptické práce (ožehávání hrdla baněk a zkumavek)! • Sterilní médium z baňky rozlévat do předem připravených sterilních Petriho misek. Do misky nalít zhruba 20 ml média, to odpovídá 4-5 mm média na výšku v misce. Misky otevírat co nejméně, při práci nemluvit (obr. 1A). Po utuhnutí misky obrátit dnem vzhůru. • Zkumavky se sterilním agarem ještě za tekutého stavu uložit do šikmé polohy a nechat utuhnout (obr. 1B). • Po několika dnech vyhodnotit, zda nedošlo ke kontaminaci. 6 Příprava živných médií, kultivace mikroorganizmů, aseptická práce Obr. 1: Příprava živných agarů (archiv autorek) Zhodnocení cvičení • Připravená média budou v příštím cvičení sloužit nejen k očkování, ale i k následnému makroskopickému pozorování kultur mikroorganizmů. Byly dodrženy zásady aseptické práce? • Došlo k nárůstu kontaminace? Další informace k této problematice najdete v následující literatuře • Votava M., Kultivační půdy v lékařské mikrobiologii. 2000, Nakladatelství Hortus, Brno, ISBN 80-238-5058-X. Kontrolní otázky 1. Jak byla zajištěna sterilita práce? 2. Jakou výhodu má šikmý agar oproti agaru v Petriho misce? 3. Proč se charakter růstu kolonií hodnotí na Petriho misce a nikoli v bujónu? 4. Jak se od sebe liší syntetická média a přirozená? 5. Jmenujte příklady a složení ztužovadel kultivačních půd v mikrobiologii. Zajímavosti 7 6. Jaké pomůcky a postupy zaručují aseptickou práci ve cvičení? 7. Jakým způsobem je možné získat z bujónu ztuženou kultivační půdu? 8. Jaká je funkce kultivačních médií? 9. Jaký je rozdíl mezi antisepsí a aseptickou prací? 10. Inaktivují se pasterizací bakteriální endospory? 11. Co je to sterilizace; uveďte několik příkladů. 12. Uveďte několik příkladů pro zajištění aseptické práce na laboratorním stole mikrobiologického praktika bez fiowboxu. 13. Čím je možné obohatit kultivační půdu? 14. Co znamená pojem dezinfekce? 15. Co znamená pojem sterilizace? Zajímavosti • Robert Koch zavedl kultivaci na extraktu zhovězího masa zpevněném želatinou. Kultivací na pevné půdě tak mohl zjistit počet druhů bakterií (dle vzhledu kolonie) a počet buněk ve vzorku (= počet kolonií) a získat čistou kulturu. • Walter Hesse na radu své manželky nahradil želatinu agarem. • Petriho misky byly v mikrobiologii zavedeny Richardem Petrim v roce 1887. • Masový výtažek je bohatý na růstové faktory, ale na živiny je poměrně chudý. Frederick Lôfier (spoluobjevitel původce záškrtu) vylepšil masový extrakt přídavkem peptonu (produkt enzymatického natrávení masa, obsahuje peptidy i volné aminokyseliny) a NaCl, tím vznikl živný bujón. • Komerční sušená kultivační média se používají od roku 1914. 2 Metody sterilní práce, očkování a uchovávání mikroorganizmů Cíl cvičení Naučit se zásady aseptické práce a dodržovat je při práci s mikroorganizmy. Zvládnutí techniky očkování mikroorganizmů (tekutá i tuhá média). Izolace jednotlivých kolonií pomocí křížového roztěru. Úvodní slovo Jako kultury označujeme mikroorganizmy kultivované v laboratorních podmínkách na živných médiích. Pracujeme-li s kulturou jednoho druhu, považujeme ji za kulturu čistou. Kultury smíšené jsou kultury několika druhů (např. izoláty z přirozeného prostředí, které je potřeba kultivací pro identifikaci oddělit = izolovat). Jako kultury technické se označují kultury používané pro výzkumné nebo provozní účely (v čistírnách odpadních vod, bakteriální filtry, bioreaktory). Technické kultury mohou být jak čisté (pivovarské kvasinky), tak smíšené (mléčné bakterie pro výrobu jogurtů). Kultury přenášíme (= přeočkováváme) na čerstvé médium z tekutého nebo z tuhého média za různými účely: přenesení do čerstvějšího média, oživení, očkování na diagnostické médium, izolace kultury, očkování pro odečet fyziologických a morfologických vlastností kultury. Charakter růstu a podmínky následné kultivace jednotlivých kultur se v laboratoři (optimální podmínky -čistá kultura, dostatek živin) vždy odlišují od růstu dané kultury v přirozeném prostředí. Růst v přirozeném prostředí doprovází kompetence o živiny, adaptace a neustálý boj s antibiotiky a me-tabolity současně přítomných dalších kmenů. Navíc je třeba si uvědomit, že mnoho bakteriálních druhů je nekultivovatelných. Izolace bakteriálního kmene Pro zisk čisté kultury jsou využívána selektivní média, na kterých vyroste pouze žádaný bakteriální taxon či skupina taxonů (druh, rod). Pro izolaci kmene na Petriho misce na selektivním nebo na neselektivním (univerzálním) médiu využíváme metodu křížového roztěru. Podle vzhledu vyrostlých kolonií lze odlišit různé morfologické typy a ty následně izolovat dalším křížovým roztěrem (odebráním buněk z dané kolonie). Křížový roztěr je metoda postupného zřeďování původní kultury za účelem zisku jednotlivých kolonií a odečtení jejich morfologie. Kolonie mikroorganizmů je ve své podstatě klon jedné buňky. Bakteriologická klička s přenášenou kulturou se po každém kroku očkování žíhá v plamenu, tím dojde k usmrcení buněk a při dalším tahu pak po agaru roztíráme pouze buňky setřené z následující oblasti křížového roztěru. Roztírá se stále menší množství buněk. V místě tzv. hádku (poslední oblast křížového roztěru) již vyrůstají jednotlivé kolonie, u kterých lze hodnotit charakteristický profil, vzhled, tvar, barvu, okraje. Kultivace Kultury v tekutém médiu můžeme kultivovat kontinuálně (např. větší objemy média s průmyslovými kmeny). Příkladem je chemostat, kdy je růstová rychlost kultury řízena koncentrací limitující živiny, která je přítokem nového média dodávána. Naočkujeme-li médium, do kterého již nejsou dodávány živiny, jedná se o kultivaci statickou. Statická kultivace může být submerzní (třepaná) nebo vzdušněná. Těmito procesy se promícháváním zvětšuje plocha fázového rozhraní a může probíhat efektivnější výměna plynů (např. prevzdušňovači rošty v bioreaktorech). Úvodní slovo 9 Vzhled kultury ovlivňuje použité médium, typ kultivace i stáří kultury. Stejný mikroorganizmus může na různých typech agarů vykazovat různé morfologické vlastnosti (pigmentace, velikost kolonií, atd.). Při práci s čistými kulturami, v našem případě z České sbírky mikroorganizmů, (), dodržujeme podmínky kultivace dle katalogu kultur - doporučené médium definovaného složení, teplota a podmínky kultivace. Pokud izolujeme kmeny z prostředí, snažíme se dodržet podmínky, které jsou pro ně v daném prostředí přirozené (koncentrace solí, živin, teplota, pH). Růstová křivka (obr. 2) je grafické vyjádření závislosti počtu buněk na délce statické kultivace a skládá se z několika fází: Lag fáze probíhá přizpůsobování a růst samotné buňky, aktivace vhodných enzymů, organizace metabolizmu. V činnosti jsou adaptivní enzymy, v buňce je přítomno mnoho RNA (zvýšená syntéza enzymů), řada ještě neadaptovaných buněk odumírá. Fáze fyziologického mládí (zrychleného růstu) bod mezi lag a log fází; všechny potřebné enzymy jsou připraveny a kultura vykazuje vysokou rychlost růstu. Log fáze (logaritmická, exponenciální) intenzivní růst buňky a metabolizmus, trvá, dokud není koncentrace živin limitující, všechny buňky se dělí konstantní maximální rychlostí. Z této části křivky se využívají parametry pro srovnávání experimentů. Buňky lze dobře charakterizovat, charakter růstu se odečítá vždy v log fázi (suchá a mokrá hmotnost buněk, nárůst metabolitů, stanovení váhy DNA, RNA). Fáze zpomaleného růstu snížení intenzity metabolizmu, hromadění metabolitů Fáze stacionární snížení rychlosti množení, počet nově vzniklých buněk se vyrovnává s počtem odumřelých, dochází k vyčerpání živin, délka života závisí na citlivosti k hladovění, mohou vznikat endospory Fáze odumírání médium je spotřebováno a buňka odbourává své zásobní látky, čelí kyselosti prostředí (ze svých zplodin), nestačí reparační systémy Obr. 2: Růstová křivka. Plná čára - celkový počet mikroorganizmů (mrtvých i živých); přerušovaná čára - počet živých mikroorganizmů (Greenwood a kol., 1999, upraveno) 10 Metody sterilní práce, očkování a uchovávání mikroorganizmů Diauxie je postupné využívání dvou substrátů. Nejdříve se využije jednoduchý zdroj, např. glukóza, a potom teprve složitější substrát, např. laktóza. Růstová křivka má v tom případě dva vrcholy. Teplota Podle optimální teploty kultivace rozlišujeme tři základní skupiny mikroorganizmů: psychrofilní s optimem růstu pod 20 °C (oceány, jeskyně, chladnička - např. pseudomonády, aeromonády, listerie); mezofilní s optimem růstu mezi 20 až 40 °C (většina bakteriálních druhů; parazitické mikroorganizmy); termofilní s optimem růstu nad 55 °C (extrémní termorilové rostou až kolem 100 *C). Vztah ke kyslíku Bakteriální druhy kultivované za přístupu vzduchu označujeme jako aerobní. Aerobní kultivace je zajištěna nátěrem a kultivací buněk na agaru na Petriho misce či ve zkumavce na agaru šikmém nebo v nízké vrstvě tekutého média (okolo 5 ml). Větší objemy tekutého média by již musely být syceny kyslíkem (aerace, submerzní kultivace). Některé střevní bakterie jsou příkladem fakultativních anaerobů, které jsou schopny růstu jak v aerobním, tak anaerobním prostředí. V prostředí s kyslíkem přepínají na energeticky výhodnější aerobní metabolizmus. V tekutém médiu se projevují růstem v celém jeho sloupci (zákal média). Anaerobní organizmy se vyskytují v prostředí s nulovou či nízkou koncentrací kyslíku, kyslík působí jako jed či inhibitor růstu. Stav anaerobiózy jako první definoval Louis Pasteur, který zavedl do mikrobiologie termíny pro aerobní a anaerobní organizmy. V závislosti na stupni tolerance vůči molekulárnímu kyslíku, lze anaerobní mikroorganizmy dělit na: striktně (obligátně) anaerobní mikroorganizmy -vyžadují úplnou absenci kyslíku, koncentrace více než 0,5 % na ně působí toxicky a odumírají; ae-rotolerantní mikroorganizmy - nevyužívají kyslík jako konečný akceptor elektronů, ale rostou v jeho nízkých koncentracích; mikroaerofilní mikroorganizmy - vyžadují určité nízké procento kyslíku, využívají ho jako konečný akceptor elektronů, ale nerostou za přítomnosti 21 % vzdušného kyslíku za normálního tlaku. Anaerobní nebo mikroaerofilní kultivace se provádí hlubokým vpichem do agaru nebo očkováním do vysoké vrstvy kapalného média. Je nutno snížit oxidoredukční potenciál přidáním redukujících látek (kyselina askorbová, thioglykolát, thiosíran) do média. Pokud anaerobní prostředí pro kultivaci vytváříme, využíváme tzv. anaerostatu a směsi chemikálií (železný prášek, kyseliny vinná, citrónová), která po ovlhčení uvolňuje vodík, který v přítomnosti katalyzátoru (Pt, Pd) reaguje s přítomným vzdušným kyslíkem za jeho vytěsnění a vzniku molekul vody. Uchování mikroorganizmů Typ uchovávání volíme podle jeho zamýšlené délky: • na Petriho misce při 4 °C, krátkodobě, nutno přeočkovávat (např. laktokoky po týdnu, bacily po 2-3 měsících) • na šikmém agaru při 4 °C, v řádu týdnů; v místnosti či termostatu při 25 °C v řádu dnů • ve zkumavce v agaru ve vpichu, po dobu několika měsíců • na porózních materiálech - želatínových discích, kuličkách, dlouhodobě • pod sterilním minerálním olejem (houby, bakterie) • lyofilizované (lyorilizace = sublimace vody ve vakuu), méně šetrná než kryoprezervace, všechny mikroorganizmy nelze lyofilizovat, např. houby; dochází ke snížení viability, lyofilizované kultury jsou připravené ihned k odeslání, snadná manipulace Úvodní slovo 11 • zmrazené na -70 °C (např. v kultivačním médiu s 15 % glycerolu) po malých objemech v hlubokomrazicím boxu, přežívání měsíce, roky • boxy s pevným CO2, suchý led (-78 °C) • kryogenní hlubokomrazící boxy (-150 °C) • kryoprezervace - zamražení kultur ve velmi nízkých teplotách, např. v tekutém dusíku (až -196°C) nebo v jiných plynech (He, Cr, H), uchovávání neomezeně dlouho. Nejvhodnější je postupné ochlazování (kontrolovaná rychlost zamražení: ideálně 1 °C/min. pro snížení osmotické disbalance a proti nevhodnému formování krystalů vody v buňce (amorfní led); některé odolné bakterie snesou rychlejší nebo okamžité zamražení - dle rigidity buňky). Vhodné je použít kryoprotektanty v ochranném médiu - dimethylsulfoxid, glycerol. Vlastnosti mikroorganizmů ve cvičení Escherichia coli (čeleď Enterobacteriaceae): gramnegativní rovné tyčky vyskytující se jednotlivě nebo po dvou. Pohyblivé pomocí peritrichálních bičíků nebo nepohyblivé, mezofilní, fakultativně anaerobní. Běžný komenzál tlustého střeva, pomáhá udržovat rovnováhu mikroflóry, působí proti patogenům střeva, syntetizuje vitaminy A, B, K. Pokud se dostane mimo střevo, může působit jako patogen. Fekálním znečištěním se dostává do vody, kde může přežít řadu týdnů - nejběžnější indikátor fekální kontaminace pitné vody. Slouží jako model genového inženýrství (sekvenace celého genomu), producent různých látek (např. inzulín). Patogenní kmeny E. coli jsou charakterizovány a identifikovány sérologicky (somatické, kapsulární, bičíkové antigény) i biochemicky: enterotoxigenní E. coli (ETEC) - cestovatelské průjmy, endemický výskyt v teplých oblastech; enteropatogenní E. coli (EPEC) - průjmy novorozenců, alterace epitelu střeva; enteroinvazivní E. coli (EIEC); enterohemoragická E. coli (EHEC) - způsobuje hemoragie (krvácení do orgánů trávicího traktu). Serratia marcescens (čeleď Enterobacteriaceae): gramnegativní rovné tyčky, fakultativně anaerobní, mezofilní, tvorba červeného pigmentu. Výskyt v půdě, vodě, na rostlinných površích, ale i oportunní patogen člověka - častý původce nozokomiálních infekcí močového a dýchacího traktu. Může být součástí zubního povlaku (pigmentace zubu), je původcem růžového povlaku ve vlhkém prostředí koupelen. Pseudomonas (čeleď Pseudomonadaceae): gramnegativní rovné nebo nepatrně zakřivené tyčky, schopnost pohybu jedním nebo více polárními bičíky. Optimální kultivační teplota je 25-30 °C, aerobní. Tvorba fenazinových exopigmentů pyocyaninu a fluorescinu (pyoveridinu), které způsobují modrozelené a žluté až žlutozelené zabarvení kultury i kultivačního média. Výskyt v prostředí, ve zkažené potravě (vajíčka, ryby, mléko), častá izolace z klinických vzorků. Významné lidské, zvířecí i rostlinné patogeny, původci nozokomiálních infekcí; faktorem virulence je tvorba biofilmu s vysokým stupněm rezistence na povrchu tkání nebo předmětů díky tvorbě polysacharidu alginátu (P. aerugi-nosa nebo P. fluorescens), který tvoří matrix biofilmu a chrání buňky vůči působení dezinfekčních látek, protilátek a antibiotik. Akumuluje poly-/3-hydroxybutyrát. Díky širokému spektru metabolických drah se podílí na geochemických cyklech, biodegradacích a významně se uplatňuje při bioremediacích (např. degradace toluenu) nebo jako biokontrolní agens. P. putida - bioremediace; P. fluorescens - produkce fluoresceinu 12 Metody sterilní práce, očkování a uchovávání mikroorganizmů Kocúria rosea (čeleď Micrococcaceae): grampozitivní koky uspořádané po dvou, ve čtveřicích či shlucích. Aerobní, mezofilní, tvoří růžové a červené pigmenty. Výskyt v půdě, vodě, prachu, na kůži savců. Rod byl pojmenován na počest významného brněnského mikrobiológa doc. RNDr. Miloše Kocura, CSc. Micrococcus luteus (čeleď Micrococcaceae): grampozitivní koky uspořádané po dvou, ve čtveřicích či shlucích, aerobní. Výskyt na pokožce savců, v potravinách, půdě, vzduchu a vodě. Produkce žlutého pigmentu. Staphylococcus aureus (čeleď Staphylococcaceae): grampozitivní koky vyskytující se jednotlivě, po dvou nebo v nepravidelných shlucích. Kolonie mohou být bílé nebo nažloutlé. Výskyt na kůži a sliznicích teplokrevných obratlovců, v potravinách a v prostředí. Některé druhy jsou patogenní a produkují toxiny. Bacillus (čeleď Bacillaceae): grampozitivní rovné tyčky, často ve dvojici či v řetízcích, pohyblivé, aerobní či fakultativně anaerobní. Výskyt v půdě, vodě, potravinách (rýže). Několik druhů rodu jsou patogeny člověka ěi hmyzu. Produkce toxinů {otravy z jídla, gastroenteritidy). Tvoří oválné či kulaté endo-spory, které jsou v buňce uloženy terminálne, subterminálně, paracentrálně či centrálně a které se mohou využívat jako biopesticidy (B. thuringiensis). Tvar, velikost a uložení spory je charakteristický znak pro identifikaci. • B. cereus - prostředí, způsobuje gastroenteritidy, alimentární intoxikace • B. subtilis - prostředí, izolován při potravinových otravách • B. mycoides - prostředí, rhizoidní růst • B. sphaericus - půda i vodní sedimenty, potraviny • B. thuringiensis - patogenní pro hmyz, produkce toxinů (parasporální tělísko) Saccharomyces cerevisiae patří mezi eukaryotní mikroorganizmy. Mezofilní, fakultativně anaerobní kvasinka. Buňka vejco-vitého tvaru je výrazně větší než buňky bakterií. Buněčná stěna neobsahuje peptidoglykan. Výskyt v prostředí a v průmyslových provozech. První osekvenovaný eukaryotický organizmus. Výroba potravin (pivo, víno, pečivo), produkce různých látek (např. inzulín, rekombinantní vakcína HBsAg), modelový organizmus. Seznam přístrojů a mikroorganizmů Pomůcky a chemikálie • Bakteriologické plotny s MPA (MEA v případě S. cerevisiae) • Zkumavky se šikmým agarem MPA (MEA v případě S. cerevisiae) • Zkumavky s tekutým médiem MPB (MEB v případě S. cerevisiae) • Očkovací kličky, očkovací jehly, termostat, kahan Postup 13 Mikroorganizmy • Escherichia coli CCM 3954 • Pseudomonas putida, • P. fluorescens CCM 2115T • Serratia marcescens CCM 303 • Kocúria rosea CCM 839 • Micrococcus luteus CCM 169 • Bacillus cereus CCM 2010 • Staphylococcus aureus SA 812 • Saccharomyces cerevisiae Postup Do kultury ani média nesmí vniknout cizí mikroorganizmy ze vzduchu, z pomůcek, vlastní mikroflóry, dodržujeme zásady aseptické práce. Pracujeme co nejrychleji v zavřené místnosti, omytýma rukama a na dezinfikovaném stole, blízko plamene kahanu. Hrdla nádob i zátek před a po práci ožehneme plamenem. Zátky nikdy nepokládáme, ale držíme mezi malíčkem a prsteníčkem (obr. 3). Nádoby s kulturou necháváme otevřené jen po nezbytně dlouhou dobu a s hrdlem poblíž plamene. Obr. 3: Aseptická práce při očkování mikroorganizmů (archiv autorek) 14 Metody sterilní práce, očkování a uchovávání mikroorganizmů Ve cvičení kultivujeme mikroorganizmy staticky, aerobní kultivací na agarech (misky a šikmé agary) a v tekutém médiu ve zkumavkách. Kmeny jsou kultivovány na doporučených médiích v termostatu při optimální teplotě růstu dané kultury. Kultury na Petriho miskách kultivujeme vždy dnem vzhůru z důvodu udržení vlhkosti média a zabránění tvorby kondenzní vody na víčku, která by jinak skapávala na povrch média. Došlo by ke smíchání kultury na misce. Médium zároveň pomaleji vysychá. Ve cvičení každý pracuje samostatně. Všechny zkumavky i Petriho misky popsat permanentním popisovačem na sklo (druh, datum, označení skupiny, iniciály) vždy před začátkem očkovacích prací. Každý student očkuje: • 1 kmen do tekutého média • 1 kmen na šikmý agar • dva nebo čtyři různé kmeny na 1 misku do 2 nebo 4 „hádků" • 1 až 3 kmeny na Petriho misku křížovým roztěrem • směs dvou kmenů na Petriho misku křížovým roztěrem - cílem je izolace 2 typů kolonií (vhodné je naočkovat směs dvou různě pigmentovaných kmenů či grampozitivní a gramne-gativní kulturu) Očkování kultur na šikmý agar • Vyžíhat bakteriologickou kličkou a nechat vychladnout. • Do levé ruky uchopit obě zkumavky se šikmým agarem, malíčkem pravé ruky vytáhnout zátku ze zkumavky s kulturou (obr. 3). • Hrdlo zkumavky ožehnout • Sterilní (ožehnutou a vychladlou) kličku vsunout do zkumavky s kulturou, nabrat nárůst do očka kličky. Kličku vytáhnout, ožehnout hrdlo zkumavky i zátku a zkumavku zazátkovat. • Malíčkem pravé ruky vytáhnout zátku ze sterilní zkumavky s čistým šikmým agarem, ožehnout hrdlo zkumavky a kličkou naočkovat na šikmý agar tzv. hádka. • Ožehnout hrdlo zkumavky i zátku, uzavřít zkumavku a vyžíhat kličku. Očkování kultur na Petriho misku do sektorů tzv. hádkem • Zespodu rozdělit misku popisovačem na sektory a označit. • Ze zkumavky s kulturou odebrat nárůst na bakteriologickou kličku výše uvedeným postupem. • Mírně odklopit víčko Petriho misky a nanést kulturu na příslušný sektor agaru tažením kličky, tzv. hádek (obr. 4). • Přiklopit víčko a vyžíhat kličku. Postup 15 A Obr. 4: Nákres očkování na Petriho misku tzv. hádkem (A, B) a praktická ukázka, K. rosea a P. putida (C) (archiv autorek) Očkování kultur na Petriho misku — křížový roztěr (obr. 5) • Ze zkumavky s kulturou odebrat nárůst na bakteriologickou kličku výše uvedeným postupem. • Mírně odklopit víčko Petriho misky a nanést kulturu na agar tažením kličky po agaru v několika pruzích (1). • Vyžíhat kličku, nechat vychladnout a několika tahy kličkou rozetřít kulturu v koncové části nanesené kultury (2). • Vyžíhat kličku, nechat vychladnout a několika tahy kličkou rozetřít kulturu v koncové části nanesené kultury (3). • Vyžíhat kličku, nechat vychladnout a plynulým tahem, tzv. hádkem, rozetřít naředěnou kulturu (4). V místě tzv. hádka by měly vyrůst jednotlivé kolonie (5) Očkování do tekutého média • Kulturu odebrat z tuhého média kličkou (z Petriho misek odebrat jednu kolonii). • Zkumavku s tekutým médiem uchopit do levé ruky, malíkem pravé ruky vytáhnout zátku a ožehnout hrdlo zkumavky. Žíhání klitky (2) Obr. 5: Křížový roztěr (archiv autorek) 16 Metody sterilní práce, očkování a uchovávání mikroorganizmů • Odebraný vzorek rozetřít po stěně zkumavky nad hladinou média a postupně buňky převádět do jeho objemu. • Ožehnout hrdlo zkumavky i zátku, uzavřít a vyžíhat kličku. Očkování kultur z tekutého do tekutého média • Uchopit sterilní pipetu do pravé ruky (skleněnou nebo automatickou), malíkem vytáhnout zátku z baňky/zkumavky, hrdlo ožehnout a pipetou odebrat požadovaný objem kultury. Ožehnout zátku a uzavřít baňku. • Malíkem pravé ruky vytáhnout zátku z baňky/zkumavky se sterilním tekutým médiem a ožehnout hrdlo. • Vypustit kulturu z pipety do sterilního média, ožehnout zátku i hrdlo, baňku/zkumavku uzavřít a mírně protřepat. Očkování z tekutého média na Petriho misku • Uchopit sterilní pipetu do pravé ruky (skleněnou nebo automatickou), malíkem vytáhnout zátku z baňky nebo zkumavky, hrdlo ožehnout a pipetou odebrat požadovaný objem kultury (obvykle 100 ul). Ožehnout zátku a uzavřít baňku. • Daný objem vypustit do středu Petriho misky s agarem. • Sterilní hokejkou (též L kličkou) kulturu rozetřít po povrchu misky, ihned přiklopit víčko misky a chvíli nechat kulturu vsáknout do agaru. Kultivace • Kultivace probíhá při 30 či 37 °C po dobu 24-48 hodin. Zhodnocení cvičení • Prokázala se sterilita práce při přípravě médií v minulém cvičení? • Do jakých typů médií a jakým způsobem byly kmeny očkovány? • Co je účelem křížového roztěru? • Při jaké teplotě budou kmeny kultivovány? • Jak odvodíme správné podmínky kultivace? • Závisí morfologie kolonií na podmínkách kultivace? Další informace k této problematice najdete v následující literatuře • Miniatlas mikroorganizmů (http://sci.muni.cz/mikrob/Miniatlas/mikr.htm) • Greenwood D., Slack R. C. B., Peuthere a kol., Lékařská mikrobiologie. GRADA Publishing, 1999, ISBN 80-7169-365-0. Kontrolní otázky 17 • Němec M., Matoulková D., Základy obecné mikrobiologie, Masarykova univerzita, Brno, 2015, ISBN 978-80-210-7923-6. • Sedláček L, Taxonomie prokaryot, Masarykova univerzita, Brno, 2007, ISBN 80-210-4207-9. Kontrolní otázky 1. K čemu slouží kultivace kultury na misce a k čemu kultivace na šikmém agaru? 2. Jaké jsou základní fáze růstové křivky? Sledujeme jednu buňku nebo celou populaci? 3. Je možno posuzovat čistotu kultury v tekutém médiu? Pokud ne, jak by se při posouzení přítomnosti jediné bakteriální kultury dokázalo? 4. Proč se kultury mikroorganizmů přeočkovávají? 5. Co ovlivňuje morfologii bakteriální kolonie? 6. Poroste fakultativní anaerob za přístupu kyslíku? Pokud ano, proč tomu tak je? 7. Jakými prostředky a podmínkami kultivace můžeme vyselektovat určité skupiny bakterií? 8. Jak ověříme „čistotu" kmene kultivací? 9. Co znamená a jak se provádí izolace bakteriálního kmene? 10. Jaký je princip křížového roztěru? 11. Co způsobilo, že na misce křížového roztěru kultura vůbec nevyrostla? 12. Co zajišťuje aseptickou práci při preočkovaní kultury? 13. Co způsobilo, že v poslední části křížového roztěru nevyrůstají izolované bakteriální kolonie, ale „souvislý hádek"? 14. K čemu slouží selektivní média? 15. Jak rozdělujeme mikroorganizmy podle vztahu ke kyslíku a do jakých skupin podle teplotního optima? 16. K čemu slouží očkovací klička a k čemu L-klička (= hokejka)? 17. Porovnejte kultivaci statickou a kontinuální z hlediska dostupnosti živin a hromadění meta-bolitů. 18. Která fáze růstové křivky a proč se nejvíce hodí pro odečet parametrů růstu kultury? 19. Jaký je rozdíl mezi obligátním a fakultativním anaerobem co se týče tolerance ke kyslíku? 20. Co je to smíšená bakteriální kultura? 21. Co je to čistá bakteriální kultura? 22. Jaký je rozdíl mezi termoŕilem a termotolerantním mezofilem co se týče citlivosti k teplotě? 23. Jaké jsou metody očkování mikroorganizmů, které pomůcky pro něj můžeme použít? 3 Mikroorganizmy kolem nás Cíl cvičení Cílem je prokázat, kde se v prostředí, potravinách či na lidském těle vyskytují mikroorganizmy. Úvodní slovo Mikroflóra je souhrn všech mikroorganizmů vyskytujících se v definovaném prostoru přírodního prostředí, např. vodní nádrž, potraviny, tělo člověka. Mikroflóra zahrnuje viry, bakterie, kvasinky a vláknité houby (plísně). Pokud se berou v potaz pouze bakterie, hovoří se o bakteriální mikroflóre. Každé prostředí má svoji typickou autochtónni mikroflóru, tzn. přirozeně se vyskytující mikroorganizmy. Např. pro jogurty je typická přirozená mikroflóra Lactobacillus delbrueckii a Streptococcus salivarius; pro sýry s plísněmi to je Penicillium roquefortii nebo P. camemberti; pro pivo kvasinky Saccharomyces cerevisiae nebo S. pastorianus. Fyziologická mikroflóra těla je přirozená mikroflóra vyskytující se na povrchu těla člověka či zvířat nebo uvnitř jejich orgánů. Dělí se na dvě skupiny. Rezidentní mikroflóra jsou mikroorganizmy, které osídlují lidské tělo a nezpůsobují mu onemocnění ani škodu či újmu. Mikroflóra tranzientní zahrnuje mikroorganizmy, které se dočasně nacházejí v určité oblasti makroorganizmu (ústní dutina po konzumaci potravin, kůže) a které mohou být i patogenní. Přirozená mikroflóra účinně chrání před osídlením choroboplodnými mikroby z vnějšku a jejich rozmnožením, účastní se antigenní stimulace tvorby protilátek, zejména imunoglobulinů třídy IgA. Pro vymezení přirozené mikroflóry neexistuje přesná hranice - mikroby, které jsou u někoho přirozené, mohou u jiného vyvolat onemocnění. Mikroorganizmy jsou využívány po staletí, protože jejich činnost je schopna zastavit růst nežádoucích mikroorganizmů v potravinách a tím se prodlužuje skladovatelnost potravin (mléčné kvašení zelí, okurek, výroba sýrů, mléčné a ovocné kvašené nápoje). Rody Streptococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Lactococcus, Pediococcus, Enterococcus (bakterie mléčného kvašení) jsou široce využívané v mlékárenském průmyslu pro výrobu másla, jogurtů, sýrů a uzenářských výrobků, zakysání smetany, atd. Kvasinky Saccharomyces cerevisiae se využívají pro výrobu svrchně kvašených piv (Ale, pšeničné pivo, stout, porter) a vína. Pro výrobu spodně kvašených piv typu ležák se používá kvasinka S. pastorianus schopná kvasit za nižších teplot. MRS médium - agar pro laktobacily podle DeMana, Rogosiho a Sharpeho s octanem sodným, který potlačuje růst dalších bakterií (kromě některých mléčných bakterií, např. Leuconostoc, Pediococcus). Seznam přístrojů a mikroorganizmů • Živná média na miskách - MPA, MRS, sladinový agar • Sterilní vatové tyčinky, pipety, hokejky • Destilovaná voda Postup 19 Postup Stery z prostředí a z těla (obr. 6) • Sterilní vatovou tyčinku namočit do sterilní destilované vody. • Setřít plochu předmětu (ústa, klika, mobilní telefon, klíče, boty, pokožka, hodinky, atd.) • Tamponem potřít médium v misce. • Kultivace probíhá při 30 °C po dobu 24-48 hodin. • Krátce přiložit daný předmět či část těla (prst, mince) na misku. • Kultivace probíhá při 35 °C po dobu 24-48 hodin. Otisk z prostředí a z těla Obr. 6: Stěr či otisk mikroflóry: z paty (A), prstů na noze (B), prstů na ruce před umytím (C), prstů na ruce po umytí (D), rtů (E), podpaží (F), rtů a nosu (G), ucha (H), úst (I) a mobilu (K) (archiv autorek) Spad z ovzduší • Misku s MPA nechat otevřenou na stole (roh místnosti, u okna) po dobu min. 30 minut. • Kultivace probíhá při 30 °C po dobu 24-48 hodin. Očkování piva (neředěné, nefiltrované) • 0,3 ml neředěného vzorku pipetovat na sladinový agar a rovnoměrně rozetřít hokejkou. • Kultivace probíhá při 30 °C po dobu 24-48 hodin. Očkování jogurtu, kefíru, nepasterizovaného mléka • 0,3 ml neředěného vzorku pipetovat na MRS agar a rovnoměrně rozetřít hokejkou. • Kultivace probíhá při 30 °C po dobu 24-48 hodin. 20 Mikroorganizmy kolem nás Zhodnocení cvičení • Došlo k nárůstu na miskách? Které části těla vykazovaly největší druhovou diverzitu? Další informace k této problematice najdete v následující literatuře • Klaban V., Ilustrovaný mikrobiologický slovník, Galén, Praha, 2005, ISBN 80-7262-341-9. • Nester E. W., Roberts C. E., Pearsall N. N., Anderson D. G., Nester M. T., Microbiology, A human perspective, WBC/McGraw-Hill, 1998, ISBN 978-0073522593. • Silhánková L., Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology, Academia, 2002, ISBN 80-200-1024-6. Kontrolní otázky 1. Které části těla jsou nejvíce osídleny a proč? 2. Jaké druhy mikroorganizmů se nejčastěji vyskytují na pokožce? 3. Co je to přechodná mikroflóra? 4. Je mikroflóra lidského těla škodlivá? 5. Vyjmenuj některé rody bakterií mléčného kvašení 6. Proč se pro výrobu spodně kvašených piv typu ležák jiný druh kvasinky? 4 Úvod pro práci s mikroskopem Cíl cvičení Cílem je seznámit se s mikroskopem a s různými mikroskopickými technikami. Úvodní slovo Lupa vytváří přímý obraz zvětšený 10-15x. Lupa je dvojvypuklá či ploskovypuklá čočka. Předmět, který pozorujeme lupou, klademe do vzdálenosti menší, než je ohnisková vzdálenost. Slouží pro pozorování makroskopických znaků kolonií. Mikroskop (obr. 7) se skládá z mechanické části (podstavec, stojan a stolek s křížovým posunem), osvětlovací části (zdroj světla, kondenzor, clona) a optické části (objektivy a okuláry). Objektiv je soustava čoček s velmi krátkou ohniskovou vzdáleností, která vytváří skutečný převrácený obraz objektu, jež se promítá mezi ohnisko okuláru a okulár. Okulárem tento obraz pozorujeme jako pod lupou a vidíme neskutečný zvětšený obraz. Okulár (perné zvětšení lOx) Siupnlce vzdálenosti akulárů Kroužek dioptrické korekce Revolverový nosič objektivů Objektiv Držák preparátu Přepravní poj islka* Páčka apertumí clony Centrovací Šrouby kondenzoru Kondenzor Objímka pro filtry (o průměru 45 mm) Kroužek polní clony Upevňovací Srou b tubusu (použijte Šroubovák dodávaný s mikroskopem^ Kolečko zarážky pro zaostřování Stativ CX31RBSF Fŕepravní pojistka* Hlavní vypínač Kolečko mlkrooosuw Kolečko makroposuvu Kolečko posuvu v ose X Kolečko posuvu v ose V Obr. 7: Části mikroskopu (zdroj: Návod k obsluze Olympus CX31) Pro mikroskopii lze využít jakékoli vlnění s vlnovou délkou kratší, než jsou rozměry objektu. Rozlišujeme mikroskopii optickou (zobrazení struktur lišících se vzájemně absorpcí viditelného 22 Uvod pro práci s mikroskopem světla), elektronovou a akustickou. Optická (světelná) mikroskopie Suchý objektiv paprsek vystupující z preparátu pod úhlem a se na rozhraní mezi krycím sklíčkem a vzduchem láme od kolmice a nemůže se již podílet na tvorbě obrazu. Imerzní objektiv paprsek přecházející ze skla do imerzního prostředí svůj směr nemění a může se podílet na tvorbě obrazu, na vzniku obrazu se podílí více paprsků (obr. 8). Imerzní prostředí kapalina o stejném indexu lomu (n) jako krycí sklíčko, často cedrový olej (n = 1,52). Obr. 8: Průchod paprsků suchým a olejovým imerzním objektivem (Prescott, 2013, upraveno) Vznik obrazu Podstatou tvorby ostrého obrazu čočkou jsou světelné paprsky šířící se z určitého bodu předmětu různými směry a dopadající na čočku, v obrazové rovině se sbíhají opět do jednoho bodu a skládají tak ostrý obraz předmětu. Vzhled obrazu u konvexních čoček závisí na vzdálenosti předmětu od čočky. Pokud je předmět vzdálený více než dvojnásobek ohniskové vzdálenosti, vzniká skutečný zmenšený a převrácený obraz (fotoaparát). Pokud leží předmět mezi dvojnásobkem ohniskové vzdálenosti a ohniskem, je vzniklý obraz převrácený, skutečný a zvětšený (objektiv mikroskopu). Pokud je předmět mezi ohniskem a čočkou, je vzniklý obraz zvětšený a neskutečný (lupa, okulár mikroskopu). Zvětšení čočky roste se zkracující se ohniskovou vzdáleností. Fyzikální podstata vzniku obrazu v optickém mikroskopu Ernst Abbe podal vysvětlení, které se opírá o Huygensův princip - každý bod osvětleného objektu se stává zdrojem sekundárních sférických vln. Zaostřená rovina preparátu je takovým objektem. Podle optických vlastností jednotlivých bodů objektu se dopadající světlo v každém z bodů transformuje (ohýbá se, láme, mění se jeho amplituda, fáze) a vznikají sekundární vlny. Ty spolu interferují, jako po průchodu světla štěrbinou nebo optickou mřížkou. Výsledné vlnění, které obsahuje informaci o vzhledu objektu, vstupuje do objektivu. V jednotlivých bodech zadní ohniskové roviny objektivu se setkávají sekundární vlny, které opustily rovinu předmětu rovnoběžně. Dochází k jejich interferenci a v souladu s Huygensovým principem se stávají zdrojem nových vln, které v obrazové rovině mikroskopu skládají zvětšený a převrácený obraz. Základní pojmy v mikroskopii jsou zvětšení (násobek zvětšení objektivu a okuláru), kontrast a rozlišení. Úvodní slovo 23 Rozlišovací schopnost je vzdálenost dvou bodů, které mikroskop zobrazí jako dva samostatné body. Maximální rozlišovací schopnost světelného mikroskopu je 0,2 mm. Je dána zářením, kterým objekt osvětlujeme, a vlastnostmi objektivu. Okulár pouze zvětšuje obraz tvořený objektivem. Obecně platí, že není možné rozlišit body bližší než polovina vlnové délky záření, u světla je to zhruba 250 nm. Rozlišovací schopnost u mikroskopu je dále omezena množstvím světelných paprsků, které mohou vstoupit do objektivu (světelnost objektivu). Abbého zákon 0.61 • A a = -;- n ■ sin a A - vlnová délka světla, n - index lomu prostředí před objektivem, a - polovina otvorového úhlu kužele paprsků, které mohou vstoupit do objektivu n a a jsou pro daný objektiv konstanty a celý jmenovatel ve vzorci (n • sin a) se označuje jako numerická apertura objektivu (NA). Je to jedna ze základních charakteristik objektivu a její hodnota je na objektivu uvedena. Numerická apertura nej kvalitnějších imerzních objektivuje 1,3-1,4, pro suché objektivy pak max. 1. Pro nejkratší vlnové délky (400 nm) se rozlišovací schopnost mikroskopů blíží hodnotě 0,17 um. Rozlišovací schopnost mikroskopu lze zvýšit snížením A -použití modrého světla (modrý filtr), proudu elektronů (elektronová mikroskopie) nebo zvyšováním n - použití imerzního oleje, vody. Přidáním imerzního oleje, který má vyšší index lomu než vzduch, mezi preparát a objektiv se předchází ztrátám světla, které se láme na rozhraní preparát/prostředí. Do objektivu dopadne větší množství paprsků. Metody zvyšující kontrast zobrazení ve světelném mikroskopu jsou: Zástin clona zachycuje paprsky procházející přímo do objektivu. Objekty jsou osvětleny z boku a my pozorujeme pouze světlo, které se na nich láme nebo odráží. Podobného efektu dosáhneme tím, že na zdroj světla položíme minci. Fázový kontrast (obr. 9) slouží k pozorování nativního preparátu (živé nebarvené nefixované buňky). Na kondenzor se umístí maska s kruhovou štěrbinou, kterou proniká světlo do objektu. V objektivu, v místě obrazu kondenzorové masky, je umístěna fázová maska (označení objektivu Ph). V místě štěrbiny u kondenzorové masky je u fázové masky napařena polopropustná vrstva kovu, který mění fázi světla o čtvrtinu vlnové délky. Díky tomuto uspořádání prochází nedifraktované (neohnuté) záření ze zdroje částí fázové masky, která mění fázi světla. Ostatní vlnění, které se na objektu ohnulo nebo zlomilo, projde beze změny. Tato technika převádí rozdíly v posunu fáze světla procházejícího různými části objektu, které nevidíme, na rozdíly v intenzitě světla, které můžeme pozorovat. Lze pozorovat tvar buněk, pohyb. „Husté" části buňky s vysokým indexem lomu jsou zářivé. Toho se využívá při pozorování endospor vně i uvnitř buněk, pokud je buňka tvoří. Pro fázový kontrast je charakteristický tzv. „haló" efekt (zářivá korona) kolem buněk. 24 Uvod pro práci s mikroskopem Obr. 9: Fázový kontrast. Bacillus cereus (A), haló efekt kolem buněk a zářící endospory; Sporo-sarcina ureae (B), z balíčku jsou vidět pouze horní 4 buňky tvořící endospory (archiv autorek) Nomarského diferenciální interferenční kontrast pracuje se dvěma koherentními (interference schopnými) paprsky, jeden prochází objektem, druhý mimo objekt. Hranol dělí původně lineárně polarizované světlo na dvě vzájemně kolmo polarizované složky. Polarizátor srovnává vlny, jež jsou v různých rovinách. Nomarského destička v kondenzoru je hranol, jež zpracovává polarizované světlo tak, že na preparát jdou dva paprsky souběžně vedle sebe. V analyzátoru vidíme 3D obraz v závislosti na různém indexu lomu různých částí buňky. Zvýrazněním i malých rozdílů vznikne plastický obraz povrchu buňky (obr. 10). m f kf T 1 r Obr. 10: Nomarského kontrast, Bacillus cereus (archiv autorek) Postup 25 Postup • Zapnout zdroj světla a na stolek vsunout preparát. • Regulátor světla a kondenzor není potřeba nastavovat. • Objekt hledat pomocí makroposuvu a doostřit mikroposuvem. • Postupně zvyšovat zvětšení výměnou objektivů na revolveru, objektiv nesmí narazit na sklíčko preparátu! • Objektivy na revolveru jsou obvykle parfokální (zaostřeny na přibližně stejnou vzdálenost), po výměně objektivu není třeba objekt znovu hledat, ale stačí doostřit mikroposuvem. • Revolverový měnič objektivů slouží pro výběr vhodného objektivu. • Objektivy označené Ph slouží pro pozorování preparátů při fázovém kontrastu. • Pro objektivy s černým a bílým pruhem (objektiv lOOx) je vždy nutné použít imerzní olej! Pro objektivy zvětšení lOx, 20x a 40x se imerzní olej nepoužívá! • Při použití imerzního oleje je objektiv nezbytné po skončení pozorování vyčistit směsí etanolu a etheru! Použití imerzního oleje • Zaostřit objekt největším neimerzním objektivem (nejčastěji 40x). • Otočit revolver do polohy mezi tento a imerzní objektiv a na místo preparátu, které pozorujeme, kápnout kapku imerzního oleje. • Otočit revolver na imerzní objektiv, který se musí ponořit do oleje a doostřit mikroposuvem. • Pokud objekt není vidět, je třeba přiblížit objektiv k preparátu, nesmí do něj narazit. Zboku sledovat objektiv a stolek s preparátem. • Následně je třeba pomalu pohybovat objektivem směrem od preparátu a pozorovat, dokud není vidět preparát v okulárech. Pokud stále není nic vidět, ostření opakujeme. Zhodnocení cvičení • Podařilo se zaostřit na preparát? Byl patrný rozdíl při pozorování vzorku v jasném poli, fázovém a Nomarského kontrastu? Další informace k této problematice najdete v následující literatuře • Matis D., Mikroskopická technika. ISBN: 80-968522-0-5, 2001. • Plášek J., Nové metody optické mikroskopie. Pokroky matematiky, fyziky a astronomie, 1996, 41: 1-24. • Harley J., Laboratory exercises in mikrobiology, 2013, ISBN-10: 0077510550. 26 Uvod pro práci s mikroskopem • Hrazdíra L, Mornstein V., Lékařská biofyzika a přístrojová technika, Neptun, Brno, 2004, ISBN-10: 80-902896-1-4. • Virtuální mikroskopování http://olympus.magnet.fsu.edu/primer/virtual/virtual.html, 18. 2. 2017 • Vlnová optika http://www.sweb.cz/radek.jandora/fll.htm • Davidson M., W., Abramowitz M., Optical microscopy, dostupné z https://cw.fel.cvut.cz/ wiki/_media/courses/a6m33zsl/davidson-abramowitz-optical_microscopy.pdf (18. 2. 2017) Kontrolní otázky 1. K čemu slouží makro- a mikroposuv? 2. Proč se nesmí po použití imerzního oleje znovu použít neimerzní objektiv? 3. K čemu slouží imerzní olej? 4. Co je podstatou fázového kontrastu? 5 Makroskopické a mikroskopické pozorování mikroorganizmů, Gramovo barvení Cíl cvičení Zjištění morfologie mikrobiálních kultur - makroskopicky. Gramovo barvení. Pozorování a hodnocení mikroskopických preparátů. Úvodní slovo Morfologické a cytologické znaky pomáhají identifikaci, jejich pomocí se provádí kontrola kontaminace kultury a může se posoudit fyziologický stav kultury. Makroskopické a mikroskopické znaky se hodnotí vždy současně. Makroskopické znaky V tekutých půdách makroskopické znaky nelze hodnotit. Při růstu v tekutém médiu lze hodnotit charakter růstu (obr. 11) přítomností sedimentu (fakultativně aerobní kultury), difúzního zákalu (aerobní kultury mají zákal v celém médiu), blanky na povrchu kapaliny (špatná smáčivost buněk či mycelia, povrchové napětí, u většiny kultur tvořících drsné vrásčité kolonie), hrubých vloček (aerobní kultury), mázdry (povrchový útvar sedlinotvorných kvasinek, po vyčerpání sacharidů dochází k aerobnímu využití vyprodukovaného etanolu) a zbarvení Difúzni zákal v celém médiu w Růst pouze ve svrchní vrstvě Růst pod svrch ní vrstvou média Tvorba hrubých vloček Obr. 11: Růst mikroorganizmů v tekutém médiu (Prescott, 2013, upraveno) Makroskopické hodnocení spočívá v popisu kolonií. Vzhled kolonií je ovlivněn typem živného média, stářím kultury a typem kultivace. Na šikmém agaru nelze hodnotit jednotlivé kolonie. Lze posoudit rychlost růstu, tvar nátěru (rovný, plný, bodový, ostnitý, rhizoidní), profil nátěru (plochý, vypouklý), povrch nátěru (lesklý, drsný, suchý), konzistenci a pigmenty. Pomocí růstu ve vpichu šikmého agaru lze určit nároky mikroorganizmu na kyslík: aerobní rostou v horní části vpichu, anaerobní u dna a fakultativně anaerobní po celé délce vpichu. Kolonie je klon buněk narostlý z jednotlivé buňky. Na Petriho miskách lze při správně provedeném křížovém roztěru pozorovat a hodnotit jednotlivé kolonie (obr. 12): velikost (průměr; mm), tvar (pravidelný, kulatý, oválný, nepravidelně laločnatý, vláknitý, rhizoidní, plazící se), profil (vyvýšený, plochý, pupkovitý, miskovitý), okraj (pravidelný, filiformní, laločnatý, okrouhlý), povrch (hladký, lesklý- S - fáze, matný, drsný - R- fáze), transparence (průhledná, průsvitná, neprůsvitná), barva (bezbarvá, pigmentace). Další charakteristiky, které se mohou posuzovat, jsou 28 Makroskopické a mikroskopické pozorování mikroorganizmů, Gramovo barvení vůně, zápach (po jasmínu, žluklém másle, ovocný), tvorba mycelia, změny média (dvorec zbarvení, hemolýza, precipitát), konzistence, která se zjišťuje bakteriální kličkou (viskózni, mazlavá, drobivá, zarůstající do agaru). PROFIL TVAR OKRAJE bradaviitý Obr. 12: Tvary bakteriálních kolonií (Rosypal, 1981) Nerovnosti růstu kolonií mohou být způsobeny stářím kultury. Mukoidní (M) charakter růstu se projevuje jako vlhké, slizovité a velmi lesklé kolonie tvořené opouzdřenými buňkami (např. Azotobacter, Leuconostoc). Hladké (S) kolonie mají rovný okraj s leskem nebo bez lesku u neo-pouzdřených buněk. Drsné (R) kolonie se vyznačují suchými, nerovnými okraji. Liší se výškou vrásnění. V drsných koloniích rostou buňky tvořící řetízky, mycelia či pseudomycelia (např. Ba-cillus, Trichosporon, kvasinky Pichia, Hansenula, Candida). Změny typu kolonií M - S - R jsou důsledkem mutací. Například mikroorganizmy z infekčního materiálu jsou většinou typu M, ale po několika přeočkováních se makroskopicky změní na typ S; zpětná změna z S na M typ je výjimečná. Fenotyp S, M a R je ovlivněn složením média. Zkvasitelné sacharidy (20 %) podporují S a M typ. Tenzidy způsobují hladké až lesklé fenotypy R typů. Mikroskopické znaky U mikroskopických preparátů se hodnotí tvar, velikost a uspořádání buněk, přítomnost zvláštních útvarů na buňce, způsob rozmnožování viditelný v preparátu. Preparáty lze pozorovat v nativním preparátu ve fázovém kontrastu nebo zvýraznit morfologii buňky a jejích struktur fixací a barvením (např. Gramovo, Ziehl-Nielsenovo barvení). U nativního preparátu (pozorování suspenze) se na podložní sklíčko vždy přikládá krycí sklíčko. Při pozorování plísní, kvasinek či aktinomycet se využívá sklíčkových kultur (krycí sklíčko je vytaženo z agaru, ve kterém bylo během kultivace zapíchnuto, je kulturou porostlé). Buňky mohou mít rozmanité tvary (obr. 13): koky (sférické, zploštělé, diplokoky, streptokoky, tetrády, sarciny, stafylokoky), tyčinky (rovné, zakřivené, větvící se, palisády, pleomorfní), kokobacily, buňky s pupeny či prostékami, spirily, hvězdice, mycelia. Úvodní slovo 29 Kcky kok diplokQk enkapsukwaný stafylokok diplokok ^^^^^^ Pneumococcus protaženátyEka Fusobacterium sarcina tetráda kvi ovitý tvar EJcfellovibrio O CZ) kokobaciluE bacilus diplobacilus CZX^XľľXZ) Streptobacilli iEící a s prívesky ' hvfa sto Obr. 13: Tvary bakteriálních buněk Zdroj (upraveno): Wikipedia.org - Bacterial cellular morphologies Velikost vybraných bakteriálních buněk je uvedena v Tab. 1. Tab. 1: Velikost bakteriálních buněk Mikroorganizmus Velikost (um) Chlamydia 0,3 x 0,3 Bdellovibrio 0,8 x 0,3 Rickettsia 1 x 0,3 Staphylococcus aureus 0,8-1 x 0,8-1 Escherichia coli 2-3 x 0,4-0,6 Bacillus subtilis 1,8-4,8 x 0,9-1,1 Streptomyces vlákno x 0,7-1,6 Chromatium 25 x 10 Spirochety 500 Nativní preparát Při pozorování suspenze nativního preparátu buňky nikdy nefixujeme. Preparát je nebarvený, slouží ke zjištění skutečného tvaru a struktury buněk neporušených fixací a barvením. Využívá se při pozorování růstu a množení, pohybu bakterií. Význam má při studiu buněčných útvarů, které se obtížně barví, např. spor. Pro pozorování struktur se využívá jasné pole, fázový nebo 30 Makroskopické a mikroskopické pozorování mikroorganizmů, Gramovo barvení Nomarského kontrast. Fixace preparátu Podstatou fixace je vysrážení buněčných koloidů, zejména bílkovin. Fixací buňky lépe přilnou ke sklíčku, nespláchnou se aplikací barviva či rozpouštědla a lépe přijímají barvivo. Preparát se fixuje až ve chvíli, kdy je nátěr buněk suchý, aby nedošlo k uvaření buněk. Fixace se provádí protažením podložního skla s nátěrem buněk, který je umístěn na horní straně sklíčka, nesvítivou částí plamene. Pokud byly buňky kultivovány v tekutém cukerném prostředí, je nutné buňky od média separovat centrifugací a následně je promýt vodou či pufrem. Buňky kvasinek a plísní jsou větší než buňky bakterií, tepelná fixace může pozměnit jejich tvar. Proto se většinou fixují chemikáliemi. Fixace i barvení mírně buňku deformují, jejich charakteristický tvar zůstává. Pro měření přesné velikosti buněk se využívá nefixovaný preparát negativně obarvený (obarvení okolí buňky). Barvené preparáty Slouží ke zjištění typu buněčné stěny, tvaru buněk a uspořádání jejich shluků, přítomnosti a uložení endospor, přítomnosti pouzder a vnitřních buněčných struktur (inkluzí) a životaschopnosti buněk. Pro určení morfologie buňky a charakteristických shluků stačí jednoduché barvení buněčné stěny (např. krystalovou violetí) bez rozlišování grampozitivního či gramnegativního typu. Vitální test ukazuje poměr živých a mrtvých buněk v nefixovaném preparátu. Vitální barvení je barvením mrtvých buněk, protože mrtvé buňky přijímají barvivo nebo ho efluxními systémy nevylučují (např. zředěnou Lofflerovu modř). Struktury buňky se rozlišují diferenciačným barvením, a to jak vnitřní a vnější morfologické útvary (endospory, exospory, pouzdra, buněčné stěny), tak chemické složky (barvení volutinu, glykogenu, škrobu). Diagnostické barvení napomáhá identifikaci bakterií (např. Gramovo, acidorezistentní barvení karbolfuchsinem, barvení dle Giemsy). Při negativním barvení se buňky nefixují ani se nebarví, obarveno je pouze jejich okolí (např. tuší, nigrosinem). Využívá se pro měření přesné velikosti buněk nedeformovaných fixací a barvením. Preparát se před barvením fixuje vždy kromě negativního barvení a vitálního testu. K barvení se používají zředěné vodné roztoky organických barviv, obvykle soli. Bazická barviva mají barevný kationt, kyselá potom aniont. Při barvení bakterií se většinou používají bazická barviva (např. krystalová violeť, methylenová modř, safranin, bazický fuchsin, malachitová zeleň). Barvení lze zvýraznit mořením buněk (např. fenolem, taninem), při kterém má moridlo roli prostředníka s vyšší afinitou k buňce a zároveň k barvivu, než je afinita buňky k samotnému barvivu. Gramovo barvení Gramovo barvení je jednou z nej důležitějších diagnostických metod při identifikaci bakterií. Rozlišuje skupinu grampozitivních (barví se modrofialově) a gramnegativních buněk (barví se červeno-růžově) a udává některé fyziologické a chemické vlastnosti buňky. Podstata rozdílného chování při Gramové barvení nebyla dosud uspokojivě objasněna, s největší pravděpodobností se zde však uplatňují rozdíly ve složení buněčné stěny obou skupin bakterií. Jde o barvení fixovaného preparátu krystalovou violetí a následné moření buněk jódem v roztoku KI. Vzniká komplex barvivo-jód-buněčná stěna. Rozdíl při barvení vzniká při promývání preparátu organickým rozpouštědlem (acetonem nebo alkoholem). U gramnegativních buněk odbarvovací činidlo rozpustí vnější lipopo-lysacharidovou vrstvu, komplex krystalové violeti s jódem se vymyje přes tenkou vrstvu peptidogly-kanu a buňky se odbarví, naopak grampozitivní bakterie si zbarvení ponechávají. Pro zvýraznění rozdílu se gramnegativní bakterie dobarvují jiným kontrastním barvivem (např. bazickým safrani-nem, karbolfuchsinem) a barví se do červena, růžová. Grampozitivní buňky mají v buněčné stěně navázánu krystalovou violeť, která se alkoholem nevyplavila a zůstávají zbarveny do modra, modrofialová. Chyby, které mohou nastat při barvení, jsou: příliš silný nátěr buněk na sklíčku; uvaření Seznam přístrojů a mikroorganizmů 31 buněk při fixaci; příliš dlouhé odbarvování buněk alkoholem. Gramovo barvení je do jisté míry ovlivněno fyziologickým stavem buněk, stářím kultury a složením kultivačního média. Pro barvení se využívají buňky staré 24 hodin. Buňky mohou ztratit svoji grampozitivitu např. mechanickým poškozením, UV zářením, působením kyselin, zásad či rozpouštědel. Mikroorganizmy, které se někdy barví pozitivně a někdy negativně, označujeme jako gramlabilní/gramvariabilní. Některé bakteriální rody Gramovým barvením nelze obarvit, jsou to rody bez buněčné stěny (mykoplazmata), spirálovité bakterie a silně acidorezistentní rody (myko-bakterie); např. Borrelia burgdorferi, B. recurrentis, Bartonella henselae, Chlamydia trachomatis, C. pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Coxiella burnetii, Ehrlichia chaffeensis, Anaplasma pha-gocytophilum, Legionella sp., Leptospira sp. , Mycobacterium bovis , M. tuberculosis, M. avium, M. intracellular, M. kansasii, M. leprae, M. marinum, A , Orientia tsutsugamushi, Treponema pallidum. Buněčná stěna bakterií Buňky gramnegativního typu (obr. 14B) mají buněčnou stěnu složenou z vnější lipopolysachari-dové membrány a vnitřní relativně tenké peptidoglykanové (zhruba 5-10 % buněčné stěny) vrstvy obsahující kyselinu muramovou. Spojení mezi peptidoglykanem a vnější membránou zajišťují lipo-proteiny. Lipopolysacharidy jsou složeny z lipidu A, jaderného (též základního, dřeňového) polysacharidu a O-antigenu (též O-řetězec). Vnější membrána slouží jako ochranná bariéra před vnějším prostředím, brání prostupu látek nebo postup alespoň zpomaluje (žlučové soli, antibiotika, jedy, atd.). V buněčné stěně grampozitivního typu (obr. 14A) chybí vnější membrána a peptidogly-kanová vrstva je poměrně tlustá. Někteří zástupci mohou mít jako složku buněčné stěny kyselinu teichoovou, lipoteichoovou anebo neutrální polysacharidy, u několika zástupců jsou ve stěně přítomny mykolové kyseliny. Zvláštní skupinou jsou bakterie bez buněčné stěny, tzv. mykoplazmata, které nejsou schopny syntetizovat prekurzory peptidoglykanu. Buňky jsou obklopeny pouze cytoplazmatickou membránou. Obr. 14: Buněčná stěna grampozitivního (A) a gramnegativního (B) typu (Prescott a kol., 1996, upraveno) Seznam přístrojů a mikroorganizmů Pomůcky a chemikálie • Podložní a krycí skla, očkovací kličky, lupy • Barviva pro Gramovo barvení (krystalová violeť, Lugolův roztok, safranin) 32 Makroskopické a mikroskopické pozorování mikroorganizmů, Gramovo barvení • Destilovaná voda Mikroorganizmy • Escherichia coli CCM 3954 • Pseudomonas putida, • P. fluorescens CCM 2115T • Serratia marcescens CCM 303 • Kocúria rosea CCM 839 • Micrococcus luteus CCM 169 • Bacillus cereus CCM 2010 • Bacillus subtilis CCM 2216 • Staphylococcus aureus SA 812 • Saccharomyces cerevisiae Postup • Ve cvičení každý pracuje samostatně. • Preparáty popsat buď na sklíčko či papírek přilepený ke sklíčku. Každý hodnotí a barví: • Morfologii kolonií a růstu na agarech a v tekutém médiu • Gramovo barvení - čistá a směsná kultura • Mikroskopicky pozorovat všechny kultury ve cvičení a vyhodnotit tvar buněk, tvorbu shluků a typ buněčné stěny • Nativní preparát Nativní preparát — aseptická práce při nanášení buněk na sklíčko • Dobře očištěné podložní sklíčko vyjmout z alkoholu a protáhnout plamenem. • Označit sklíčko číslem vyšetřované kultury. • Doprostřed sklíčka nanést kapku sterilní destilované vody. • Ožehnutou, vychladlou očkovací kličkou vnést do kapky malé množství kultury, rozmíchat. Kultury stačí nepatrné množství, aby preparát nebyl hustý. • Kapka se neroztírá, překrývá se krycím sklíčkem tak, aby v preparátu nebyly vzduchové bublinky (nepřikládat svrchu na kapku, ale nejprve jednou hranou, nepřitlačovat). • Přebytečnou kapalinu odsát filtračním papírem. • Buňky z tekutého média pozorovat přímo v médiu bez ředění v kapce vody. Zhodnocení cvičení 33 • Pro nativní preparát zvolit objektiv s fázovým kontrastem (Ph). • Preparát pozorovat do 5 minut od přípravy z důvodu rychlého vysychání. Gramovo barvení • Dobře očištěné podložní sklíčko vyjmout z alkoholu a protáhnout plamenem. • Označit sklíčko číslem vyšetřované kultury. • Doprostřed sklíčka nanést kapku sterilní destilované vody. • Ožehnutou, vychladlou očkovací kličkou vnést do kapky malé množství kultury. • Suspenzi z kultury rozetřít po sklíčku, nechat dobře zaschnout a fixovat plamenem (několikrát sklíčko protáhnout plamenem). • Preparát ponořit do roztoku krystalové violeti (30 sekund), barvivo opláchnout vodou. • Preparát ponořit do Lugolova roztoku (30 sekund), barvivo opláchnout vodou. • Preparát převrstvit etanolem (nebo acetonem), maximálně na 15-20 sekund. • Opláchnout slabým proudem vody. • Preparát ponořit do safraninu na 1 minutu (takto se dobarví pouze buňky gramnegativní, u kterých došlo k vyplavení krystalové violeti; safraninem však dobarvujeme každý preparát, i když předpokládáme přítomnost grampozitivních buněk - předem nevíme, o jaký typ buněčné stěny se v preparátu jedná). • Preparát osušit mezi dvěma filtračními papíry a pozorovat při zvětšení lOOOx (s imerzním objektivem) v jasném poli (označení objektivu BF). Zhodnocení cvičení • Podařilo se správně obarvit a pozorovat kultury? • Pokud ne, proč? 34 Makroskopické a mikroskopické pozorování mikroorganizmů, Gramovo barvení Na obr. 15, 16 a 17 si můžete prohlédnout křížové roztěry a mikroskopické preparáty (Gramovo barvení) kultur používaných ve cvičení. Obr. 15: Čisté kultury bakterií na agaru a obarvené dle Grama. Escherichia coli (A), Pseudomonas putida (B), Serratia marcescens (C), Saccharomyces cerevisiae (D), Bacillus cereus (E), Kocuria rosea (F), Micrococcus luteus (G), Staphylococcus aureus SA 812 (H) (archiv autorek) Obr. 16: Smíšené kultury bakterií. S. marcescens a B. subtilis (archiv autorek) Další informace k této problematice najdete v následující literatuře 35 Další informace k této problematice najdete v následující literatuře 1. Miniatlas mikroorganizmů (23. 2. 2017) 2. Prescott L., M., Harley J. P., Klein D. A., Microbiology, WCB, Dubuque, 1996, ISBN 0-697-29390-4. 3. Rosypal S., Obecná bakteriologie, SPN Praha, 1981. 4. Silhánková L., Demnerová K., Návody pro laboratoře z mikrobiologie, VSCHT, Praha, 1993. 5. Atlas mykologie, http://www.mycology.adelaide.edu.au/ (23.2.2017) 6. Centers for Disease Control and Prevention, http://www.cdc.gov/az/a.html (23.2.2017) Kontrolní otázky 1. Jaká barviva se používají při barvení dle Grama a co zde působí jako mořidlo? 2. Co všechno můžeme v preparátu (v buňce) barvit? 3. Které morfologické znaky se popisují u kolonií mikroorganizmů? 4. Jsou všechny bakterie barvitelné Gramem? Pokud ne, uveďte nějaké příklady. 5. Na čem závisí morfologie bakteriální kolonie? 6. Jaké vlastnosti bakteriálních kolonií se popisují? 7. Proč se provádí fixace preparátu? 36 Makroskopické a mikroskopické pozorování mikroorganizmů, Gramovo barvení 8. Uveďte alespoň 2 příklady bakteriálního rodu tvořícího kokovité buňky a 2 příklady buněk tyčinkovitých. 9. Jaká struktura buňky se barví Gramovým barvením a co z takto obarveného preparátu můžeme vyčíst? 10. Který objektiv poskytuje větší zvětšení - imerzní nebo suchý? K čemu imerze slouží? 11. Jak se dle Grama barví kvasinky; jaký mají typ buněčné stěny? 12. Jak se dle Grama barví Escherichia colil 13. Co je to peptidoglykan? 14. Jaké jsou hlavní rozdíly v přípravě a účelu preparátu barveného podle Grama a nativního preparátu? 15. K čemu slouží různé typy barvení buněk? 6 Bakteriofág Cíl cvičení Stanovit titr fágového lyzátu metodou dvouvrstvého agaru. Úvodní slovo Bakteriofágy (též fágy) jsou viry napadající bakteriální buňky. Velikost bakteriofágů se pohybuje od 20 do 200 nm, velikost genomu 2 až 200 kb, jsou menší než bakterie. Jejich počet je v prostředí asi desetkrát vyšší než počet bakteriálních buněk. Ze 20-50 % jsou příčinou jejich mortality, napomáhají koloběhu látek, zvyšování množství organických látek v prostředí. Geneticky se neshodují s ostatními viry (viry živočichů a rostlin). Evoluce fágů probíhá současně s evolucí bakterií, jsou kontinuálně se vyvíjejícím rezervoárem genů. Nukleová kyselina bakteriofága (jedno nebo dvouřetězcová, kruhová nebo lineární, DNA nebo RNA) je uložena v proteinové kapsidě většinou tvaru ikosaedru, která je pomocí krčku spojena s bičíkem umístěným v kontraktilní pochvě. Na bazálni ploténku bičíku jsou napojena bičíková vlákna pro přichycení na povrchové receptory bakteriálního hostitele (obr. 18). Obr. 18: Struktura T4 bakteriofága (Prescott a kol., 1996, upraveno) Rozmezí bakteriálního hostitele může být u fágů velice úzké či naopak široké. Některé fágy jsou natolik specifické, že se množí jen v určitých kmenech konkrétního bakteriálního druhu. Fágy se širokým spektrem hostitele se nazývají fágy polyvalentní. Chimérní fág vzniká homologní rekombinací mezi dvěma fágy, má vlastnosti od obou původních fágů. Podle průběhu životního cyklu se fágy dělí na dvě skupiny: Virulentní fágy s lytickým životním cyklem (obr. 19A) způsobují lyži hostitelského kmene bakterie. Životní cyklus má tyto fáze: 1. adsorpce virionu na povrch vnímavé buňky (u grampozitivních bakterií většinou na teichoové kyseliny), penetrace nukleové kyseliny fága do cytoplazmy buňky, 2. replikace fágové DNA s využitím RNA polymerázy hostitele, syntéza rané mRNA fága a proteinů kontrolujících syntézu dalších virů, syntéza pozdních bílkovin fága, 3. kompletace nových virových částic (virionů), 4. uvolnění virionů do vnějšího prostředí umožněné syntézou endolyzinů a lyží buňky. Uvolněné viriony pak mohou infikovat další citlivé buňky. 38 Bakteriofág Pokud lytická infekce probíhá v tekutém médiu s narostlými buňkami hostitelského kmene, dojde po určité době k vyčeření a dostaneme tzv. fágový lyzát (kultivační prostředí obsahující aktivní virové částice, zbytky membrán a vylitý buněčný obsah). Pokud probíhá lyže u hostitelského kmene na agaru, vznikají plaky, projasněná místa. Temperované fágy s lyzogenním cyklem (obr. 19B) se rekombinací začleňují do ge-nomu hostitele, jejich nukleová kyselina se replikuje a přenáší na potomstvo spolu s genomem. Takový fág se nazývá profág, může se uvolnit a vyčlenit z nukleové kyseliny bakteriální buňky po působení některých vnějších faktorů (např. UV záření, působení mutagenů či stresových faktorů). Při chybném vyčlenění (tj. při posunutí čtecího rámce) se může spolu s genetickou informací fága vyčlenit i část genomu hostitelské bakterie, která je součástí nové virové částice a může být šířena dál. Tento proces se nazývá transdukce a např. u druhu Staphylococcus aureus je nejčastějším způsobem horizontálního přenosu genů, který viru může přinášet určitým způsobem výhodné geny. Stejně tak i bakteriím, neboť bakteriofágy napomáhají například v shiftech sérotypů bakterií (serotype-converting phages). Hlavičky jsou plněny dna (3) Syntéza prázdných fágových hlaviček, Fágová dna řídí buněčný metabolizmus k produkci virových složek - proteinů a kopii fág o vé dna (2). Binárni děleni, každá buňka obsahuje inkorporovanou fáaovou dna Límeček, bičík a bazálni destička jsou pripojený k hlavičce, bičíková vlákna jsou připojena ako poslední (3). Lyže bakteriální buňky, uvolnění kompletních infekčních fágů (4). Fág se přichytil nareceptor na buněčné stěně bakterie, kterou proniká a vsunuje svou dna rn. \ Fágová dna se vkládá do bakteriálního chromozomu. o O \o o) LYZOGEKN"! CYKLUS G Fág je replikován společně s bakteriální DNA před binárním dělením. Obr. 19: Životní cyklus fága (zdroj: Virtual Learning Environment - Viruses; upraveno) Infekce bakteriální buňky fágem nemusí být vždy úspěšná. Některé bakterie překrývají receptory pro navázání fágů např. proteinem A, anebo pokud infekce a penetrace proběhne, bakterie aktivují reštrikčné modifikační systémy a endonukleázy rozštěpí cizorodou nukleovou kyselinu. To jsou hlavní problémy fágové terapie. Řešením je izolace fágových mutant, které jsou schopné překonat obranné mechanizmy hostitele a lyžovat původně necitlivé kmeny. Fágová terapie je použití fágů k léčbě bakteriálních infekcí. Bakteriofágy schopné lyže patogenních bakteriích se dostaly do popředí zájmu po objevu bakteriálních kmenů rezistentních na záložní antibiotika (např. meticilin). Jedny z prvních výzkumů fágové terapie probíhaly od 60. let v zemích bývalého Sovětského svazu; v Gruzii bylo do studií zahrnuto až 31 tisíc dětských pacientů trpících průjmy. Západní Evropa a USA se k výzkumu připojily později. Bakteriofágy byly v minulosti hojně užívány k léčbě a prevenci infekcí. Zatímco dříve byly pro fágovou terapii využívány preparáty obsahující celé fágové částice, v současnosti otevírá nové možnosti v boji proti obtížně léčitelným infekcím izolace dobře charakterizovaných purifikovaných fágových komponent s antimikrobiálními vlastnostmi. Dnes je fágová terapie rozvíjena zejména Seznam přístrojů a mikroorganizmů 39 u infekcí vyvolaných bakteriálními rody Staphylococcus, Streptococcus, Pseudomonas, Proteus, Klebsiella, Shigella, Salmonella, Escherichia, Enterococcus a Listeria. Výhodou fágové terapie je vysoká speciŕita k cílovému kmeni hostitele, fágy nejsou nebezpečné pro přirozenou mikroflóru pacienta. Specifita fága však vyžaduje velmi přesnou diagnostiku patogena a stanovení jeho citlivosti k danému fágu. Výhodné je používat polyvalentní fágy nebo jejich směsi, které jsou schopné lyžovat většinu patogenních kmenů daného druhu, které se podílejí na vzniku infekce. Bakteriofágy jsou schopny pomnožit se v místě infekce, proto je možné podat pacientovi malou jednorázovou dávku preparátu. Naproti tomu antibiotika jsou metabo-lizována, eliminována z organizmu a nekoncentrují se v místě infekce, což vyžaduje opakované dávky. U fágových preparátů nebyly, až na několik výjimek, dosud pozorovány závažné vedlejší účinky, ve srovnání s antibiotiky. Problém může nastat při uvolnění endotoxinů do organizmu pacienta v důsledku lyže bakteriálních buněk. Případný vznik rezistence na určitého fága je často spjat se ztrátou patogenity příslušného bakteriálního kmene. Povrchové buněčné komponenty, fágové receptory, bývají spojené s bakteriální virulencí a jejich mutace vede současně ke ztrátě obou uvedených funkcí. Naproti tomu kmeny rezistentní na antibiotika si uchovávají vlastnosti virulence. Vývoj nových antibiotik je zdlouhavý a nákladný. Vyhledání nového terapeutického fága proti rezistentnímu bakteriálnímu kmeni je rychlejší a levnější proces. Fágová terapie se nevyužívá pouze v medicíně, ale také při ošetřování potravin proti bakteriálnímu napadení, ve fytoterapii, v pěstitelství a rostlinné výrobě proti bakteriálnímu onemocnění rostlin. Ke stanovení počtu fágových částic se používají nepřímé metody založené na tvorbě plak. Plaky jsou projasněné zóny na tuhém médiu souvisle porostlém hostitelským bakteriálním kmenem. Vznikají v místě, kde se v okamžiku očkování nacházela jedna aktivní fágová částice, která dala po infekci vznik dalším virionům, ty napadly okolní citlivé buňky. V několika po sobě následujících lytických cyklech dochází k lyži velkého počtu sousedních hostitelských buněk a vzniká plaka. Základním předpokladem metody je, že počet hostitelských buněk musí být vyšší než počet fágových částic. Seznam přístrojů a mikroorganizmů Pomůcky a chemikálie • masopeptonový bujón (MPB) • masopeptonový agar (MPA) - 2 % a 0,7 % • sterilní tris HCl pufr (pH 7,2) • sterilní 0,22 % CaCl2 • sterilní Petriho misky, pipety, zkumavky, vodní lázeň, termostat Mikroorganizmy • Staphylococcus aureus SA 812, stafylofág 812 40 Bakteriofág Postup Příprava fágového lyzátu • 2 ml narostlého 24 hodinového inokula S. aureus SA 812 naočkovat do 100 ml čerstvého MPB v prevzdušňovači láhvi a za intenzivního prevzdušňovaní pokračovat v kultivaci další 4 hodiny při teplotě 30 °C. • Po 4 hodinách aseptický přidat 10 ml sterilního 0,22% CaCl2 a 5 ml zásobního lyzátu fága 812 a pokračovat v kultivaci. • Po 60 minutách přemístit prevzdušňovači láhev do temna a laboratorní teploty. • Za 12-24 hodin se médium vyčeří, přesto v něm zůstává určitý počet necitlivých buněk. • Lyzát sterilizovat přídavkem chloroformu (5-10 kapek na 10 ml lyzátu), nechat působit 1-2 hodiny, lyzát stáhnout sterilní pipetou a přenést do sterilní baňky. • V takto připraveném lyzátu se při teplotě 4 °C významně nemění počet aktivních fágových částic po dobu 1-2 měsíců. Příprava hostitelských buněk • Ze zásobní kultury S. aureus SA 812 naočkovat 20 ml sterilního MPB (ve 100mi baňce) a kultivovat 24 hodin při teplotě 30 °C. Stanovení počtu virionů: • Lyzát fága 812 zředit ve sterilním tris HC1 pufru, vždy sterilně přenášet 0,1 ml lyzátu nebo předchozího ředění do 0,9 ml pufru, na každé ředění použít novou sterilní špičku, dobře promíchávat! • Připravit sterilní zkumavky, které budou obsahovat 3 ml 0,7% MPA, rozvařeného a vytem-perovaného na 45 °C. • K 20 ml hostitelských buněk sterilně přidat 2 ml 0,22% CaCl2 a pipetovat 0,3 ml inokula do každé zkumavky. • Na bakteriologické plotny s 2% MPA pipetovat 0,1 ml příslušných ředění fága, ihned po pipetování misku zalít obsahem jedné zkumavky, krouživým pohybem agar promíchat s pi-petovanou kapkou a ve vodorovné poloze nechat utuhnout. • Misky umístit dnem vzhůru do termostatu a kultivovat při 30 °C 12-24 hodin. Zhodnocení cvičení • Spočítat počet plak na miskách (obr. 20) s nejvhodnějším ředěním (na misce okolo 20-200 plak). K miskám, na kterých je méně než 10 plak při hodnocení nepřihlížet. Výsledek je v jednotkách PFU/ml (plaques forming units, počet fágových částic schopných vytvářet plaky v 1 ml, nikoliv absolutní počet virionů). Další informace k této problematice najdete v následující literatuře 41 Obr. 20: Plaky vzniklé vysetím řady ředění (ředění 10 3 až 10 10) fágového lyzátu (archiv autorek) U ředění 10-3 došlo k lyži veškerých buněk, naopak u ředění 10-10 k lyži buněk nedošlo. Pro výpočet je nejvhodnější ředění 10-7. Příklad výpočtu: Na 3 miskách (0,1 ml vzorku ředění 10_5/miska) se vytvořilo 122, 132, 139 plak, aritmetický průměr je 131 plak. Titr lyzátu je = 131 • 105 = 1, 31 • 107 v 0,1 ml, tedy 1, 31 • 108 PFU/ml Další informace k této problematice najdete v následující literatuře • Eyer L., Pantůček, R., Růžičková V., Doškář J., Nové perspektivy fágové terapie, přehledový článek v Klinická mikrobiologie a infekční lékařství, 2007. • Skripta Praktikum z mikrobiologie • Otradovcová L., Izolace a charakterizace mutant polyvalentního stafylokokového bakte-riofága účinných proti methicilin-rezistentním kmenům Staphylococcus aureus, Diplomová práce, MU, Brno, 2012. Kontrolní otázky 1. Čím se liší bakteriofágy od virů rostlin a živočichů? 2. Jaký je význam virů pro přenos genetické informace v prostředí? 3. Čím jsou viry prospěšné při terapii onemocnění? 4. Co je nutné mít pro kultivaci bakteriofága? 5. K čemu slouží CaCl2? 7 Bakteriofág — transdukce Cíl cvičení Ověřit správný průběh transdukce přenesením rezistence k antibiotiku z donorových na recipientní bakteriální buňky. Úvodní slovo Transdukce je přenos genetického materiálu prostřednictvím viru z buňky donorové do buňky recipientní. Pomocí bakteriálních virů (též bakteriofágů či fágů) lze přenést jakýkoli fragment chromozomu z donorové bakteriální buňky do buňky recipientní, jedná se o horizontální výměnu genetické informace. Přenesený fragment pak rekombinuje s homologickým úsekem recipientní buňky, integruje se do jejího genomu, což se projeví v jejím fenotypu. Mechanizmus přenosu není zcela objasněn, ale pravděpodobně jde o chybu při sbalování DNA do fágové hlavy během sestavování fágových částic v infikované buňce. Místo replikované fágové DNA je do fágové hlavy zabalena DNA donorové buňky, část chromozomu nebo plazmid, který může být přenesen fágem do recipientní buňky. V literatuře je v současnosti popsáno více než 250 stafylokokových bakteriofágů. Schopnost transdukce mají pouze některé z nich, a to fágy náležící do sérologické skupiny B a příbuzné skupiny F. Za prototyp transdukujícího fága je považován fág 011 sérologické skupiny B, který je schopen zabalit do své hlavy chromozómami nebo plazmidovou DNA až do velikosti svého genomu, t.j. 45 kb. Indukovat fága lze UV zářením nebo mitomycinem C z chromozomu kmene NCTC 8325, kde je integrován ve formě profága. Dalšími bakteriofágy s vysokou efektivitou transdukce jsou např. fágy 52A, 53 a 80. V současnosti je u Staphylococcus aureus metoda transdukce využívána k cílenému vnášení mobilních genetických elementů do kmenů a k přípravě pozměněných variant kmenů, ke studiu horizontálního přenosu genů a k identifikaci přenášených genů. Seznam přístrojů a mikroorganizmů Pomůcky a chemikálie • MPA, MPB • roztok CaCl2, citrát sodný • tetracyklín • centrifuga Mikroorganizmy • Donorový kmen Staphylococcus aureus Jevons B (obsahuje 2 plazmidy, rezistence na kadmium a tetracyklín) • Recipientní kmen Staphylococcus aureus RN4220 • Transdukující fág JB CCM 7872 Postup 43 Postup Příprava transdukujícího fágového lyzátu • Očkovat donorový kmen (20 ul zamražené kultury do 20 ml MPB) a inkubovat při 37 °C po dobu 18 hodin. • Přenést 2 ml 18hodinové kultury do 50 ml čerstvého MPB v prevzdušňovači láhvi a inkubovat při 37 °C po dobu 2 hodin za intenzivního prevzdušňovaní. • Přidat 6 ml lyzátu fága, roztok CaCl2 do výsledné koncentrace 2 niM a inkubovat za stejných podmínek jako při 37 °C po dobu 2 hodin za intenzivního prevzdušňovaní (zásobní roztok CaCl2 o koncentraci 0,02 M, pro dosažení výsledné koncentrace přidat 1/10 objemu). • Uskladnit lyzát přes noc v lednici (dokončení lyže, v případě úplné lyže bakteriální kultury bezprostředně po ukončení inkubace lze tento krok vynechat). • Odstranit zbytky buněk donorového kmene centrifugací (5000 rpm / 30 minut) a filtrovat přes 0,45 um bakteriologický filtr. • Stanovit titr fágových částic v lyzátu metodou dvouvrstvého agaru (pro výpočet frekvence transdukce). Transdukce plazmidů • Očkovat recipientní kmen (20 ul zamražené kultury do 20 ml MPB) a inkubovat při 37 °C po dobu 18 hodin. • Stanovit titr recipientního kmene (pro výpočet frekvence transdukce). • Přidat roztok CaCl2 ke kultuře recipientního kmene do výsledné koncentrace 2 mM (zásobní roztok CaCl2 o koncentraci 0,02 M, pro dosažení výsledné koncentrace přidat 1/10 objemu). • Smíchat 1 ml kultury recipienta s 1 ml transdukujícího fágového lyzátu tak, že hodnota multiplicity infekce (poměr počtu fágových částic k počtu buněk) bude max. 1. • Inkubovat transdukční směsi při 37 °C po dobu 25 minut za stálého třepání. • Přidat roztok citrátu sodného k transdukční směsi do výsledné koncentrace 15 mM, cent-rifugovat (3000 rpm / 10 minut / 4-8 °C) a resuspendovat pelet v roztoku 17 mM citrátu sodného. Objem pro resuspendaci závisí na počtu misek, na které se bude transdukční směs vysévat a na množství směsi vyseté na jednu misku, ideálně 100-300 ul (roztok citrátu sodného se zásobní koncentrací 0,03 M - k transdukční směsi se přidá v poměru 1:1; roztok se zásobní koncentrací 0,017 M - pro resuspendaci peletu). • Vyset transdukční směs na misky s MPA obohaceným o citrát sodný (20 mM) a tetracyklín, 5 ug/ml (roztok citrátu sodného se zásobní koncentrací 1 M - do 100 ml rozvařeného sterilního média přidat 2 ml. Tetracyklín v zásobní koncentraci 5 mg/ml - do rozvařeného sterilního média přidat 1/1000 objemu). • Inkubovat misky při 37 °C po dobu 24 hodin. • Zjistit počet kolonií transduktant na miskách. Výpočet frekvence transdukce je podíl počtu transduktant (CFU/ml - colony-forming units/1 ml) k počtu fágových částic v transdu-kujícím lyzátu (PFU/ml - plaque-forming units/1 ml). 44 Bakteriofág - transdukce Zhodnocení cvičení • Došlo k přenosu plazmidu? • Jak jsme přenos ověřili? Další informace k této problematice najdete v následující literatuře • Rosypal S., Doškář J., Pantůček R., Kailerová J., Relichová J., Růžičková V., Šmarda J. ml., Šmarda J., Štěpán J., Terminologie molekulární biologie, MU Brno, 2001. • Varga M., Charakterizace systému nespecifické transdukce plazmidů u Staphylococcus aureus. Dizertační práce, MU Brno, 2013. • Varga M., Transdukce plazmidů zprostředkovaná profágy kmenů Staphylococcus aureus. Diplomová práce, MU Brno, 2009. Kontrolní otázky 1. Co ověříme pomocí kontrol? (a) Miska s antibiotiky + donorový kmen (b) Miska s antibiotiky + recipientní kmen před transdukcí (c) Miska bez antibiotik + recipientní kmen před transdukcí 2. Na jaké z kontrolních misek buňky narůst mají/nemají? 3. Co je transdukce? 4. Používají se pro transdukcí fágy s lytickým nebo lyzogenním cyklem? Proč? 8 Nepřímé stanovení počtu životaschopných bakterií plotnovou metodou Cíl cvičení Získání řady ředění kultury mikroorganizmu. Stanovit počet životaschopných buněk. Úvodní slovo Pro stanovení počtu buněk ve vzorku se využívají přímé a nepřímé metody. Mezi přímé metody patří stanovení počtu buněk pomocí mikroskopu, počítání samotných buněk v preparátu ze vzorku, bez kultivace. Výhodou je rychlost a stanovení počtu jak živých tak mrtvých buněk či jejich poměr, např. porovnáním poměru neobarvených živých buněk s počtem mrtvých, které se obarvují. Mezi nepřímé metody patří metody kultivační. Kultivací části vzorku zjistíme počet životaschopných buněk, které vytvoří kolonie. Při některých fyziologických a genetických experimentech je nutné znát počet buněk ve vzorku. Počet buněk slouží jako standard pro porovnávání výsledků. Jednotkou výpočtu plotnové metody je počet životaschopných (na plotnách rostoucích) buněk v 1 ml média/vzorku, tzv. colony forming units - CFU/ml. Plotnová metoda (kultivační nepřímá metoda) spočívá ve stanovení počtu narostlých kolonií za předpokladu, že každá buňka vytvoří jednu izolovanou kolonii. Plotnovou metodu lze provést dvěma způsoby, smícháním vzorku s tekutým temperovaným agarem nebo pipetováním vzorku na misku s agarem a rozetření L-kličkou (obr. 21). © j. Kopecká, 6. Rotková Obr. 21: Očkování suspenze buněk na misku - rozetření bakteriologickou L-kličkou (archiv autorek) Nefelometrické stanovení využívá intenzity světla odraženého od buněk, stanovení optické denzity suspenze buněk. Výhodou této metody je stanovení kalibrační křivky, počet buněk lze odečíst z lineární části křivky. Při ředění vzorku a pipetování buněk do ředícího roztoku je třeba dát pozor na rozbití buněk osmotickým šokem. Podle hustoty výchozí suspenze se určí počet zkumavek ředící řady. Pokud se očekává 0-103 CFU/ml, suspenze se jeví bez opalescence; při počtu 105 CFU/ml suspenze lehce opaleskuje; množství 107 až 109 CFU/ml vytváří mléčný zákal dle velikosti a tvaru buněk. V protokolech bývá uvedeno, s jakým počtem buněk (CFU/ml) se pracovalo případně s jakým zákalem (%). Zákal je méně přesná hodnota, která slouží pro rychlou orientaci. Ve spektrofotometru lze měřit zákal média či ředícího roztoku, který obsahuje i mrtvé buňky. Pokud se při stejné metodě opakovaně pracuje za stejných podmínek se stejně starou kulturou, tedy i stejným zákalem, lze předpokládat přibližně stejný počet živých a mrtvých buněk. V rámci daného expe- 46 Nepřímé stanovení počtu životaschopných bakterií plotnovou metodou rimentu je při opakování metody hodnota extinkce víceméně konstantní. Pro stanovení počtu buněk v různých prostředích je k dispozici řada metod, pro daný účel se volí metoda nejlépe vyhovující. Stanovení počtu mikroorganizmů se provádí v daném objemu a přepočítává se obvykle na 1 ml původního vzorku. Těmito výsledky jsou pak korigovány získané výsledky experimentů. Pomocí CFU/ml lze sledovat přírůstek buněk v čase. Pokud jsou během kultivace v tekutém médiu odebírány dobře promíchané vzorky, porovnáním počtu buněk v čase lze získat obraz o fyziologickém stavu kultury, o jejím prospívání či odumírání (účinky fyzikálních či chemických zásahů do rostoucí kultury, podpůrné či inhibující látky v potravinářství, v mikrobiálních technologiích atd.). Grafickým vynesením hodnot CFU/ml odebíraných ze vzorku v tekutém médiu (bez dodávání živin) po stejných časových intervalech lze sestavit růstovou křivku mikroorganizmu v daném prostředí. Díky stanovení počtu buněk lze hodnotit podíly jednotlivých skupin bakterií smíšené kultury v jejich celkovém zastoupení. Lze porovnávat makroskopické znaky kultivovaných zástupců a pracovat na médiích základních i selektivních, případně selektivně diagnostických. V praxi lze využít tzv. automatické počítače kolonií (obr. 22A) nebo stěrovou a výplachovou metodu pomocí analyzátoru (obr. 22B). Přístroj Lumitester PD (obr. 22B) dokáže rychle určit celkový stupeň kontaminace ovšem bez rozlišení druhů a rodů mikroorganizmů (měření luminiscence). Tento přístroj se využívá např. v potravinářských provozech. Obr. 22: Přístroje pro automatické počítání kolonií (A) a celkový stupeň kontaminace (B). Zdroj: www.marconi.sk (A; upraveno), Qualifood.cz (B; upraveno) Seznam přístrojů a mikroorganizmů Pomůcky a chemikálie • Sterilní bakteriologické plotny s MPA • Sterilní zkumavky, pipety, L-kličky • Sterilní fosfátový pufr nebo fyziologický roztok Mikroorganizmy • Micrococcus luteus CCM 169 Postup 47 Postup Ředění kultury • Do sady sterilních zkumavek pipetovat po 0,9 ml sterilního fyziologického roztoku. • Z dobře promíchaného vzorku s kulturou odebrat 0,1 ml suspenze a přenést do první zkumavky. • Promíchat čistou špičkou obsah první zkumavky (celkový objem 1 ml), odebrat 0,1 ml a přenést do další zkumavky. • Promíchat obsah druhé zkumavky a 0,1 ml přenést do třetí zkumavky. Takto pokračovat až na konec ředící řady (Obr. 23). Očkování • Popsat Petriho misky s MPA na víčko (kolonie se budou počítat tečkováním dna misky popisovačem). • Ze zkumavek s ředěním 10-4 až 10-6 pipetovat 0,1 ml suspenze do misky. Pro každé ředění používat minimálně dvě misky, lépe tři, pro vytvoření průměru z ředění. • Pipetovaný objem rozetřít sterilní L-kličkou krouživým pohybem po celém agaru, dnem misky otáčet proti pohybu roztírání, netlačit na L-kličku. Při pipetování a roztírání otevírat misky co nejméně. Vzorek rozetřít rovnoměrně, aby kolonie narostly izolovaně. • Misky kultivovat dnem vzhůru 2-3 dny při 30 °C. Kontrola sterility ředícího roztoku • Ze zásobního fyziologického roztoku odebrat 0,1 ml, pipetovat na misku a rozetřít sterilní čistou L-kličkou. Kultivovat dnem vzhůru 2-3 dny při 30 °C. OJml 0,1 m! 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml y . . . A /N /N°': f MPA JMPA JlPf MPA IMPAli MPA lMPAfc/IPA] 6 x 0,9 ml fosfátového pufru Kontrola: 0,1 ml fosfátový pufr © G. Rotková Obr. 23: Schéma postupu plotnové metody (archiv autorek) 48 Nepřímé stanovení počtu životaschopných bakterií plotnovou metodou Hodnocení K hodnocení vybrat dvojici (trojici) misek vhodného ředění (obr. 24, misky se zhruba 20-200 koloniemi) a spočítat počet kolonií. Kolonie počítat ze dna misky a označit popisovačem na sklo tečkou. Ze získaných hodnot vypočítat průměr, číslo vynásobit kladnou hodnotou ředění a hodnotou 10 (na misku se nanášelo 0,1 ml, výsledek je přepočítaný na 1 ml). Získaný údaj je hodnota CFU/ml (colony forming units, počet bakterií schopných vytvořit kolonii/ml). CFU/ml = průměrný počet kolonií • hodnota ředění (kladný exponent) • 10 Správný formát výsledku je např. 2, 4 • 104 CFU/ml, nikoli 24 • 103 CFU/ml. Obr. 24: Plotnová metoda. Vhodné ředění pro počítání kolonií je v tomto případě ředění 10 6 (C), ředění 10-4 (A) a 10-5 (B) obsahuje příliš vysoký počet kolonií (archiv autorek) Zhodnocení cvičení 49 Zhodnocení cvičení • Které ředění při odečítání výsledků (počtu kolonií) bylo nej vhodnější? • Jaký byl počet (CFU/ml) buněk v původním vzorku? Probíhala práce aseptický? Pokud ne, proč? • Byl zaznamenán velký rozdíl v počtu kolonií mezi miskami jednoho ředění (nesprávně promíchaný vzorek)? • Došlo k nárůstu bakterií na kontrolních miskách s rozetřeným pufrem? • Mohla kontaminace ovlivnit celkový počet CFU/ml, proč (morfotyp kolonií)? • Byl vzorek dobře počitatelný (špatně rozetřený vzorek)? Další informace k této problematice najdete v následující literatuře • Klaban V., Ilustrovaný mikrobiologický slovník, Galén, Praha, 2005, ISBN 80-7262-341-9. Kontrolní otázky 1. Jaký je výpočet CFU/ml u plotnové metody, co znamenají jednotlivé členy vzorce? 2. Plotnovou metodu jsme prováděli na neselektivním médiu a pracovali jsme s čistou kulturou. Kdy se využívá plotnová metoda na selektivních médiích? 3. Pokud bychom při plotnové metodě místo kultury mikrokoka použili např. rybniční vodu. Stanovíme CFU/ml, jak a proč se bude lišit morfologie narostlých kolonií od nárůstu ředěné kultury mikrokoka? Budou kolonie rybniční vody také jediného morfologického typu? 4. Podle čeho zvažujeme množství zkumavek s pufrem (délku ředící řady) plotnové metody, kdy stačí využít jednu či dvě zkumavky a kdy je potřeba mnohem vyššího počtu? 5. Jaká jednotka se používá pro výpočet nárůstu při použití plotnové metody? 6. Proč a jak se při plotnové metodě provádí kontrola ředícího roztoku? 7. Co znamená zkratka CFU/ml a co vyjadřuje? 8. Proč se při plotnové metodě neočkuje bakteriologickou kličkou? 9. Vypočtěte CFU/ml, pokud byl stanoven počet kolonií 210 a 190 v ředění 10-6. Do 0,9 ml pufru v první zkumavce se pipetovalo 0,1 ml kultury. 10. Popište podstatu plotnové metody. 11. Jaký je rozdíl mezi přímým a nepřímým stanovením počtu buněk? 12. Proč je nutno promíchat zásobní vzorek a dále dobře promíchávat obsah zkumavek ředící řady? 13. Jak poznáme kontaminaci ředícího roztoku? 14. Proč se na misku při plotnové metodě neroztírá např. 1 ml vzorku? 15. Podle čeho odvodíte vhodný typ kultivačního média pro plotnovou metodu? 9 Přímé stanovení počtu buněk v Bíirke-rově komůrce, vitální test, kvasinky Cíl cvičení Stanovit procento přežívajících buněk v závislosti na době inkubace při zvýšené teplotě. Úvodní slovo Pro stanovení počtu buněk ve vzorku se využívají přímé a nepřímé metody. Mezi nepřímé metody patří metody kultivační. Mezi přímé metody patří stanovení počtu buněk pomocí mikroskopu, počítání samotných buněk v preparátu ze vzorku, bez kultivace. Výhodou je rychlost a stanovení počtu jak živých tak mrtvých buněk či jejich poměr. Pro počítání buněk v preparátu je třeba mít suspenzi s vhodnou hustotou buněk. Pro odlišení živých a mrtvých buněk se využívají barvené preparáty. Buňky se mohou spočítat i pomocí fixovaného barveného preparátu či preparát nebarveného, živé a mrtvé buňky se ale neodliší. Pro přímé stanovení se používají počítací komůrky, např. Thomova, Bůrkerova (obr. 25), což je skleněná destička s počítací mřížkou různé velikosti. Prostor mezi podložním a krycím sklíčkem je na komůrce vždy vyznačen. Pracuje se s určitým objemem vzorku, ze známého objemu se dopočítává objem vzorku pro 1 ml. Po nakápnutí promíchaného vzorku na mřížku se buňky usadí na dně a mikroskopicky lze stanovit počet buněk na daných ploškách sítě. Obr. 25: Bůrkerova počítací komůrka (archiv A. Vávrové) Vitální test (barvení nativního preparátu) slouží ke zjištění okamžitého stavu populace sledovaných buněk. Je založen na propustnosti membrány mrtvých buněk. Cytoplazmatická membrána mrtvých buněk není semipermeabilní, barvivo se dostává dovnitř. Živé buňky se naopak průniku barviva „brání" svými kanálky v membráně; barvivo nepropustí nebo ho odbourají. K barvení mrtvých buněk v prostředí buněk živých se využívá netoxických barviv, např. roztok metylenové modři zředěný a pufrovaný fosfátem s pH 4,6. Pomocí vitálního testu lze sledovat např. působení zvýšené teploty na přežívání buněk v čase. Výhodou testu je rychlost, nízká spotřeba materiálu oproti plotnové metodě a možnost rozlišení poměru živých a mrtvých buněk. Nevýhodou je, že sledované buňky nelze dále kultivovat. Vitální test se využívá v praxi při kontrole životaschopnosti mikroorganizmů během technologických procesů. Sleduje se jejich odpověď (změna počtu či poměru) na přídavek či úbytek různých látek či na probíhající fyzikální proces. Z výsledků testu vitality lze okamžitě rozhodovat o zasažení do technologického procesu během kultivace buněk. Seznam přístrojů a mikroorganizmů 51 Seznam přístrojů a mikroorganizmů Pomůcky a chemikálie • Erlenmeyerova baňka, zkumavky, pipety, kapátko • Sterilní destilovaná voda • Vodní lázeň, teploměr, mikroskop • Bůrkerova komůrka • Metylenová modř Mikroorganizmy • Kvasinky Saccharomyces cerevisiae, pekařské droždí Postup • Připravit suspenzi kvasinkových buněk z pekařského droždí či z nárůstu sbírkové kultury ve sterilní destilované vodě v baňce. • Pipetovat po 1 ml suspenze do 4 zkumavek. • První zkumavku zpracovat jako kontrolní vzorek pro zjištění počtu živých buněk při pokojové teplotě při začátku pokusu (0 minut). • Stanovit počet živých a mrtvých buněk. Do prohlubně Bůrkerovy komůrky nanést kapku suspenze a zakrýt krycím sklem. K okraji krycího sklíčka přikápnout metylenovou modř, na opačné straně ji odsát filtračním papírem, až je celý preparát zbarven modře. • Po usazení buněk (1-2 minuty) pozorovat a spočítat živé (neobarvené) a mrtvé (modré) buňky při zvětšení 400 x. • Pro každý čas spočítat buňky v min. 10 čtvercích. Do součtu zahrnout i buňky ležící na 2 hranách políčka (buď pravá a horní nebo levá a spodní hrana, obr. 26) J-- E J. Kopecká Obr. 26: Počítání buněk při vitálním testu. Červeně jsou znázorněny buňky, které se započítávají do celkového počtu buněk v políčku (archiv autorek) 52 Přímé stanovení počtu buněk v Bůrkerově komůrce, vitální test, kvasinky • Zbylé zkumavky umístit do vodní lázně o teplotě 61 °C. Stanovit počet živých a mrtvých buněk po 7, 14 a 21 minutách (obr. 27) postupem popsaným výše. • Dle vzorce vypočítat celkový počet buněk (mrtvé + živé). „ , , , , součet živých a mrtvých buněk celkový počet buněk/ml = - x 250 x 1000 10 x počet poliček • V MS Excel sestrojit graf závislosti přežívajících buněk na délce vystavení zvýšené teplotě (osa x, % přežívajících buněk; osa y, čas). ' • ■ 8 . o t, . ť « * v 9 * ■ • * M * i o Ä „. qOoÍ I ,í • 3o O „ o" • .... •o • • a, • • • 4 .o . „ i1,? . ° . __°°."Q í „' " o/,'.. .*!>*•' o' ° * © J. Kopětká, 6. Roťkcj/á Obr. 27: Obarvené buňky při vitálním testu v čase 0 (A), 7 (B), 14 (C) a 21 minut (D) (archiv autorek) Zhodnocení cvičení • Docházelo k plynulému úbytku buněk? • Byly dobře rozeznatelné mrtvé a živé buňky? • V jakém čase se projevil znatelný úbytek buněk? Další informace k této problematice najdete v následující literatuře 53 Další informace k této problematice najdete v následující literatuře • Klaban V., Ilustrovaný mikrobiologický slovník, Galén, Praha, 2005, ISBN 80-7262-341-9. Kontrolní otázky 1. Jaký je princip vitálního testu? 2. Jak lze zjistit aktuální stav populace s ohledem na poměr živých a mrtvých buněk? 10 AP-test (test acidifikační schopnosti) Cíl cvičení Stanovení fyziologického stavu kvasinek pomocí AP-testu. Úvodní slovo Jedním z faktorů ovlivňujících zásadním způsobem kvalitu konečného produktu při výrobě piva je fyziologický stav a metabolická kompetence násadních kvasinek. Viabilita (tj. životaschopnost, kterou lze vyjádřit jako poměr počtu živých buněk k jejich celkovému počtu v kultuře) a vitalita (fermentační a obecně metabolická schopnost buněk) kvasinek hrají při výrobě piva důležitou úlohu. Vitalita se snižuje u buněk stárnoucích či starých nebo buněk vystavených stresu. Nové druhy stresu mohou vznikat např. při zavádění moderních technologií (vysoký hydrostatický tlak v cylindrokónických tancích) nebo nových surovin. Na stanovení viability a vitality kvasinek byla vyvinuta řada metod, které lze rozdělit na metody založené na vitálním barvení, stanovení reprodukční schopnosti buněk, měření obsahu důležitých látek, stanovení aktivity důležitých enzymů, stanovení metabolické rychlosti buněk, stanovení energetického stavu buněk. Tyto metody mají své výhody i omezení a optimální stanovení „kondice" buněk násadních kvasinek jak během propagace, tak během fermentace a skladování, a především předpověď jejich chování během následujících fermentací zahrnuje současné použití několika technik. To vyžaduje pestré a často poměrně nákladné přístrojové vybavení. AP-test se používá ke stanovení metabolické kompetence pivovarských kvasinek opakovaně nasazovaných v provozu, je založen na znalosti řady membránových pochodů probíhajících v kvasinkách metabolizujících endogenní i exogénni substráty. Hlavní pochod podílející se na acidifikační schopnosti kvasinek, tj. činnost H+-ATPázy, závisí nejen na stavu buněk (čerstvé buňky, buňky po skladování, praní atd.), ale velmi silně i na růstové fázi. Během diauxického přechodu a těsně po něm se aktivita H+-ATPázy u S. cerevisiae prudce snižuje a zůstává nízká během post-diauxické a stacionární fáze. To souvisí s přechodem buněk na energeticky úsporný režim, při němž je minimalizován provoz energeticky náročných pochodů zahrnujících vysokou spotřebu ATP. Principem AP-testu je měření změny pH prostředí vyvolané kvasinkami. Při testu se 10 minut měří změna pH extracelulárního prostředí, poté se k suspenzi přidá glukóza a měří se dalších 10 minut. Po přidání cukru pH kvasničné suspenze výrazně klesne. Pokles pH je způsoben vznikem elektrochemického gradientu protonů přes plazmatickou membránu při absorpci živin. Gradient pH vytváří membránová ATPáza. Kromě ATPázy se na acidifikační schopnosti podílí i vylučování metabolických produktů, převážně slabých kyselin do prostředí. Při nedostatku meta-bolizovatelného cukru kvasinka pro udržení poměru extracelulárního a intracelulárního pH využívá energii zásobních polysacharidu, glykogenu a trehalózy. Za přítomnosti cukru v prostředí využívá kvasinka k udržení homeostáze jak endogenní, tak exogénni metabolizmus. Změna pH v prvních 10 minutách po přidání kvasinek do vody (v nepřítomnosti vnějšího zdroje glukózy) se nazývá spontánní acidifikační schopnost, která vyjadřuje růstovou schopnost kvasinek a souvisí s obsahem zásobních polysacharidu v buňce. Za 10 minut od přidání cukru do roztoku se měří další pokles pH. Glukózou indukovaná acidifikační schopnost značí aktivitu kvasinek při kvašení a rychlost glykolýzy. Základem repro-dukovatelnosti výsledků je přesné měření pH a velmi dobrá kalibrace pH metru. Při dodržení nastavení pH metru neovlivní výsledky ani kolísání v navážce kvasnic o ± 11 %. Proto není nutné dodatečné stanovení sušiny. Seznam přístrojů a mikroorganizmů 55 Seznam přístrojů a mikroorganizmů Pomůcky a chemikálie • destilovaná voda, centrifuga, pH metr, elektromagnetické míchadlo, roztok glukózy (50 %) Mikroorganizmy • Kvasnice: sušené lisované či vážené pekařské kvasnice, pivovarské kvasinky Postup Modifikace AP-testu dle Hollerové a kol., 2005 • Navážit 9 ±0,1 g pekařských kvasnic, přidat je do 50 ml vychlazené destilované vody a promýt. • Centrifugovat suspenzi (3000 x g/10 minut), promýt. Opakovat 2x. • Resuspendovat kvasnice v 50 ml destilované vody o pokojové teplotě. • V tuto chvíli začíná měření pH (ponořit pH metr do roztoku) - čas 0 (pH0). • Vzorek míchat pomocí elektromagnetického míchadla. • Po 10 minutách přidat 5 ml glukózy (50 % roztok) a zapsat hodnotu pH (pH10). • Odečíst hodnotu pH ve 20. minutě (pH2o)- Výpočet hodnoty AP Veličina APio odpovídá výsledku spontánní acidifikace před přidáním glukózy, vypočítá se z hodnoty pH v 10. minutě měření (pHio): AP10 = 6, 3 - PH10 kde 6,3 je hodnota pK systému C02/HCOÍT, přibližně rovna vnitrobuněčnému pH. Veličina AP20 odpovídá výsledku glukózou indukované acidifikace. Vypočítá se z hodnoty pH ve 20. minutě (pH2o): AP20 = 6, 3 - PH20 Výsledná hodnota AP20 odráží fyziologický stav buněk: Zhodnocení cvičení • V jakém fyziologickém stavu byly používané kvasnice? • Jaký byl výsledek vitálního barvení ve srovnání s AP testem? 56 AP-test (test acidifikační schopnosti) Další informace k této problematice najdete v následující literatuře • Gabriel P., Dienstbier M., Matoulková D., Kosař K., Sigler K., Optimised acidification power test of yeast vitality and its use in brewing practice. J. Inst. Brew., 2008, 114: 270-276. • Hollerová, I. a kol., Vitalita a viabilita násadních kvasnic: metody posuzování a vliv buněčných systémů pro stresovou resistenci. Kvasný Prüm., 2005, 51:3-7. • Košin P., Savel J., Kolouchová I., Brož A., Viabilita a vitalita kvasnic v provozním kvašení. Kvasný Prüm., 2007, 53: 30-34. • Sigler K., Matoulková D., Stress responses in brewing yeast. Kvasný Prüm., 2011, 57:277-284. • Savel J., Měření aktivity pivovarských kvasinek. Kvasný Prüm., 1999, 45:258-261. Kontrolní otázky 1. Jaké metody pro testování stavu kvasinky znáte? 2. Jsou kvasinky, které rychle využívají přidanou glukózu při AP testu, vhodné pro použití v technologickém procesu? 3. Jsou kvasinky, které pomalu využívají přidanou glukózu při AP testu, vhodné pro použití v technologickém procesu? 4. Jaká aktivita kvasinek se hodnotí (hodnoty pH) v 10. a 20. minutě? Je mezi nimi rozdíl? 11 Fyzikální a chemické prostředky kontroly růstu mikroorganizmů Cíl cvičení Testování účinku vybraných fyzikálních a chemických prostředků pro kontrolu růstu mikroorganizmů v závislosti na době kontaktu a koncentraci (UV záření, dezinfekční látky: SAVO, Incidur a Ajatin). Úvodní slovo Faktory vnějšího prostředí mohou na mikroorganizmy působit mikrobicidně, což je nevratný inhibiční účinek s letálním koncem, nebo mikrobistaticky, kdy je účinek reverzibilní a po odeznění faktoru, který změnu vyvolal (např. vyředění na minimální koncentraci), buňky pokračují v růstu. Inhibiční účinek faktorů je závislý na povaze a intenzitě působení, ale i na fyziologickém stavu buňky (stáří) a prostředí, ve kterém se nachází. Buňky ve vegetativní formě jsou citlivější než klidové formy, endospory, myxospory a cysty. Citlivost je ovlivněna složením buňky a buněčné stěny a rodovou, případně druhovou příslušností organizmu. Organizmy, které vytváří pigmenty, jsou např. lépe chráněny proti UV záření, záření je odráženo a pohlcováno barvivem (možné srovnání s tmavými slunečními brýlemi). Barviva v pigmentech pohlcují určitou vlnovou délku světla, která může být využita jako energie pro syntézu živin a další mechanizmy důležité pro život. Dekontaminace je odstranění mikrobní, chemické a radioaktivní kontaminace z předmětů. Může být zabezpečena různým způsobem a tomu odpovídá též dosažený efekt. Prostý úklid, mytí nebo praní a žehlení snižuje výskyt mikroorganizmů až o 90 %. Antisepse je zneškodňování choroboplodných zárodků v prostředí živých tkání, v ranách, na sliznicích a na kůži s použitím antiseptik. Je namířena hlavně proti mikrobům vyvolávajícím hnisání. U antiseptik není striktní požadavek na baktericidní účinek, stačí bakteriostatické působení. Antiseptika musí splňovat požadavek nejedovatosti a dobré snášenlivosti živými tkáněmi, podléhají schválení jako každý jiný lék. U antiseptik není nutná dobrá rozpustnost ve vodě. Asepse je souhrn opatření vedoucích ke stavu, kdy je v prostředí minimum mikroorganizmů. Asepse brání přístupu mikroorganizmů k živým tkáním při chirurgických operacích používáním sterilních nástrojů, obvazových látek, šicího materiálu, pryžových rukavic, přípravou operačního pole, dezinfekcí chirurgových rukou, používáním ústenek apod. Pojem asepse zahrnuje také laboratorní a výrobní metody, u nichž je snaha zabránit mikrobiální kontaminaci např. u mikrobiologických laboratorních prací a při výrobě některých léků. Dezinfekce je definována jako ničení či zneškodňování kontaminujících mikroorganizmů na neživých předmětech, ve vnějším prostředí (ve vodě, ve vzduchu) a v infekčním materiálu. Zahrnuje širokou paletu účinnosti proti virům, vegetativním formám bakterií a hub, ne však proti endosporám. Účinnost dezinfekce je závislá na rezistenci mikroorganizmů vůči dezinfekčním prostředkům. Sterilizace je zbavení prostředí všech živých organizmů, včetně virů, bakterií, bakteriálních endo- i exospor, mikroskopických hub a jejich exospor. Sterilizace je v praxi zatížena určitou pravděpodobností selhání. Předmět může být považován za sterilní, je-li možno prokázat, že pravděpodobnost přítomnosti mikrobů je nejvýše 10-6. 58 Fyzikální a chemické prostředky kontroly růstu mikroorganizmů Fyzikální metody sterilizace Mezi sterilizaci vlhkým teplem patří frakcionovaná sterilizace, tyndalizace a sterilizace nasycenou vodní parou. Přerušovaná, frakcionovaná sterilizace je sterilizace varem (100 °C) působícím po dobu 30 minut v 18-24 hodinových intervalech 3 dny po sobě. Sterilizovaná látka musí být v mezidobí uložena při pokojové teplotě, aby termorezistentní endospory, které var přežily, mohly vyklíčit. Následující var je pak ničí jako vegetativní formy bakterií. Tyndalizace se používá ke sterilizaci termolabilních roztoků bílkovin, které koagulují již při teplotě 60 °C. Postup je podobný jako při frakcionované sterilizaci. Roztok se zahřívá ve vodní lázni při 56-58 °C (resp. při 60-80 °C) po 30-60 minut 3 dny po sobě. Sterilizace nasycenou vodní parou pod tlakem (v autoklávu) se provádí nejčastěji za přetlaku 100 kPa při teplotě 120 °C po dobu 20-30 minut. Tento způsob sterilizace umožňuje zničit bezpečně všechny formy mikroorganizmů. Autokláv je tlakový sterilizátor opatřený vodoznakem pro stav vody ve vyvíječi páry (pokud není přímo napojen na přívod páry z centrálního zdroje). Je vybaven pojistným ventilem, dvěma manometry (jeden k měření přetlaku páry ve vyvíječi, druhý v pracovním prostoru), odvzdušňovacím ventilem, vodní vývevou a teploměrem. Dokonalé odvzdušnení pracovního prostoru na začátku sterilizace je předpokladem úspěšného autoklávování (směs páry se vzduchem při 120 °C a 30 minutové expozici nemá spolehlivý sterilizační efekt). V autoklávu lze sterilizovat obvazový materiál, operační prádlo, různé roztoky, kovové lékařské nástroje, pryžový materiál. Při sterilizaci bakteriologických půd je třeba dát pozor na možnost hydrolýzy disacharidů a poškození termolabilních látek. Textilní materiál se ukládá do sterilizačních bubnů, které se vkládají do autoklávu otevřené a po skončení sterilizace jsou ihned uzavřeny. Materiál uzavřený v bubnu se považuje za sterilní jen dva dny po sterilizaci. Potom je nutno buben znovu sterilizovat, i když nebyl otevřen. Suché teplo je méně účinné než pára pod tlakem. Má nižší koeficient vodivosti, sterilizace probíhá při vyšší teplotě a po delší expoziční dobu. Otevřený plamen se používá při žíhání bakteriologické kličky, k likvidaci pokusných zvířat a některých předmětů malé hmotnosti, např. kontaminovaných obvazů. Horkovzdušná sterilizace skla, porcelánu a kovů se provádí v horkovzdušných sterilizátorech. Doba vlastní sterilizace se počítá od okamžiku dosažení předepsaných teplot. V přístrojích s nucenou cirkulací vzduchu se sterilizuje obvykle buď při 160 °C 60 minut nebo při 180 °C 20 minut. Sterilizace filtrací slouží k odstraňování mikroorganizmů z tekutin tam, kde je jiný způsob dekontaminace nevhodný. Viry procházejí většinou bakteriálních filtrů. Filtry se liší dle konstrukce, velikosti pórů a použitého materiálu. Azbestové Seitzovy filtry jsou lisované z azbestu a celulózy. Filtry zadržující bakterie jsou označeny EK (Entkeimung). Filtrační vložky jsou jednoúčelové a sterilizují se i s filtračními nálevkami v autoklávu. Skleněné jenské filtry jsou z borosilikátového skla ve formě porézních destiček zatavených v nálevkách. Používají se opakovaně. Po použití se čistí koncentrovanou kyselinou sírovou nebo chromsírovou a důkladně se promývají vodou. Sterilizují se horkým vzduchem nebo v autoklávu. Membránové ultrafiltry z nitrocelulózy s různou velikostí pórů a průměru se u nás vyrábějí pod názvem Synpor. Vkládají se do speciálních kovových bubínků a sterilizují se v autoklávu. Filtrace se provádí za použití podtlaku pomocí vývěvy. Sterilizace zářením se provádí pomocí UV nebo ionizujícího záření. Ultrafialové záření (UV) má optimální baktericidní účinek při vlnové délce okolo 254 nm, kdy je záření maximálně absorbováno nukleovými kyselinami. Jako zářiče se používají obvykle germicidní lampy. UV záření slouží k dekontaminaci vzduchu a pracovních ploch přímo vystavených paprskům. Používá se k vyzařování operačních sálů, aseptických boxů, piteven, odběrových místností v léčebnách tuberkulózy apod. Vyzáření nemůže nahradit úklid pomocí dezinfekčních prostředků. Účinnost UV klesá se vzdáleností ozařovaného objektu. Ionizující záření penetruje, ale nezahřívá sterilizovaný předmět a nemění vlastnosti většiny sterilizovaných látek. Zdrojem gama záření v praxi je obvykle radioaktivní kobalt. Gama záření se Úvodní slovo 59 používá k průmyslové sterilizaci (obvazový materiál, plasty). Mezinárodně stanovená sterilizační dávka je 27 kGy. Chemické prostředky dezinfekce Vzorkování a mikrobiologické vyšetření používaných dezinfekčních roztoků se testuje na standardních kmenech mikroorganizmů. Výsledky se odborně interpretují s ohledem na specifické důvody prováděné kontroly. Ve zdravotnických zařízeních se odebírají vzorky naředěných používaných dezinfekčních roztoků, a co nejrychleji se transportují do mikrobiologické laboratoře ke stanovení jejich účinnosti na kontrolních kmenech, případně účinnosti na mikroby izolované na konkrétním zdravotnickém pracovišti. Dezinfekční účinnost může být baktericidní, bakteriostatická, fungicidní (vláknité a kvasin-kovité houby), fungistatická, tuberkulocidní, mykobaktericidní, sporicidní, sporistatická, virucidní (obalené a neobalené viry). Testování lze přizpůsobit podmínkám čistého, špinavého, vysoce nebo málo znečištěného prostředí. Specifický účinek chemických látek na mikroorganizmy se projevuje v závislosti na jejich koncentraci a době působení (expozice). Kritéria kvality dezinfekčních prostředků pro volbu jejich použití: široké spektrum účinku (baktericidní, virucidní i fungicidní účinek zároveň), při trvalém používání nevzniká rezistence, netoxické, rychlý dezinfekční účinek, afinita k mikroorganizmům, k dezinfikovanému předmětu jsou inertní, stálý dezinfekční účinek za různých změn vnějších podmínek (teplota, vlhkost vzduchu, pH). Antimikrobní látky nejčastěji přímo poškozují strukturu mikroorganizmů nebo narušují jejich základní metabolické procesy např. oxidací (sloučeniny chlóru, peroxidy, peroxid kyseliny), redukcí (aldehydy), hydrolýzou (kyseliny, louhy), dehydratací (alkoholy), koagulací bílkovin (alkoholy, fenoly), změnou permeability (detergenční látky). Zásady a kyseliny Silně anorganické kyseliny a zásady se pro své toxické a agresivní účinky používají v praxi zřídka. Např. vápenné mléko, kyselina boritá, kyselina peroctová, persteril (32-36% roztok kyseliny pe-roctové s 10% H202 a 1% H2S04) Oxidační prostředky peroxid vodíku, manganistan draselný Sloučeniny halogenů chlorové vápno, Chloramin B, Dikonit Jód a jeho sloučeniny jódová tinktura, jodofory, Jodonal B, Jodisol Sloučeniny těžkých kovů Famosept, Merfen, Merthiolát, Thiomersal Alkoholy etanol, n-propanol, etylenoxid Aldehydy formaldehyd, formalin, glutaraldehyd Fenolové deriváty krezoly, Lysol, Orthosan BF 12 Povrchové aktivní látky Ajatin, Septonex, Ophthalmo-Septonex 60 Fyzikální a chemické prostředky kontroly růstu mikroorganizmů Ke kontrole účinnosti dezinfekce a sterilizace se používá řada testů podle povahy sterilizované látky a způsobu provádění sterilizace nebo dezinfekce, např. papírové indikátory nebo bioindikátory, stery sterilním vatovým tampónem. Seznam přístrojů a mikroorganizmů Pomůcky a chemikálie • Petriho misky s MPA, zkumavky s 10 ml MPB • sterilní vatové tyčinky, zkumavky, pinzety a destilovaná voda • papír, alobal, pipety • U V lampa • dezinfekční činidla (Savo, Incidur, Ajatin) Mikroorganizmy • Pseudomonas fluorescens CCM 2115T • Staphylococcus aureus SA 812 • Escherichia coli CCM 3954 • Saccharomyces cerevisiae • Serratia marcescens CCM 303 • Bacillus cereus CCM 2010 Postup Vliv doby působení UV záření na růst mikroorganizmů • Pomocí vatové tyčinky pečlivě rozetřít mikrobiální kulturu po celém povrchu agaru v dostatečném množství a hustotě (3 skleněné misky s MPA). • Misky rozdělit popisovačem zespodu na poloviny, umístit do boxu s UV lampou a odklopit víčko. Polovinu každé misky zakrýt alobalem. • První misku ozařovat 10 sekund, druhou 30 sekund a poslední 60 sekund. • Po ozáření misky zakrýt víčkem a inkubovat dnem vzhůru 24 hodin při 30 °C. Hodnocení: Prohlédnout agarové plotny, výsledky zaznamenat. Zhodnotit vliv UV záření na růst mikroorganizmu podle jeho délky účinku. Zhodnotit i růst v zakryté části agarové plotny (kontrola). Při jaké době ozařování je znatelný úbytek kultury? Byly mikroorganizmy ovlivněny UV zářením? Závisel tento vliv na druhu mikroorganizmu a na době expozice? Postup 61 Vliv doby kontaktu na růst mikroorganizmů • Do sterilní zkumavky připravit dezinfekční prostředek v koncentraci doporučené na obalu výrobcem — Incidur: 0,5% roztok, celkový objem 5 ml, 25 ul prostředku a 4,975 ml vody — Savo: 100 ml do 3 1, tj. 3,33% roztok, do 4,833 ml pipetovat 166,7 ul Sava — Ajatin: 1% roztok • Misku s MPA rozdělit na 3 sektory, které označíme 0; 1 a 10 minut. • Do sektoru 0 naočkovat kulturu vatovou tyčinkou „hádkem" (kontrola). • Do zkumavky s dezinfekčním prostředkem přidat 500 ul kultury a protřepat. • Ze zkumavky po 1 a 10 minutách očkovat „hádkem" vatovou tyčinkou do odpovídajících sektorů na misce. • Inkubovat 24 hodin při 37 °C. Hodnocení: Prohlédnout agarové plotny, výsledky zaznamenat. Zhodnotit vliv doby působení dezinfekční látky na růst bakterie. Porovnat hustotu nárůstu. Má doba působení dezinfekční látky vliv na růst mikroorganizmu? Vliv koncentrace na růst mikroorganizmů, stanovení minimální inhibiční koncentrace • Sterilní zkumavky označit čísly 1 až 6. • Do první zkumavky připravit 2% roztok Inciduru nebo 3% roztok Sava v MPB do celkového objemu 2 ml (40 ul Inciduru doplnit 1,960 ml MPB; 60 ul Sava doplnit 1,940 ml MPB). • Do dalších 5 zkumavek pipetovat 1 ml MPB. • Z první zkumavky odebrat 1 ml roztoku, pipetovat ho do druhé zkumavky a promíchat. • Postupovat obdobně až k předposlední zkumavce (zkumavka 5), z ní 1 ml odebrat a vypustit do odpadní nádoby. • Poslední zkumavka (6) neobsahuje žádný dezinfekční prostředek (kontrola růstu). Zkumavky 1 až 5 obsahují 1 ml roztoku dezinfekčního činidla s klesající koncentrací v MPB. Koncentrace prostředku v každé následující zkumavce je poloviční ve srovnání s předcházející zkumavkou. • Do každé zkumavky naočkovat 50 ul kultury. Inkubovat 24 hodin při 37 °C. Hodnocení: porovnat růst v různých koncentracích dezinfekční látky. Která koncentrace je dostatečná k inaktivaci dané kultury? Je ovlivněna minimální inhibiční koncentrace dezinfekce podle bakteriálního druhu a podle použité dezinfekce? 62 Fyzikální a chemické prostředky kontroly růstu mikroorganizmů Zhodnocení cvičení Výsledky úloh jsou zobrazeny na obr. 28 a 29. Obr. 28: Působení UV záření na růst Serratia marcescens (A) a Staphylococcus aureus (B) (archiv autorek) Obr. 29: Vliv doby působení různých dezinfekčních látek na růst B. cereus (A), S. cerevisiae (B), S. marcescens (C), E. coli (D), S. marcescens (E) a vliv koncentrace dezinfekční látky na růst S. marcescens (F) (archiv autorek) Další informace k této problematice najdete v následující literatuře • Kneiflová J., Hodnocení baktericidní účinnosti dezinfekčních přípravků suspenzní mikrome-todou. Čs. epidemiol. 1988, 37:97-103. • Standardní metody pro hodnocení dezinfekční účinnosti chemických látek. AHEM, příloha č. 1, 1985, 1-25. • Melicherčíková V., Sterilizace a dezinfekce ve zdravotnictví. Praha, Grada Publishing, 1998. Kontrolní otázky 1. Proč je při ozařování agaru na misce UV světlem nutno odstranit skleněné víčko? 2. Mnohé mikroorganizmy nacházející se v prostředí jsou zbarvené. Jakou výhodu může pigment představovat pro organizmus? 3. Na čem závisí účinnost fyzikálních a chemických prostředků v boji proti mikroorganizmům? Kontrolní otázky 63 4. Vysvětlete pojem mikrobistatický. 5. Vysvětlete pojem mikrobicidní. 6. Prochází UV záření alobalem? 7. Kde se můžeme setkat se sterilizací UV zářením? 12 Vliv některých barviv a alkoholických nápojů na růst bakterií Cíl cvičení Stanovit citlivost bakterií k barvivům a alkoholickým nápojům. Porovnat účinek látek na změny v charakteru růstu (inhibice růstu, změna pigmentace) bakterií. Úvodní slovo Některá organická barviva (Tab. 2 a 3) mají bakteriostatický účinek na grampozitivní bakterie i v koncentracích, kdy gramnegativní bakterie ještě rostou. Toho se využívá pro přípravu selektivních půd užívaných např. při stanovení koliformních bakterií. Obvykle se přidává krystalová nebo gencianová violeť, malachitová zeleň, metylenová modř, trypaflavin atd. Selektivní látky pro streptokoky jsou např. akridinová oranž, etylová violeť, anilínová a trypanová modř. Tab. 2: Vliv médií s neutrálními, kyselými a bazickými barvivy (ředění 1:1000) na růst bakterií (Fung a Miller, 1973, upraveno). Mudra Onu] vtekt. 1 M, Foúm lu ■* r Crtíy-lecbt- Ani ti a E. ctTUmin BlíUÍf M'.;- R. Ljoit. niuIiBt 1 irialň (tC.SJi« i .j e B. I i t i f « i. 1 § | t i í I i í í \ i. i i i I i i i ! í i I 1 S S S i í g,: J g i i í S h } i 1 SUphylococciu uurcua.............. _ _ _ _ _ _ - 4 _ * + 4- 4- _ - _ 4 +;+| +' + + 4-; + + - T Streptococcus (Iwmolytlc)........... _ - - _ + _* i _ • I." i + + l- ''■ -r + +■ + + + 4 - _ 4 Screptococcui mucovua ctrisulítui..... + x 4 + + + + 4- +> 4 ■ + 4 4 + 4 - + ľ - :r-.i. b ■ >, Cl 1*..................... + + 4 4 + + + 4 H H T- + +: + t-'- 4- B. diphthíri*...................... x * 1- 4 + t 4 4- B. hoÄmanni...................... _ _ _ _ _ _ _ _ .. _ _ _ _ _ -4-4-4 + 4 4 z 11. NMfih......................... - — - — — — — — - — 4 — — — T 4- 4- - — — + 4- 4-: 4-: 4- + 4 + _ _ B. : ■>-'-'. iin. i !■:...................... - + x + + 4-4-4-4- + 4 4 B. antbtade,...................... — — - — - — - - 4 - — — 4 ! + - - — 4- +!+ + + 4 4 + 4 - — — (SramneRativnI bakterie : 4- 4-, 4- 4 4-4 4-4 L v _ + I ľ + X -1 i + 4- 4 +■ + 4- + t 4 t: x 4 + + X 1 t- + + 4- * + 4 + + + 4- 4-4- 4 + + + +p 4 4 + + y 4 4 4 4 4 + + + + ■1- 4- 4 -44-4 + 4- 4 4 -• + 4 4 4 4 + + 4 4 4 4 + ■t- + 4 + + ■1 + + 4 +! t-, i- 1 ■t i 4 4 + -i B. dywowria (Sbita).,............. X H -» t X i + + 4 + 4 + i + ■+ 4- 4 + 4 4- c + + B. dyscuLtria (Flcxner)............. X + x 4 + + + + 4 + 4- + 4 + 441 ■+ 4-4 4- K 4 B. dyscnLeriar (Mt- Desert.).......... s- 4 4 + + 4 x 4 4- + 4 4 4- 4+1 + + + + 4 4- 4 4 B. lyj>h©*us....................... + 4 4 4 4 4 -t + + + 4 4- 4- + + 4 4 +I+í + + + 4 4 *■ + B. paratypfcKWUB. A................. * 4 4 4 4 4 + 4 4 ■1 J- 4 4 + 4- 4 + + 4- + 4" +■+:+ 4 -i 4 -ŕ 4 ] 4 B. pamyphosuB. B................. + 4 4 H ! + 4 f 4 i •+ 4 4- 4- 4- 4 4 + 4- + + 4 4+J + 4 i + V- + 4 4 B. entnfdEtla (Gacrtner)............ 4 4 i 4 1 + 4 ■i 4 \ f f 4- + 4- 4- + + + + + + + + + 4 + 4- |- 4 + 4 4 4 + + 4 4 ŕ 4 4 + + + + H + 4 + -f + + + + + + 4 4- 4 + + 4 4 4 4 4 4 4 + 4- 4- + 4- 4 + 4- 4 f + +[+ + + + í 4- 4 -f 4 I;; ibttttlltu............... * + 4 x 4 + 4 4 + 4 + 4 h + + + + + + 4 + + + + + + 4 4 4 4 +■ + T 4 + + 4 4 4 4 4 4 4 4 4- -r + 4- +1+ + + + + 4 I- * 4 + X * 4 X 4 4 + + 4 -! 4 x + - t + 4-! + + + ; i i 4 + + + + + +; + !+!+;+ ílí íií 4 Tab. 3: Vliv anilínových barviv na růst bakterií (Krumwiede a Pratt, 1914, upraveno). Na selektivních půdách vyrůstají jen některé mikroorganizmy, růst nežádoucích je na nich potlačen (ne však 100% inhibován!). Jedná se o zvýhodnění určité skupiny mikroorganizmů, která by mohla být překryta či zamaskována ostatními. Selektivní média se skládají ze živného základu Seznam přístrojů a mikroorganizmů 65 a inhibitoru růstu - chemikálií (sloučeniny teluru, selenu, lithia), bazických barviv, látek snižující povrchové napětí (žluč, soli žlučových kyselin, deoxycholát sodný), selektivně toxických sloučenin (azid sodný), antibiotik atd. Nežádoucí mikroflóru lze inhibovat rovněž kyselým nebo zásaditým charakterem média nebo jeho zvýšenou osmolalitou (vysoké koncentrace solí či sacharidů). Rozdílné typy stavby buněčné stěny mikroorganizmů mají za následek odlišnou citlivost k vybraným barvivům či chemickým látkám. Složení buněčné stěny je popsáno v kapitole Makroskopické a mikroskopické pozorování mikroorganizmů. Alkoholické nápoje obsahují látky, které brání množení a růstu mikroorganizmů. Ve vínu to jsou třísloviny a flavonoidy. Mikrobiologickou stálost vína ovlivňuje i síření vína a vyšší obsah alkoholu. U lihovin je to vysoký obsah alkoholu (nad 20 %). Pivo má nízké pH a obsah alkoholu je poměrně nízký (0,5-8 %). Největší vliv na mikrobiologickou stabilitu má v pivu chmel a jeho složky (humulony, lupulony, chmelové silice, třísloviny). Seznam přístrojů a mikroorganizmů Pomůcky a chemikálie • 1% vodný roztok krystalové violeti • sterilní zkumavky, destilovaná voda, pipety a Petriho misky • zkumavky s 18 ml MPA • pivo, chmelové extrakty, víno, lihoviny Mikroorganizmy • Bacillus subtilis CCM 2216 • Serratia marcescens CCM 303 • Escherichia coli CCM 3954 • Micrococcus luteus CCM 169 Postup Bakteriostatické působení roztoku krystalové violeti • Naředit roztok krystalové violeti v poměru 1:10, 1:100 a 1:1000. • Připravit 4 zkumavky s 18 ml MPA rozvařeného a vy temperovaného na 45 °C. • Pipetovat lml každého ředění barviva zvlášť do 4 Petriho misek. Každou misku zalít 18 ml MPA a jemně promíchat. • Po ztuhnutí rozdělit fixem dno misek na čtvrtiny. Do sektorů očkovat kultury bakterií. • Inkubovat při teplotě 37 °C po dobu 48 hodin. • Odečíst růst bakterií (obr. 30) a výsledky zapsat do tabulky. Porovnat růst gramnegativních bakterií s růstem grampozitivních. 66 Vliv některých barviv a alkoholických nápojů na růst bakterií neředěné barvivo lOx ředěné barvivo lOOx ředěné barvivo lOOOx ředěné barvivo Obr. 30: Vliv krystalové violeti na růst mikroorganizmů. Escherichia coli (A), Bacillus subtilis (B), Serratia marcescens (C), Micrococcus luteus (D) (archiv autorek) Vliv nápojů na růst bakterií • Připravit zkumavky s 18 ml MPA rozvařeného a vy temperovaného na 45 °C • Pipetovat 1 ml každého nápoje (pivo, víno, lihoviny, chmelový extrakt) zvlášť do Petriho misek. Každou misku zalít 18 ml MPA a jemně promíchat. • Jednu misku připravit pouze s MPA, bude sloužit jako kontrola růstu. • Po ztuhnutí rozdělit fixem dno misek na čtvrtiny. Do sektorů očkovat kultury bakterií. • Inkubovat při 37 °C po dobu 48 hodin. • Odečíst růst bakterií (obr. 31) a výsledky zapsat do tabulky. Porovnat růst gramnegativních bakterií s růstem grampozitivních. Zhodnocení cvičení 67 Obr. 31: Vliv nápojů na růst mikroorganizmů. Escherichia coli (A), Bacillus subtilis (B), Serratia marcescens (C), Micrococcus luteus (D) (archiv autorek) Zhodnocení cvičení • Došlo k inhibici růstu mikroorganizmů? • Byla inhibice růstu pouze u některé skupiny mikroorganizmů (grampozitivní, gramnega-tivní)? • Změnily přidané látky v médiu charakter růstu mikroorganizmů (vzhled, pigment)? Další informace k této problematice najdete v následující literatuře • Fung D. Y. C, Miller R. D., Effect of dyes on bacterial growth. Appl. Microbiol., 1973, 25:793-799. • Krumwiede C, Pratt J. S., Further observations on the growth of bacteria on media containing various anilin dyes, with special reference to an enrichment method for typhoid and paratyphoid bacilli. J. Exp. Med., 1914, 19:501-512. • Votava M., Kultivační půdy v lékařské mikrobiologii. Nakladatelství Hortus, Brno, 2000, ISBN 80-238-5058-X. 68 Vliv některých barviv a alkoholických nápojů na růst bakterií Kontrolní otázky 1. V čem spočívá rozdíl citlivosti u různých druhů mikroorganizmů? 2. Čím je zajištěna mikrobiologická stabilita piva? 3. Čím je zajištěna mikrobiologická stabilita vína? 4. Co se přidává do selektivních médií? Jakou vlastnost má daná látka mít? 13 Stanovení citlivosti mikroorganizmů k antibiotikům, stanovení koncentrace antibiotik Cíl cvičení Stanovit a porovnat citlivost mikroorganizmů k různým antibiotikům. Stanovit koncentraci neznámého vzorku antibiotika. Úvodní slovo Antibiotika (ATB) jsou sekundární metabolity mikroorganizmů, jsou přirozeně syntetizovaná pro potlačení růstu konkurenčních organizmů. Poskytují výhodu při soutěži o ekologickou niku a o substrát. V prostředí patří mezi největší producenty ATB vláknité mikroskopické houby, např. Penicil-lium, Aspergillus, Acremonium („Cephalosporium11), Paecilomyces, a dále vláknité aktinobakterie. Vzhledem ke schopnosti působit na růst mikrobů, včetně patogenů, jsou ATB využívána jako chemoterapeutické látky. Prvním nalezeným ATB byl penicilin produkovaný plísní Penicillium chrysogenum (Fleming 1928), následoval streptomycín produkovaný zástupci rodu Streptomyces. Mezi bakteriální producenty ATB patří právě aktinobakterie; vybraní producenti: Streptomyces griseus (streptomycín), S. kanamyceticus (kanamycin), S. erythaeus (erythromycin), S. venezuelae (chloramfenikol), S. aureofaciens (chlortetracyklin), S. fradiae (neomycin); a ojediněle i zástupci kmene Firmicutes, jako např. Bacillus subtilis (bacitracin), Paenibacillus polymyxa (polymyxin). Antimikrobiální látky patří spolu s dezinfekčními prostředky mezi chemické metody kontroly mikrobiálního růstu. Mezi antimikrobiální látky patří i antiparazitika, antimykotika, antivi-rotika, antituberkulotika. V praxi se využívají přirozená či modifikovaná ATB. Podle spektra účinku rozeznáváme úzko- a širokospektrá ATB podávaná lokálně, orálně nebo injekčné. Používají se i jejich kombinace (např. při smíšených infekcích). Antimikrobiální látky jsou používány s ohledem na bakteriální druh, pH, rozpustnost, toxicitu a cenu. Při rozhodování o nejvhodnější kombinaci ATB by měl lékař přihlížet k anamnéze pacienta. Vedlejšími účinky ATB bývá jejich toxická aktivita (ledviny, játra, placenta) a propuknutí sekundární infekce poškozením vlastní mikroflóry. Důležitými kritérii pro zhodnocení účinku antimikrobiální látky je její koncentrace, doba kontaktu a je-li pro bakterii letální (baktericidní) nebo způsobuje pouze přechodnou inhibici růstu (bakteriostatická). Mechanizmy účinku ATB Inhibice proteosyntézy konkurenčního kmene brání iniciaci proteosyntézy, interferuje s translací vazbou na ribozom, brání vazbě peptidylové tRNA na peptidylové místo (P-místo), brání elon-gaci polypeptidu na 30S nebo 50S podjednotce ribozomu, např. aminoglykosidy, makrolidy, tetracyklíny, linkosamidy, amfenikoly, kyselina fusidová. Ovlivnění syntézy DNA a RNA vyvázáním podjednotky DNA gyrázy, braní transkripci vyvázáním RNA polymerázy, interference s bakteriální DNA a RNA, baktericidní, např. sulfona-midy, diaminopyrimidiny, chinolony, rifampicin. Antibiotika pro inhibici propustnosti cytoplazmatické membrány jsou baktericidní, např. polypeptidy, antimykotika polyenového charakteru. 70 Stanovení citlivosti mikroorganizmů k antibiotikům, stanovení koncentrace antibiotik Působení na syntézu buněčné stěny, na syntézu peptidoglykanu, ovlivňuje baktericidně pouze rostoucí buňky inhibicí tvorby vazeb peptidoglykanu, braní pohybu prekurzorů peptidoglykanu, např. /3-laktamy, glykopeptidy (penicilin, cefalosporin, vankomycin, teikoplanin, bacitracin, cykloserin, fosfomycin). Antagonizmus a kompetitivní inhibice, působení na syntézu kyseliny listové, trimeto-prim, dapson, izoniazid. Infekční onemocnění jsou celosvětově zodpovědná za přibližně 40 % všech úmrtí i vzhledem k narůstající rezistenci patogenů vůči ATB. Rezistentní kmeny bakterií mají schopnost nepřijímat (absence receptoru, efiuxní systémy), štěpit, inaktivovat (např. /3-laktamáza inakti-vuje /3-laktamová ATB) a vylučovat ATB, modifikovat cílové struktury (metylace rRNA) anebo modifikovat enzymatickou dráhu. Rezistence může být primární, která vyplývá z přirozených vlastností a funkcí buňky (chybějící receptor, transportní systém či cílové místo působení ATB), a sekundární, získaná, která je způsobena spontánními změnami v genomu mutacemi či přenosem genetické informace plazmi-dem či transdukcí. Sekundární rezistenci přispívá nevhodné zacházení s ATB. Rezistentní bakterie jsou krátce přítomny v nízké frekvenci (frekvence výskytu mutantních kmenů pro danou vlastnost je stabilně 10 8), ale vzhledem k horizontálnímu přenosu plazmidů konjugací a rychlému množení buněk s plazmidem (vertikálně = na potomstvo) frekvence rychle roste. K šíření rezistence přispívají i chovatelé zvířat a preventivní podávání ATB zvířatům. Boj proti šíření bakteriálních rezistencí probíhá v mnoha oblastech: zpřísnění hygienických a epidemiologických opatření, omezení podávání ATB u zvířat pouze na závažné infekce, dohled nad podáváním a užíváním ATB. Důraz se klade i na evidenci a kontrolu nozokomiálních infekcí a informovanost lékařů i nemocných. Podle odhadů jsou ATB podávána často zbytečně nebo chybně (virové infekce, léčba neinfekčních chorob, neracionální střídání řady ATB, předčasné podávání ATB poslední generace, ustupování požadavkům pacientů, předčasné ukončení užívání ATB). Sám Fleming varoval před nesprávným užíváním penicilinu. Postupným zvyšováním jeho koncentrace se mu podařilo získat značně odolné bakterie. Jeho obavy se splnily už v roce 1945, kdy byly pozorovány pneumonie a šoky vyvolané na penicilin rezistentními kmeny Staphylococcus aureus. V roce 1966 pak bylo už 35 % S. aureus plně odolných k meticilinu. V roce 1967 byla zaznamenána i rezistence pneumokoků. V polovině 70. let v Japonsku zjistili, že 62 % streptokoků skupiny A získalo rezistenci na erytromycin. Fluorochinolony zavedené v roce 1980 zabíjely zprvu 95 % na meticilin rezistentních stafylokoků, ale za pouhý rok k nim získalo rezistenci 80 % stafylokoků. V posledním desetiletí se objevily rezistentní kmeny Escherichia coli, klebsiel, entero-koků, Proteus mirabilis, mykobakterií, salmonel i dalších bakterií a jejich výskyt se trvale zvyšuje. V současnosti existují bakteriální kmeny odolné k více ATB zároveň, tzv. multirezistentní kmeny. Důležitou roli sehrávají průzkumy a monitorování rezistentních kmenů v rámci projektu EARS-Net (Europen Antimicrobial Resistance Surveillance Network), který sbírá, analyzuje a sdílí data. V CR na projektu spolupracuje mnoho nemocnic a zdravotnických zařízení, které mají vyspělý systém monitorování rezistencí na ATB. Mezi problémové rody v ČR s četnými rezistencemi patří např. rody Escherichia, Salmonela, Pseudomonas, Staphylococcus, Enterococcus, Mycobacterium, některé kmeny jsou navíc multirezistentní. Rezistence závisí do jisté míry na selekčním tlaku ATB, kdy bakterie mobilizuje plazmid s geny pro rezistenci. Funkční operon se vymění za jiný a dochází k předání plazmidu horizontální cestou i mezi různými rody. V současnosti probíhá výzkum biosyntézy nových, zejména hybridních ATB pomocí genového inženýrství a kombinatoriální biochemie. Alternativou použití antibiotik je fágová terapie s cíleným účinkem na přítomného patogena. Při fágové terapii nedochází k ovlivnění přirozené mikroflóry jako u většiny ATB. Z hlediska aplikace v humánní nebo veterinární medicíně je důležité určit citlivost mikroorganizmu k aplikované látce, což napomáhá jeho identifikaci. Souhrn testů citlivosti na ATB se nazývá antibiogram. U všech mikrobiologických metod je nutno zachovávat stejnou dobu a tep- Úvodní slovo 71 lotu kultivace pro daný mikroorganizmus a testovanou látku. Protože citlivost difúzních metod je závislá především na difúzi testované látky v agarové vrstvě, je nutno při její přípravě dodržet některé podmínky: konstantní hustotu a vlhkost agaru, stejnou tloušťku agaru, přípravu agaru s absolutně rovným povrchem. Pro testování citlivosti k ATB se standardně využívá Mueller— Hinton agar, který je bohatý na živiny, má nižší obsah ztužovadla a standardní difúzni schopnost. Kromě stanovení citlivosti k ATB se Mueller-Hinton agar využívá pro izolaci rodů Neisseria a Mo-raxella. Pro stanovení koncentrace látek, které inhibují nebo stimulují růst mikroorganizmů, se využívají metody zřeďovací, nefelometrické, titrimetrické a difúzni. Nejnižší koncentrace antimikrobiální látky, při které ještě nepozorujeme bakteriální růst, se nazývá minimální inhibiční koncentrace (MIC) antibiotika. Vyjadřuje množství ATB (g/ml, mg/l), které úplně potlačí růst kmene pěstovaného in vitro. MIC je možné určit pomocí kvantitativní zřeďovací metody, která se provádí ve zkumavce nebo na mikrotitrační destičce. Za citlivý se považuje kmen, jehož MIC je 2-4 x menší než koncentrace dosahovaná terapeuticky v krvi. Za rezistentní se považuje kmen, který se množí při koncentraci ATB výrazně vyšší, než je průměrná MIC u kmenů téhož druhu. Difúzni stanovení citlivosti k ATB (kvalitativní test) se dělí dle způsobu nanášení testované látky. Kapkové metody, kdy se látka kape na povrch tuhého média. Diskové metody využívají disky filtračního papíru, které jsou nasyceny testovanou látkou a kladou se na agarové plotny (rutinní testování citlivosti patogenních mikroorganizmů na ATB). Při komínkové metodě se do agarové vrstvy vtlačují komínky ze skla, porcelánu nebo nerezavějící oceli (ne až na dno, stejně hluboko) a do nich se pipetují roztoky testovaných látek. Jamková metoda využívá jamek vyhloubených korkovrtem přímo do agarové vrstvy, do kterých se pipetují testované látky. Kvantitativní diluční E—test sestává z proužkového nosiče napuštěného klesající koncentrací ATB. Sleduje se projasnění nárůstu ve tvaru hruškovité zóny citlivosti na ATB a hodnota MIC. Postup stanovení citlivosti k antibiotikům difúzním testem — disková metoda Stanovení citlivosti se nejčastěji provádí pomocí kvalitativního difúzního testu v agarovém médiu. Inokulum o hustotě 0,5 McF se rovnoměrně rozetře po povrchu agaru a potom se na roztěr aplikují papírové disky napuštěné ATB (komerčně dodávané, napuštěné definovaným množstvím). Důležitou informací je rovněž koncentrace ATB uvedená na každém disku. Během kultivace difunduje látka z disku horizontálně do okolního agaru v koncentračním gradientu. Účinná látka se projeví vytvořením kruhové, tzv. inhibiční zóny kolem disku. Citlivost mikroorganizmu k testované látce se určí z velikosti inhibiční zóny. Velikost zóny je ovlivněna schopností antimikrobiální látky difundovat agarem a rychlostí růstu mikroorganizmu. Hraniční hodnota rezistence je individuální pro každý mikrobiální druh a dané ATB. Správnost testu je kontrolována za pomoci standardních bakteriálních kmenů. Za dodržení přesných podmínek, tzn. kvality agaru, pH, koncentrace iontů, velikosti inokula jsou průměry inhibičních zón srovnatelné s hodnotami MIC (semikvantitativní metoda). Stanovení koncentrace ATB Pro stanovení koncentrace látky inhibující růst bakteriálního kmene můžeme využít difúzni jamkovou metodu. Z kalibrační přímky se stanoví neznámá koncentrace vzorků ATB. Hodnoty pro sestavení kalibrační přímky vychází ze známé velikosti zón měřených na několika miskách se známou koncentrací testovaného ATB. Zóny se vytváří kolem 4 jamek, do kterých byl pipetován roztok ATB o známé koncentraci. Z hodnot průměrů inhibičních zón se standardními roztoky se sestrojí kalibrační přímka (závislost průměru zóny v mm na logaritmu koncentrace). Výhodou jamkové metody je, že nemusí být dodržovány sterilní podmínky při práci s testovanou látkou, 72 Stanovení citlivosti mikroorganizmů k antibiotikům, stanovení koncentrace antibiotik difúze účinné látky není podstatně ovlivňována ostatními látkami a metoda je dostatečně rychlá a citlivá. Nevýhodou je pracná příprava jamek a nebezpečí přelití testované látky při manipulaci s miskami. Seznam přístrojů a mikroorganizmů Pomůcky a chemikálie • Petriho misky s Mueller-Hintonovým agarem • L-klička (hokejka), pinzeta, korkovrty, skalpely • Antimikrobiální disky, standardy a testované vzorky oxacilinu • Automatická pipeta, sterilní špičky, pravítko • ATB: vankomycin - 30 ug (glykopeptidy), rifampicin - 5 ug (ansamyciny), chloramfenikol - 30 ug (amfenikoly), cefalotin - 30 ug (cefalosporiny I. generace), nitrofurantoin - 100 ug, oxacilin - 1 ug (isoxazolylpeniciliny, penicilináza rezistentní), tetracyklín - 30 ug (cykliny), ko-trimoxazol - 25 ug (sulfonamidy s potencovaným antimikrobním účinkem), penicilin -10 MJ (/3-laktamy, dipeptidy) MJ (mezinárodní jednotka; IU = International Unit) je měrná jednotka pro množství účinné látky, založená nikoli na hmotnosti, nýbrž na naměřeném biologickém působení nebo účinku Mikroorganizmy • Micrococcus luteus CCM 169 • Staphylococcus saprophyticus subsp. saprophyticus CCM 2354 • Bacillus cereus CCM 2010 • Proteus vulgaris CCM 1799 • Escherichia coli CCM 3954 • Staphylococcus aureus NCTC 8511 • Providencia rettgeri CCM 5618 Postup Stanovení citlivosti mikroorganizmu k ATB — disková difúzni metoda • Na povrch Mueller-Hinton agaru pipetovat 0,2 ml bujónové kultury a rozetřít sterilní L-kličkou. • Na misku sterilně pomocí jehly rozložit 4 testovací disky s ATB v dostatečné vzdálenosti od sebe a od kraje misky. • Inkubovat 24-36 hodin při 37 °C. Postup 73 Hodnocení • Pozorovat růst mikroorganizmu kolem ATB disků (obr. 32). • Měřit velikost inhibičních zón jako délku úseček průměrů zóny měřených ve dvou na sebe kolmých směrech (velikost disku je v hodnocení započítána). • Vypočítat aritmetický průměr a stanovit citlivost: necitlivý mikroorganizmus (inhibiční zóna do 11 mm), citlivý mikroorganizmus (inhibiční zóna 11-17 mm), velmi citlivý mikroorganizmus (inhibiční zóna nad 17 mm). Pozn. Zmíněné rozsahy inhibičních zón pro určení citlivosti kmene jsou pouze orientační. V praxi se výsledky odečítají za pomoci stále aktualizovaných tabulek, které uvádí velikost zón citlivosti určitého ATB pro daný druh. Důvodem aktualizací tabulek je vzrůstající rezistence k ATB. Obr. 32: Stanovení citlivosti bakterií k ATB diskovou metodou, M. luteus (A), S. aureus (B, C), B. cereus (D); vankomycin (VAN), chloramfenikol (CMP), ampicilin (AMP), cefalotin (CLT), nitrofurantoin (FUR), tetracyklín (TET), ko-trimoxazol (COT), penicilin (PEN) (archiv autorek) 74 Stanovení citlivosti mikroorganizmů k antibiotikům, stanovení koncentrace antibiotik Stanovení koncentrace oxacilinu difúzní jamkovou metodou • Rozvařit Mueller-Hinton agar (15 ml ve zkumavkách) a temperovat na 45 °C. • Do zkumavek očkovat 0,5 ml inokula S. aureus NCTC 8511. • Obsah zkumavek promíchat, vylít do sterilních misek a nechat utuhnout na rovné podložce. • Připravit standardní řadu ředění oxacilinu, ředit v destilované vodě na koncentrace: 250; 125; 62,5; 31,25; 15,625; 7,81 ug/ml. • Po utuhnutí agaru vyhloubit korkovrtem a skalpelem na miskách 4 jamky; korkovrt a skalpel sterilizovat ožehnutím po namočení v etanolu. Vyhloubené kousky agaru odkládat do Pet-riho misky (k likvidaci, obsahují S. aureus). Korkovrt a skalpel je nutné po skončení práce sterilizovat. • Misky popsat, na 1 misce je vždy 1 standardní koncentrace nebo 1 testovaný vzorek. • Do každé jamky pipetovat 40 ul roztoku ATB, vždy roztok jedné koncentrace na misku. Je třeba pipetovat i přemisťovat misky opatrně, aby roztoky nepřetékaly přes okraje jamek. • Inkubovat 24 hodin při 37 °C. Hodnocení • Změřit průměry zón ve dvou na sebe kolmých směrech. • Pro každou zónu vypočítat průměrnou hodnotu, ze 4 zón na misce vypočítat průměrnou hodnotu pro danou koncentraci. • Z hodnot standardních roztoků (obr. 33) sestrojit kalibrační přímku v MS Excel (závislost průměru zóny v mm na logaritmu koncentrace oxacilinu). • Z kalibrační přímky (rovnice regrese) stanovit koncentraci neznámých vzorků (ug/ml). • V protokolu bude uvedeno označení vzorku a jeho koncentrace. Postup 75 Obr. 33: Standardní řada ředění ATB (oxacilin) na Mueller-Hinton agaru a velikost inhibičních zón u kmene S. aureus NCTC 8511 (archiv autorek) Stanovení antagonistů — přirozených producentů antibiotik • Na povrch agarové plotny s Mueller-Hinton agarem očkovat v jednom pruhu pravděpodobného producenta antimikrobiálních látek (Streptomyces, B. subtilis, P. polymyxa nebo S. mar-cescens), viz. obr. 34. • Kolmo k producentovi očkovat v pruzích testované kmeny bakterií. • Inkubovat 24-36 hodin při 37 °C. • Vyhodnotit, zda došlo k inhibici růstu testovaných kmenů bakterií. Obr. 34: Očkování pravděpodobného producenta antimikrobiálních látek (P) a testovaných kmenů (archiv autorek) 76 Stanovení citlivosti mikroorganizmů k antibiotikům, stanovení koncentrace antibiotik Zhodnocení cvičení • Porovnat citlivost mikroorganizmů k různým ATB, je citlivost různých druhů k jednomu ATB stejná? • Je stejný účinek jednoho ATB na různé mikroorganizmy? • Podařilo se sestrojit kalibrační přímku a určit koncentraci neznámého vzorku antibiotika? Další informace k této problematice najdete v následující literatuře • Greenwood D., Slack R. C. B., Peuthere a kol., Lékařská mikrobiologie. GRADA Publishing, 1999, ISBN 80-7169-365-0. • Votava M., Kultivační půdy v lékařské mikrobiologii. Nakladatelství Hortus, Brno, 2000, ISBN 80-238-5058-X. • Určování citlivosti a rezistence bakteriální kultury k antibakteriálním látkám (zdroj: http: //fvl2.vfu.cz/sekce_ustavy/mikrobiologie/obrazova_priloha/mikrob/6.html; 2. 3. 2016) • Nová látka klíčem ke stovkám antibiotik (zdroj: http://www.gate2biotech.cz/nova-latka-klicem-ke-stovkám-antibiotik/; 2. 3. 2016) • Nouza K., Nouza M., Antibiotika - hrozí konec éry? Medicína 3, VI, 1999. (zdroj: http: / / www.zdrava-rodina.cz / med / med399/ med399_42.html) • Eropean Antimicrobial Resistance Surveillance Network (http://ecdc.europa.eu/en/activities/ surveillance/EARS-Net/Pages/index.aspx, 3. 3. 2016) Kontrolní otázky 1. Jaké jsou mechanizmy rezistence bakterií na antibiotika? 2. Je antibiotikum produkt primárního metabolizmu? K čemu je bakteriální buňce v prostředí prospěšné? 3. Vysvětlete pojem inhibiční zóna. 4. Cím se liší antibiotikum od chemoterapeutika? 5. K čemu se používá disková difúzni metoda a jaký je její postup? 6. Jak se nazývá médium používané pro testování citlivosti na ATB? 7. Proč se při stanovení koncentrace antibiotika připravuje ředící řada tohoto antibiotika? 8. Co je to MIC? 14 Bakteriociny Cíl cvičení • Důkaz produkce antibakteriálních látek - bakteriocinů. Úvodní slovo Bakteriociny představují skupinu mikrobiálních proteinů charakteristických úzkým spektrem účinnosti. Produkce bakteriocinů zvýhodňuje bakterie v jejich životním prostředí. Umožňuje eliminovat ostatní bakterie stejného nebo blízce příbuzného druhu, se kterými by soupeřily o společné energetické zdroje. V současnosti jsou definované 3 základní skupiny bakteriocinů gramnegativních bakterií - koliciny, mikrociny a korpuskulárni bakteriociny. Koliciny jsou vysokomolekulárni proteiny (25-80 kDa) produkované Escherichia coli a jinými druhy z čeledi Enterobacteriaceae. Mikrociny jsou nízkomolekulární látky (do 10 kDa) pep-tidové povahy, produkované zástupci čeledě Enterobacteriaceae. V současnosti je detailně charakterizovaných 25 typů kolicinů a 12 typů mikrocinů. Mikrociny se od kolicinů liší širším spektrem účinku, vyšší stabilitou k extrémnímu pH, teplotě a vyšší rezistencí k proteázám. Koliciny jsou kódovány plazmidově zatímco mikrociny mohou být kódovány na plazmidu či chromozomálně. Korpuskulárni bakteriociny jsou vysokomolekulárni částice podobné fágovému bičíku (phage tail-like bacteriocins). Výskyt korpuskulárních bakteriocinů byl pozorovaný např. u druhů Budvicia aquatica, Pseudomonas aeruginosa a Pragia fontium. Předpokládá se, že bakteriociny produkované E. coli mohou působit jako probiotika a antibiotika. Často používaným probiotickým kmenem je nepatogenní kmen E. coli Nissle 1917, producent mikrocinů H47 a M. Tento kmen byl izolovaný německým bakteriologem Alfredem Nisslem v období 1. světové války. Používal se jako ochrana vojáků před infekčními průjmy. V současnosti je aktivní látkou probiotika Mutafior(S). U novorozenců, kterým byl aplikovaný kmen Nissle 1917, došlo k výraznému zvýšení hladiny imunoglobulinů IgA a IgM v krevním séru a filtrátu stolice, rovněž došlo ke zvýšení hladiny IgA ve slinách. Při studiu nespecifického imunitního systému na myších došlo ke zvýšení sekrečních schopností makrofágů, stoupla tvorba in-terleukinu 6, kyslíkových radikálů a byla zjištěna zvýšená produkce faktoru nádorové nekrózy po indukci makrofágů kmenem Nissle 1917. Probiotikum Mutafior(S) se používá při léčbě poruch tlustého střeva - průjmy, zácpa, meteorizmus, chronická onemocnění střeva, např. ulcerózní kolitida a Crohnova choroba, alergie, ekzémy atd. Užívání probiotik vede k aktivaci obranyschopnosti organizmu. Účinek kmene Nissle 1917 a tím pádem i účinek produkce mikrocinů H47 a M byl vyzkoušený i na adherentně invazivních E. coli (AIEC) kmenech izolovaných z biopsií pacientů trpících Crohnovou chorobou. Tento kmen výrazně snižoval schopnost AIEC kmenů adherovat a invadovat do epiteliálních buněk a doporučuje se jeho užívání při terapii chronických onemocnění střev. Seznam přístrojů a mikroorganizmů Pomůcky a chemikálie • Indikátorový kmen - E. coli K12 - ROW • 1,2 % TYEA (8 g enzymatického lyzátu kaseinu, 5 g kvasničného extraktu, 5 g NaCl, 1 1 H20, 12 g agaru) • MPA (28 g agaru, 1 1 H20) 78 Bakteriociny • Chloroform Mikroorganizmy • Escherichia coli - izoláty ze střev člověka Postup • Kmeny E. coli očkovat vpichem do agaru (12 vpichů/kmenů na misku). • Lze využít základní 1,2 % TYEA, 1,2 % TYEA agar s mitomycinem C (indikace SOS odpovědi, zvýšení produkce některých typů bakteriocinů), 1,2 % TYEA s trypsinem (rozklad bakteriocinů proteinového charakteru) nebo MPA (médium s málo živinami, zvýšení produkce některých typů bakteriocinů). • Kultivace 48 hodin při 37 °C. • Inaktivovat kmeny přidáním chloroformu pro uvolnění bakteriocinů do média. Na víčko misky umístit buničitou vatu, pipetovat 1 ml chloroformu a nechat působit 30 minut. • Do 3 ml 0,66 % TYEA temperovaného na teplotu zhruba 45 °C přidat 100 ul indikátorové kultury. • Médium s usmrcenými kmeny přelít 3 ml 0,66 % TYEA temperovaného na teplotu zhruba 45 °C a nechat ztuhnout. • Kultivovat 24 hodin při 37 °C. • Na základě tvorby inhibičních zón odlišit kmeny, které produkují bakteriociny (obr. 35). Obr. 35: Tvorba inhibičních zón u E. coli produkujících bakteriociny, ke kterým je indikátorový kmen citlivý (archiv autorek) Zhodnocení cvičení 79 Zhodnocení cvičení • Došlo k produkci (tzn. tvorbě inhibičních zón) u všech kmenů? Další informace k této problematice najdete v následující literatuře • Micenková L., Bactericinogeny in pathogenic and commensal Escharichia coli strains. Dizertační práce, MU Brno, 2016. • Micenková L., Molekulárna typizácia bakteriocínov z ľudských kmeňov E. coli. Diplomová práce, MU Brno, 2011. Kontrolní otázky 1. Co je předpokladem vhodného indikátorového kmene? 2. Které typy bakteriocinů znáte? 3. Jaký mají bakteriociny význam pro bakterii žijící ve střevě? 4. Proč je nutné produkční bakterie usmrtit? 15 Průkaz a izolace některých půdních mikroorganizmů Cíl cvičení Izolace a průkaz 3 skupin mikroorganizmů (Azotobacter, Clostridium, celulolytické bakterie) ze vzorku půdy pomocí selektivních podmínek kultivace. Úvodní slovo Při hodnocení kvalitativního či kvantitativního zastoupení mikroorganizmů v půdě zvažujeme charakteristiku zkoumaného vzorku půdy (úrodnost, množství humusu, textura, množství kyslíku, kyselost půdy, profil půdy a hloubka odběru). Většina mikroorganizmů žije v hloubce do 10 cm. V jednom gramu půdy je přítomno několik bilionů buněk. Prokázat je můžeme in situ detekcí (fluorescence, nukleotidové sondy) anebo kultivačně podle některých jejich charakteristických metabolických aktivit: fixace dusíku, oxidace síry, redukce síranů, rozklad močoviny, celulózy atd. Preparát připravený z půdního extraktu doplňuje informaci o morfologii a barvitelnosti buněk zástupců společenstva. Mezi běžnou půdní mikroflóru náleží bakterie rodu Agrobacterium, Arthrobacter, Bacillus, Clostridium, Nocardia, Pseudomonas, Serratia, Streptomyces a také řada vláknitých hub (Aspergillus, Fusarium, Mucor, Penicillium, Rhizopus). Některé mohou být patogeny rostlin i živočichů (Actinomyces, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Pseudomonas, Rhodo-coccus, Streptomyces). V přírodě se mikroorganizmy vyskytují v čistých kulturách výjimečně, vytvářejí mikrobiální společenstva. Za normálních podmínek (neutrální pH, nadbytek živin, dostatek vody) se v prostředí vyskytuje značný počet mikrobiálních druhů v průměrném množství. V půdách určitého charakteru převažuje určitá skupina bakterií, např. zamokrené půdy podporují růst anaerobů, termofilní bakterie se vyskytují hlavně v kompostu a v kyselých půdách převládají vláknité houby. V extrémních podmínkách je přítomno méně druhů a více jedinců jednoho odolného druhu. Dominantní druh se v populaci vyskytuje s vyšší hodnotou CFU/g než druhy ostatní. Společenstvo mikroorganizmů je otevřený a dynamický systém. Winogradsky vymezil dvě základní skupiny bakterií podle kulminujícího počtu jejich zástupců v závislosti na zdrojích živin. Autochtónni bakterie - přirozené organizmy, které jsou po celé roční období zastoupeny v relativně vysokém a konstantním počtu nezávisle na množství živin. Je pro ně charakteristická nízká metabolická aktivita. Klasifikují se většinou jen podle morfologie buněk (barvený preparát), např. aktinomycety, Agrobacterium, Streptomyces, Nocardia. Zymogenní (alochtonní) bakterie jsou druhy, jejichž přítomnost závisí na aktuálně zvýšené koncentraci živin nebo dodání zvláštních látek, které rychle vyčerpávají. Vyznačují se mohutnou metabolickou aktivitou a významně se podílejí na procesech mineralizace půdy, zajišťují koloběh jednotlivých prvků v biosféře, např. nitrifikační bakterie, celulolytické, oxidující síru, myxobakte-rie, Bacillus, Flavobacterium, Mycobacterium, Pseudomonas. Mikroorganizmy se podílí na přeměnách půdy a modifikují svou činností vnější prostředí. Energie vstupuje do ekosystému půdy ve formě slunečního záření či organických a anorganických sloučenin. Organické sloučeniny jsou oxidovány na CO2 respirací nebo jsou fermentovány na redukované sloučeniny. Chemolitotrofní organizmy oxidují anorganické sloučeniny a přispívají k syntéze organických látek autotrofními aktivitami. Obecně se jedná o procesy mineralizace (přeměna organicky vázaného prvku na anorganickou formu), imobilizace (přeměna anorganických prvků na organické komplexy), oxidace, redukce, fixace nebo volatilizace (přeměna plynné formy na ne-plynnou a naopak), procesy dekompozice (humifikace, mineralizace), účast v koloběhu prvků, oxidace jedovatých dusitanů na dusičnany (nitrifikační bakterie), oxidace nedostupných sulfidů Úvodní slovo 81 na sulfáty (Thiobacillus), bioremediace, rozklad těžko odbouratelných látek (např. pesticídy, celulóza, chitin), produkce řady látek ovlivňujících růst rostlin, fixace dusíku symbiotickými (Rhizo-bium) i volně žijícími (asociativně symbiotické Agrobacterium, Azotobacter, Clostridium) bakteriemi, návrat dusíku do koloběhu v podobě amonných iontů vstřebatelných rostlinami, produkce sekundárních metabolitů (bakteriociny, antibiotika), suprese mikromycetových onemocnění rostlin (Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens). Pro práci s vybranou skupinou bakterií je nutno mikroorganizmy izolovat a kultivovat v čistých kulturách. Lze využít selektivních médií. Při průkazu přítomnosti bakterií fixujících dusík se využije bezdusíkatého média, které zvýhodňuje pro růst druhy schopné tuto molekulu fixovat z ovzduší. Dusíku jako biogenního prvku je v atmosféře omezené množství. Některé fo-totrofní i chemotrofní bakterie (symbiotické i volně žijící) (Azotobacter, Klebsiella, Rhizobium, Clostridium pasteurianum) a cyanobakterie (Anabena, Nostoc) disponují enzymem nitrogenázou, pomocí kterého dusík fixují z atmosféry. Je to energeticky náročný proces (spotřeba 15 ATP na 1 molekulu N2). Štěpení celulózy lze dokázat charakteristickým růstem na materiálech obsahujících celulózu jako zdroj uhlíku. Ukazatelem úrodnosti půdy je přítomnost celulolytických bakterií. V intenzivně obdělávaných půdách se vyskytují rychle rostoucí zástupci rodů Cytophaga, Cellvib-rio, Cellfalcicula, Sporocytophaga. Ve středně obdělávaných půdách pak myxobakterie a ve slabě obdělávaných a v kyselých půdách převládají mikroskopické houby. V přírodě nej rozšířenější a ve vodě nerozpustný polysacharid celulóza je podstatnou součástí buněčných stěn rostlinných buněk, je doprovázena hemicelulózami, pektiny, ligninem a tuky. Je štěpena z větší části aerobně, může však být i anaerobně zkvašována. Celulóza je mimo buňku hydrolyticky štěpená exoenzymem celulázou na celobiózu, která je po transportu dovnitř buňky štěpena endoenzymem celobiázou na dvě podjednotky glukózy. Rychlost rozkladu celulózy je ovlivněna množstvím celulolytických bakterií a přítomností doprovodných látek, v přítomnosti ligninu je štěpena hůře. Příklady půdních bakterií Rod Clostridium Pleomorfní grampozitivní tyčky, jednotlivě, ve dvojicích či v krátkých řetízcích. Peritrichální, tvoří oválné či kulaté endospory. Obligátně anaerobní, některé druhy aerotolerantní. Široký rozsah teplotního optima růstu 10-65 °C. Některé druhy fixují plynný dusík a tvoří toxiny. Vyskytují se v půdě, stočním kalu, mořských sedimentech, rostlinných zbytcích, v gastrointestinálním traktu živočichů a člověka (jícen, střeva), v klinickém materiálu. Identifikaci napomáhá rozlišení do tří skupin podle využívání bílkovin a sacharidů, sacharolytické, proteolytické a štěpící jak bílkoviny, tak i sacharidy. Do rodu Clostridium patří primární i oportunní patogeny. C. pasteurianum patří do skupiny přísně anaerobních bakterií máselného kvašení, toleruje kyselost a promáčenost půdy a nižší teploty; tyto vlastnosti spolu s tvorbou spor umožňují jeho rozšíření téměř ve všech typech půd (103-105 CFU/g). Rod Azotobacter Gramnegativní ovoidní pleomorfní tyčky až koky, jednotlivě, ve dvojicích i v nepravidelných shlucích. Peritrichální, aerobní, chemoorganotrofní. Tvoří cysty a pigmentují. Dusík fixují nesym-bioticky či asociativně symbioticky (Azotobacter paspali s trávou Paspalum notatum). V médiu vyžadují molybden či vanad. Vyskytují se v půdě či vodě. A. chroococcum je náročný na podmínky vnějšího prostředí. Vyskytuje se v nízkých počtech (102-104 CFU/g) v dobře provzdušňované a hnojené půdě o neutrálním až slabě alkalickém pH v blízkosti kořenového systému rostlin. V kyselých půdách dusík nefixuje. Vyžaduje přítomnost cukrů, jednoduchých alkoholů, fosforu, vápníku, molybdenu, bóru, vanadu, železa a manganu. Teplotní optimum je úzké, mezi 25 a 30 °C. 82 Průkaz a izolace některých půdních mikroorganizmů Seznam přístrojů a mikroorganizmů Pomůcky a chemikálie • Petriho misky s Ashbyho agarem, prázdné plastové Petriho misky • MPB s 5% glukózou • Zkumavky, pipety, kličky, kahan, vodní lázeň • Sterilní parafínový olej • Filtrační papír, ústřižky časopisu, novin, buničina • Zemina z vlastních zdrojů (skleník, lesní půda z lesa, zahrada, pískoviště, květináč, kompost) Postup Izolace zástupců rodu Azotobacter • Petriho misky s Ashbyho agarem (selektivní bezdusíkaté médium eliminuje druhy vyžadující přítomnost dusíku, nezaručí eliminaci mikroskopických hub) očkovat přímo drobnými zrníčky zeminy. • Kultivovat 72 hodin při 25-30 °C, misky neotáčet Hodnocení Růst azotobakterů se projeví slizovitými koloniemi kolem zrníček hlíny (obr. 36). Kolonie jsou v prvních dnech bělavé, stářím hnědnou. Z misky je cítit charakteristický zápach půdy. Při mikroskopické kontrole lze v preparátu pozorovat gramnegativní tyčky vyskytující se často ve dvojicích. Buňky jsou ohraničeny pouzdrem, které se nejlépe zvýrazní negativním barvením. V preparátu lze pozorovat klidová stádia, cysty. Obr. 36: Izolace zástupců rodu Azotobacter na Ashbyho agaru (archiv A. Vávrové) Postup 83 Izolace zástupců rodu Clostridium • Připravit půdní extrakt smícháním 10 g zeminy se 100 ml sterilní destilované vody, protřepávat 10 minut a filtrovat vrchní část extraktu přes dvojitý sterilní filtrační papír do sterilní baňky. • Suspenzi (cca 2 ml) přelít do sterilní zkumavky a umístit do vodní lázně (75-80 °C) na 15 minut (pasterizace, usmrcení vegetativních buněk, endospory přežijí). • Do horkého sterilního média (MPB 5 % glukózy) pipetovat 1 ml pasterizovaného půdního extraktu a ihned převrstvit 1 ml sterilního parafínu pro zajištění anaerobního prostředí. Hodnocení V přítomnosti klostridií vzniká sedlina (obr. 37), plyn a charakteristický zápach máselného kvašení. Při mikroskopické kontrole (Gramovo barvení) jsou v preparátu vidět grampozitivní tyčky, případně endospory v nativním preparátu při použití fázového kontrastu. Obr. 37: Přítomnost sedliny po vyklíčení anaerobních endospor rodu Clostridium (archiv autorek) Průkaz celulolytických bakterií • Zeminu nasypat do Petriho misek zhruba do výšky 2/3 misky a důkladně navlhčit. • Pinzetou položit jednotlivě sterilní proužky filtračního papíru, buničité vaty a novin (lem mezery) a opět navlhčit. 84 Průkaz a izolace některých půdních mikroorganizmů • Inkubovat při pokojové teplotě, zeminu průběžně vlhčit. Inkubace probíhá 3 týdny, hodnocení se provádí vždy po týdnu (obr. 38). Hodnocení Po každém týdnu pozorovat případný rozklad a změny zabarvení (přítomnost skvrn různých barev) zdrojů celulózy. Nejintenzivnější rozklad by měl být u buničiny (cca 50 %), méně pak (30 %) u filtračního papíru a nejméně u novinového papíru vzhledem k inhibujícímu tiskařskému barvivu v papíru. Nejvíce celulolytických mikroorganizmů se vyskytuje v půdách s vyšším množstvím humusu, méně v půdách písčitých. Obr. 38: Rozklad různých zdrojů celulózy celulolytickými mikroorganizmy po jednom (A) a třech (B, C, D) týdnech kultivace (archiv autorek) Zhodnocení cvičení • Podařilo se izolovat jednotlivé zástupce půdních mikroorganismů? • Co výsledek vypovídá o úrodnosti půdy? Další informace k této problematice najdete v následující literatuře • Němec M., Mazal P., Cvičení z mikrobiologie, Učební text VS. 1989, Brno. • Móllerová J., Symbiotická fixace dusíku, Živa, 2006 (zdroj: http://ziva.avcr.cz/files/ziva/ pdf/symbioticka-fixace-dusiku-bakterie-rhizobium-s-l-a.pdf; 7. 3. 2016) • Enzym nitrogenáza a chemizmus dusíku (zdroj: http://chem.rochester.edu/~plhgrp/nitrfix. html; 7. 3. 2016) Kontrolní otázky 1. Jaký je princip izolace námi zvolených bakteriálních skupin? 2. Proč v postupu izolace klostridií vyklíčí pouze jejich endospory? Kontrolní otázky 85 3. V jakém prostředí (ve vztahu ke kyslíku) klíčí endospory klostridií? Jakým způsobem se izolují a jaké znaky sledujeme v případě pozitivního růstu? 4. Jmenujte některé funkce půdních mikroorganizmů. 5. Jmenujte některé bakteriální rody vyskytující se běžně v půdě. 6. Jaké selektivní médium se využívá pro izolaci azotobaktera a na základě které vlastnosti ho na tomto médiu izolujeme? 7. Potřebují bakterie pro fixaci dusíku symbiózu s rostlinami? 8. Jak se jmenuje enzym, pomocí kterého bakterie fixují vzdušný dusík? Funguje aerobně na misce? 9. Vysvětlete pojem autochtónni/ alochtonní. 16 Winogradského kolona Cíl cvičení Vytvořit Winogradského kolonu a pozorovat rozdělení jednotlivých vrstev v čase. Úvodní slovo Sergei Nikolaievich Winogradsky, ruský mikrobiológ, se věnoval převážně půdní mikrobiologii. Objevil bakterie, které oxidují železo, síru a amoniak a které jsou schopny zabudovat CO2 do organické hmoty. Izoloval anaerobní bakterie fixující dusík a studoval rozklad celulózy. Winogradského kolona (obr. 39) je forma mikrokosmu, ve kterém mikroorganizmy a živiny interagují ve vertikálním gradientu. Kolona demostruje různé úlohy mikroorganizmů v přírodě, kdy aktivita jednoho organizmu umožňuje růst jiného a naopak. Kolona je kompletní, soběstačný a recyklační systém, který je doplňován pouze světelnou energií. Produkty kvašení a sulfidy stoupají z redukovaných zón, kyslík proniká do kolony z povrchu. Tím jsou vytvořeny vrstvy podobné jako u sedimentů bohatých na živiny. Fotosyntetizující organizmy získávají energii ze světla. Bahno je smícháno se síranem sodným, uhličitanem sodným a natrhanými novinami (zdroj celulózy). Do kolony se následně přidá voda, inkubace probíhá na světle. V koloně začne probíhat série reakcí, kdy určité mikroorganizmy vytváří speciální mikroklima jako odpověď na chemické gradienty. Na dně kolony je degradována celulóza (rod Clostridium). Produkty kvašení jsou pro další mikroorganizmy dostupné jako reduktanty a síran je využíván jako oxidant. Rod Desulfovibrio produkuje sirovodík, který stoupá vzhůru do oxygenní zóny a vytváří stabilní gradient sirovodíku, ve kterém fototrofní Chlorobium a Chromatium vytváří viditelnou olivově zelenou a purpurovou zónu. Tyto mikroorganizmy využívají sirovodík jako zdroj elektronů a CO2 z uhličitanu sodného jako zdroj uhlíku. Nad touto vrstvou mohou růst purpurové nesirné bakterie rodu Rhodospi-rillum a Rhodopseudomonas. Tito fotoheterotrofové využívají organický materiál jako donory elektronů v anaerobních podmínkách. Kyslík i sirovodík může být přítomen výše v koloně, kde jsou využívány adaptovanými mikroorganizmy (Beggiatoa, Thiothrix), které využívají redukované sirné sloučeniny. Ve svrchní vrstvě mohou být viditelné řasy (rozsivky) a cyanobakterie. Kyslík a CO2 vytváří v koloně koncentrační gradient. Kyslík je ve vodě omezeně rozpustný v závislosti na teplotě vody, tlaku a rozpuštěných solích. Teplota a tlak výrazně ovlivňují množství kyslíku, které je dostupné pro mikroorganizmy. Při nižších teplotách může být koncentrace kyslíku výrazně vyšší. Rychlé snížení rozpuštěného kyslíku ve vodě může nastat při kontaminaci vody živinami, což často vede k úhynu ryb. Oxid uhličitý se účastní mnoha chemických a biologických procesů, např. ovlivňuje pH vody. Pokud autotrofní mikroorganizmy, jako jsou řasy, využívají CO2, pH vody se zvyšuje. Seznam přístrojů a mikroorganizmů 87 Gradient Zóny Metabolické nTky Obr. 39: Winogradského kolona, mikrobiální evoluce v lahvi (zdroj: http://www.hhmi.org/ biointeractive/poster- winogradsky- column- microbial- evolution- bottle; upraveno) Seznam přístrojů a mikroorganizmů Pomůcky a chemikálie • Bahno a voda z řeky • Vejce, filtrační papír Postup Izolace zástupců rodu Azotobacter • Bahno smíchat se žloutkem (Na2S), nadrcenou skořápkou (CaCOs), natrhaným filtračním papírem (celulóza) a vodou. • Směsí naplnit válec, dolít vodou a uzavřít. • Inkubovat na světle při pokojové teplotě a pozorovat rozdělení vrstev (obr. 40). 88 Winogradského kolona Obr. 40: Příprava Winogradského kolony (A, B), stav na začátku inkubace (C) a rozdělení vrstev po několika měsících inkubace (D) (archiv autorek) Zhodnocení cvičení • Došlo k rozdělení vrstev? • Byly jednotlivé vrstvy dobře pozorovatelné? • Po jaké době se vrstvy rozdělily? Další informace k této problematice najdete v následující literatuře • Prescott L., M., Harley J. P., Klein D. A., Microbiology, WCB, Dubuque, 1996, ISBN 0-697-29390-4. Kontrolní otázky 1. Proč se do kolony přidává žloutek a skořápka? 2. Jako zdroj čeho se do kolony přidává filtrační papír? 3. Je v průběhu inkubace do kolony nutné přidávat živiny? 4. Jaké vrstvy v koloně lze pozorovat? 17 Pozorování bakteriálních endospor a je jich barvení, negativní barvení Cíl cvičení • Zvýraznění buněk rodu Bacillus negativním barvením (nefixovaný preparát). • Pozorování bakteriálních endospor rodu Bacillus v nativním preparátu (fázový kontrast). • Zvýraznění pouzder rodu Azotobacter negativním barvením (nefixovaný preparát). • Barvení spor. Úvodní slovo Kromě rostoucích a dělících se vegetativních buněk nacházíme u prokaryot i struktury dovolující přežití nepříznivých podmínek - endospory. Endospory jsou odolná klidová stádia. V buňce prokaryot je přítomna pouze jedna endospora, která obsahuje peptidoglykan zcela odlišného charakteru než peptidoglykan v buněčné stěně buňky. Makromolekuly jsou v endospoře stabilizovány přítomností specifických bílkovin, snížením množství vody a zvýšením obsahu vápníku. Vápník je v endospoře vázán v kyselině dipikolinové, která je v přírodě přítomna pouze uvnitř bakteriálních endospor a zajišťuje její termorezistenci. Endospory jsou díky četným obalům různého charakteru odolné k působení UV a 7 záření, vysoušení, lysozymu, teplotním změnám, nedostatku živin a působení mnoha dezinfekčních prostředků, v etanolu mohou přežívat i několik měsíců. Endospory jsou prostředkem šíření bakterií i na značné vzdálenosti a v různém prostředí. Tvorba endospory není odpovědí na vnější prostředí, ale přípravou na nepříznivé podmínky. Endospory jsou vysoce světlolomné útvary. Endospory jsou nereproduktivní struktury tvořené malým počtem převážně grampozitivních bakterií (např. Bacillus, Clostridium, Thermoactinomyces, Desulfotoma-culum, Sporosarcina, Sporolactobacillus, Oscillospira). Klinicky, farmaceuticky a technologicky významné jsou termostabilní endospory zejména rodů Bacillus a Clostridium. Bakteriální endospory jsou významným prostředkem bioterorizmu (např. Bacillus anthracis - anthrax). Některé endospory jsou používány jako biopesticidy (např. Bt toxin, bílkovina spor Bacillus thuringiensis var. israclcnsis). Endospory obsahují na svém povrchu proteiny, peptidy či enzymy, které se využívají jako specifické sondy nebo mají biokatalytickou funkci. Modifikované endospory B. subtilis se používají jako vehikula vakcín a jiných farmak, např. povrchové proteiny endospor B. subtilis, které obsahují fragment C tetanového toxinu; alfa toxin Clostridium perfrigens používaný pro orální a nazální imunizaci člověka i zvířat. Endospory jako transportéry farmak dodávají teplotní stabilitu, flexibilitu pro genetické modifikace a nenákladný proces přípravy. Zatímco toxiny sporulujících druhů jsou většinou termolabilní, jsou inaktivovány již po 5 minutách při teplotě 60 °C, endospory jsou velmi odolné. U druhu Clostridium botulinum spo-rulující buňky odolávají 90 minut teplotě 100 °C, nesporulující buňky hynou po 30 minutách při 70 °C. Endospory Clostridium tetani (původce tetanu) jsou inaktivovány po 20 minutách při 121 °C při tlaku 0,2 Mpa a po 90 - 180 minutách při 160 - 200 °C suchého tepla. Endospory jsou vysoce termorezistentní, přežijí až pětihodinový var. Pro ověření správného průběhu sterilizace se využívají endospory Geobacillus stearothermophilus, které přežijí při 120 °C až 12 minut. Sporicidních látek je málo a jsou nákladné. Příkladem je etylenoxid, /3-propionlakton, koncentrované louhy a kyseliny, formaldehyd při prodloužené expozici, kyselina peroctová, jodové preparáty, chloramin. 90 Pozorování bakteriálních endospor a jejich barvení, negativní barvení Stavba zralé bakteriální endospory (obr. 41) Jádro spory tvoří sporoplast (též protoplast). Stroma endospory představuje gelovou matrix tvořenou bakteriálním jaderným ekvivalentem (nukleoidem), ribozomy, kalcium dipikolinátem (až 10 % sušiny endospory) nebo pyridin-2,6-dikarboxylovou kyselinou, která nahrazuje vodu při udržování kvarterní struktury při vazbách, SASPs (small acid-soluble proteins), které jsou pevně svázány s nukleovou kyselinou a zabezpečují její kondenzaci a rezistenci vůči UV záření a DNA-ničících chemických látek. Přítomny jsou polyaminy, aminokyseliny a 3-fosfoglycerát. V jádře endospory jsou u některých druhů přítomny specifické látky ve formě krystalků, toxinů. Jádro je obaleno vnitřní lipoproteinovou membránou, intinou, která brání prostupu chemických látek z prostředí. Zbytky původní buněčné stěny mateřské buňky slouží jako základ nové buněčné stěny při klíčení endospory. Kortex, který se skládá z vnitřní (20 %) a zevní části (80 %), zajišťuje nepropustnost a po dehydrataci jádra termorezistenci, je nebarvitelný a je tvořen peptidoglykany. Zhruba 20-30 % pepti-doglykanových jednotek je shodných s jednotkami peptidoglykanu buněčné stěny, zbylých 50-60 % jednotek představuje N-acetylmuramovou kyselinu modifikovanou na JV-acetylmuramyl-laktam, dalších 18-20 % kyseliny JV-acetylmuramové je spojeno s L-alaninem namísto tetrapeptidu. Tyto modifikace jsou zajišťovány membránově vázanými enzymy. Perikortikální vnější lipoproteinová membrána pláště, extina, se skládá z proteinů bohatých na cystein, zajišťuje odolnost k působení chemikálií. Exosporium není přítomno u všech taxonů, uděluje buňce odolnost vůči chemickým látkám a enzymům. plášť vnitřní membrána Obr. 41: Struktura bakteriální endospory (zdroj: https://micro.cornell.edu/research/ epulopiscium/bacterial-endospores; upraveno) Tvar a umístění endospory (obr. 42) v buňce je významný charakteristický znak, který pomáhá identifikaci. Např. druhy Bacillus anthracis, B. cereus, Clostridium botulinum mají vždy oválné endospory, druhy Clostridium tetani, Bacillus sphaericus mají kulaté enodspory. Hodnotí se, zda a ve kterém místě endospora vyklenuje buňku. Uložení v buňce může být terminální (na konci tyčinky, např. C. tetani - paličky, Geobacillus stearothermophilus), centrální (C. histolyticum, C. novyi, C. septicum, B. anthracis, B. cereus) nebo nejčastěji subterminální, též paracentrální, (mezi středem a pólem buňky, např. C. botulinum, C. sporogenes, B. brevis). Úvodní slovo 91 Obr. 42: Možné umístění endospory a případné vyklenutí buňky jako identifikační znak (zdroj: http://ttktamop.elte.hu/online-tananyagok/practical_microbiology/ch06s04.html; upraveno) Neobarvené endospory můžeme pozorovat fázovým (zářící spory; až po vzniku kortexu, který udává světlolomnost) a Nomarského kontrastem (plastický povrch buňky, pouze pokud spora vyklenuje buňku), jednoduchým barvením (pouze pokud spora vyklenuje buňku). Přímé obarvení endospory je možné při vzniku prospory (vznik kortexu), která je pro barvivo propustná. Spory špatně přijímají barvivo i po fixaci preparátu vzhledem k rigidnímu špatně propustnému kortexu, proto se obarví až během varu pomocí koncentrovaných barviv nebo mořidel (podobně např. acidorezistentní bakterie, které se Gramovým barvením neobarví vzhledem k obsahu mykolových kyselin v buněčné stěně). Příkladem barvení endospor je Wirtz-Conklinova a Schaeffer-Fultonova metoda. Obarvené endospory se těžko odbarvují kyselinami a jinými sloučeninami (např. alkoholem). Barvitelnost endospor závisí na vývojovém stádiu sporulující buňky, je podmíněna stářím kultury, kvalitou živné půdy, individuálními vlastnostmi mikroorganizmů, a proto nelze barvících metod používat schematicky. Barvitelnost endospor se zlepší použitím sporulačních médií s přídavkem manganu. Nativní preparát pozorovaný fázovým či Nomarského kontrastem umožňuje pozorování skutečného tvaru a struktury buněk neporušených fixací a barvením, dále pozorování růstu, množení a pohybu bakterií. V diagnostické praxi má význam při studiu světlolomných buněčných útvarů, které se obtížně barví (např. endospory). Fázový kontrast využívá odlišné světlolomnosti částic v pozorovaném objektu. Různé struktury buňky mají různé indexy lomu světla a vznikající obraz je výsledkem složení obrazů vln s posunutou fází a vln odkloněných od preparátu. Tmavé endospory se v preparátu jeví jako zářící objekty. Sporulace - proces vzniku endospory Ke studiu sporulace se využívá zejména rodu Bacillus, především druh B. subtillis. Sporulace probíhá i při dostatku živin zejména ve stacionární fázi. Během sporulace B. subtillis lze rozlišit několik fází (obr. 43), které lze charakterizovat morfologicky a na molekulárně biologické úrovni. Za vznik endospory zodpovídá asi 50 genů a celý proces trvá průměrně 6-7 hodin. V průběhu vzniku přepážky je jasné, zda vznikne vegetativní buňka nebo endospora. V případě vzniku endospory buňka přechází od binárního dělení k dělení asymetrickému. Prospora se utváří v tzv. sporogenní zóně. Primárně se přepisují geny, které připraví prostor pro endosporu, zvyšuje se množství volutinu, které lze zjistit barvením. Dochází ke zvýšení množství enzymů, buňka zvyšuje spotřebu acetátu, a navyšuje počet enzymů Krebsova cyklu a hyd-roláz. Na procesu sporulace se podílí amylázy, proteázy, fosfatázy, DNázy. Axiálních filamenta slouží k rozbalení nukleoidu do dlouhého vlákna a replikaci. Vytváří se septum, které postupně rozdělí buňku na dvě nestejné části, je ukončena replikace buněčného genetického materiálu, který se rozestoupí pólům buňky. DNA endospory již není aktivní. Sporogenní zóna je homogenizovaná a zahuštěná. Má vždy jinou hustotu než zbylý obsah buňky. Cytoplazmatická membrána prolife- 92 Pozorování bakteriálních endospor a jejich barvení, negativní barvení ruje kolem obou částí buňky, u prespory dochází k zaobalení dvěma membránami, intina a extina, vchlípením cytoplazmatické membrány. Do prespory se vkládá mnoho vápníku a syntetizuje se v ní kyselina dipikolinová, vzniká prospora. Ubývá volutinu. Prospora není světlolomná, nesvítí při mikroskopii ve fázovém kontrastu. Proces sporulace je již nevratný. Tvorba kortexu spory s odlišným složením peptidoglykanu od složení peptidoglykanu buněčné stěny je řízena chromozomem mateřské buňky. Při vzniku kortexu je obsah volutinu již minimální. Ve spoře je obsažena kyselina dipikolinová, která je syntetizována mateřskou buňkou, její množství je regulováno. Kalcium dipikolinát je charakteristická složka přítomná pouze v endosporách bakterií. Endospora je již světlolomná, se vznikem kortexu je nepropustná pro barvivo, obarvitelná až při výstupu par. Probíhá syntéza dvouvrstevného pláště. U zástupců rodu Bacillus vzniká exosporium složené z 10 proteinů, polysacharidu a lipidů. Unikátnost bílkovin pláště je sledována chemotaxonomickými metodami. Probíhá maturace endospory, lyže mateřské buňky a uvolnění zralých spor. Následuje kryptobiotická fáze volné zralé endospory, která ve vhodných podmínkách může a nemusí klíčit. Její vnější architektura, počet a tvar plášťů je druhově specifická. obaly spory Obr. 43: Obr. 43 Průběh sporulace (zdroj: https://www.quora.com/What-is-microbial-spore; upraveno) Germinace bakteriální endospory Germinace (klíčení endospory, obr. 44) začíná spontánní aktivací endospory. Dochází k destabili-zaci pláště, v laboratorních podmínkách při působení teploty 70-85 °C po 5-10 minutách, dalšími aktivátory jsou malé organické molekuly. Aktivovaná endospora přijímá vodu a ztrácí rezistenci. Bílkovinné stabilizátory jako vnitřní součásti se začínají rozkládat. Vzniklé aminokyseliny slouží pro tvorbu nových proteinů. Nejprve je ovlivněna proteosyntéza (degradační enzymy). V momentě, kdy buňka vytváří energii, začíná fungovat regulační aparát chromozomu (ATP = signál aktivace chromozomu). Prvními funkčními enzymy jsou glykozidázy pro metabolizování kortexu. Následuje rozklad extiny (fosfolipidy, bílkovina, polysacharid). Lytický enzym kortikohydroláza depolyme- Úvodní slovo 93 rizuje kortex pro průnik vody. Dvě hodiny po germinaci endospory dochází k dělení vegetativní buňky. Podle lokalizace klíčení endospory rozeznáváme germinaci terminálni (na pólech buňky) a centrální. Germinaci je možné inhibovat přítomností aminokyseliny D-Ala, MgCl2 a inhibitorem proteáz, fenylmetylsulfonylfluoridem. Obr. 44: Klíčení endospory Clostridium pectinovorum (Prescott a kol., 1996) Cysty rodu Azotobacter Cysty jsou klidová stádia obklopená pláštěm (obr. 45), který je chrání před chemickým a fyzikálním stresem (např. vysychání, záření). Cysty rodu Azotobacter obsahují alkylresorcinol, alginát, po-lyhydroxybutyrát a polysacharidy. Cysta se skládá z oválné buňky, centrálního těla obklopeného dvouvrstvou kapsulou. Cysty jsou vůči nepříznivým podmínkám více odolné než vegetativní buňky, ale méně než endospory. Obr. 45: Stavba cysty rodu Azotobacter, jaderná oblast (Nr), vnější obaly (CCi, CC2), exosporium (Ex) (Prescott a kol., 1996, upraveno) Bakteriální pouzdra Polysacharidové či bílkovinné pouzdro lemuje bakteriální buňku a v prostředí ji chrání proti vysychání, jedům a nepříznivým faktorům. V živočišném těle bakterii maskuje před imunitní od- 94 Pozorování bakteriálních endospor a jejich barvení, negativní barvení povědí makroorganizniu (maskování antigénu, větší odolnost, faktor virulence). Bakterie, které tvoří pouzdra, na misce rozeznáme podle charakteristického mohutně slizovitého vzhledu. Velké kolonie téměř splývají na médiu a za kličkou se táhnou. Pouzdro je jasně oddělené od prostředí, na rozdíl od slizu, který je více rozptýlen kolem buňky. Vysoké množství sacharidů v médiu či prostředí zintenzívňuje tvorbu pouzdra. Schopnost tvorby pouzdra je možné ztratit (mutací), z původní mukózní formy se stává R forma (reverzibilní, drsná) až S forma, která již pouzdro není schopna tvořit. Stejně jako endospory jsou i pouzdra omezeně barvitelná. Pouzdra se nabarví po povaření v barvivu. Pro zvýraznění pouzdra se využívá negativního barvení. Pouzdro je v preparátu ne-zbarveno a je výrazně světlé. Negativní barvení Negativním barvením se obarví okolí buněk, nikoli buňky samotné. Velikost ani tvar buňky není deformovaný fixací a barvivem. Využívá se pro měření přesné velikosti a tvaru bakteriální buňky, pro stanovení pouzder, kapsulí a slizů. Seznam přístrojů a mikroorganizmů Pomůcky a chemikálie • podložní a krycí skla, bakteriologická klička • filtrační papír, sterilní destilovaná voda • nigrosin, Kongo červeň, mety lenová modř, malachitová zeleň Mikroorganizmy • Bacillus megaterium CCM 2007 - spory kulaté, nezduřují buňku, subterminální umístění • Bacillus sphaericus CCM 1615 - spory kulaté, zduřují buňku, terminálni umístění • Bacillus cereus CCM 2010 - spory oválné, nezduřují buňku, centrální umístění • Bacillus thuringiensis CCM 19 - spory oválné, nezduřují buňku, subterminální umístění • Bacillus subtilis CCM 2216 - spory oválné, nezduřují buňku • Paenibacillus polymyxa CCM 1459 - spory oválné, zduřují buňku, centrální umístění • Azotobacter vinelandii CCM 289 (případně izolát z půdy) Postup Při fázovém kontrastu jsou v preparátu zvýrazněny endospory, jejich tvar, velikost a umístění. Pro pozorování endospor je vhodná kultura určitého stáří narostlá na médiu podporující sporulaci, např. u rodu Bacillus kultury staré 2-3 dny. Postup 95 Negativní barvení nigrosinem • Aseptický přenést buňky do malé kapky destilované vody na podložním sklíčku, vedle přidat malou kapku nigrosinu. • Kapky smíchat kličkou, rozetřít jemným tahem druhého sklíčka (přiloženého pod úhlem 45° po celé ploše podložního skla) a bez oplachování nechat zaschnout na vzduchu. • Důležité je vytvořit tenký film barviva s dostatečně zředěnými buňkami. • Pozorovat při zvětšení lOOOx s imerzí. Hodnocení V preparátu jsou viditelné neobarvené buňky na šedém pozadí (obr. 46). Porovnat mezi preparáty tvar a velikost buněk různých druhů jednoho bakteriálního rodu. Výsledek ovlivňuje tloušťka vrstvy barviva (silný nános může po zaschnutí praskat) a koncentrace barviva. 3 J. Kopecká, G. Rotková Obr. 46: Negativní barvení nigrosinem, Azotobacter vinelandii (A), Bacillus megaterium (B), B. mycoides (C), B. sphaericus (D), B. thuringiensis (E) (archiv autorek) Negativní barvení Kongo červení • Aseptický přenést buňky do malé kapky Kongo červeně na podložním sklíčku. • Rozetřít jemným tahem druhého sklíčka (přiloženého pod úhlem 45° po celé ploše podložního skla) a nechat zaschnout na vzduchu. • Opláchnout 1 % HC1, ihned slít, neoplachovat, případně dosušit filtračním papírem. • Pozorovat při zvětšení lOOOx s imerzí. Negativní barvení pouzder nigrosinem u zástupců rodu Azotobacter • Do kapky vody na podložním sklíčku přenést malé množství buněk ze slizovité kolonie, smíchat s kapkou nigrosinu a přikrýt krycím sklíčkem. • Zbytek tekutiny odsát a pozorovat pod objektivem 60 x. • Sedavé buňky jsou obklopeny bílými pouzdry a pozadí je tmavé. Nigrosin nabarví buňky a pozadí, nikoli pouzdra, ta jsou takto nebarvitelná. 96 Pozorování bakteriálních endospor a jejich barvení, negativní barvení Negativní barvení pouzder nigrosinem u zástupců rodu Azotobacter, do-barvení buněk metylenovou modří • Rozmíchat kapku nigrosinu s kapkou vody na podložním sklíčku, do suspenze přenést buňky, rozetřít po sklíčku a nechat zaschnout. • Nátěr pokrýt na 3 minuty roztokem mety lenové modře, opláchnout vodou a osušit. • Pozorovat při zvětšení lOOOx s imerzí. Hodnocení Modré buňky jsou obklopeny světlými pouzdry, pozadí je tmavé. Negativní barvení pouzder Kongo červení u zástupců rodu Azotobacter, dobarvení buněk metylenovou modří • Do kapky Kongo červeně na podložním sklíčku nanést kulturu, suspenzi rozetřít a nechat zaschnout. • Převrstvit na několik sekund HC1. Kyselinu slít, neoplachovat, dosušit filtračním papírem. • Na 3 minuty převrstvit metylenovou modří, slít, opláchnout vodou a usušit na vzduchu. • Pozorovat při zvětšení lOOOx s imerzí. Hodnocení (obr. 47) Modré buňky a cysty obklopené světlými pouzdry na tmavém pozadí. Obr. 47: Negativní barvení zástupců rodu Azotobacter (archiv autorek) Přímé barvení pouzder horkým karbolfuchsinem Výpary karbolfuchsinu jsou jedovaté, ve cvičení se neprovádí. Nativní preparát pro pozorování endospor u zástupců rodu Bacillus (obr. 48) • Do kapky sterilní destilované vody na podložním sklíčku nanést kulturu, rozmíchat a překrýt krycím sklíčkem (nepřikládat svrchu na kapku, ale nejprve jednou hranou, nepřitlačovat). • Buňky z tekutého média pozorovat přímo v bujónu bez ředění v kapce vody. • Ihned pozorovat při fázovém kontrastu (objektiv 60x nebo lOOx), preparát rychle vysychá. Postup Obr. 48: Použití fázového kontrastu u sporulujících bakterií; Bacillus cereus (A), B. megaterium (B), B. sphaericus (C), B. subtilis (D), B. thuringiensis (E), Paenibacillus polymyxa (F) (archiv autorek) Barvení endospor malachitovou zelení - Schaeffer-Fultonova metoda • Zaschlý nátěr buněk na podložním sklíčku fixovat trojím protažením v plamenu. • Nátěr převrstvit malachitovou zelení, zahřívat 3-4x do výstupu par po dobu 5 minut, průběžně doplňovat barvivo. • Opláchnout vodou, převrstvit na 1-3 minuty bez zahřívání pro dobarvení kontrastním barvivem (Kongo červeň). • Opláchnout vodou, usušit, pozorovat při zvětšení lOOOx s imerzí. Hodnocení Zelené endospory uvnitř červených buněk, lze hodnotit tvar a umístění endospor uvnitř buněk i uvolněných endospor (obr. 49). Obr. 49: Endospory Bacillus cereus (A) a Paenibacillus alvei (B) obarvené Schaeffer-Fultonovou metodou (archiv A. Vávrové) 98 Pozorování bakteriálních endospor a jejich barvení, negativní barvení Zhodnocení cvičení • Byly endospory, pouzdra, cysty a buňky dobře odlišitelné a pozorovatelné? • Byl rozdíl ve velikosti pouzdra u izolátu z půdy a sbírkové kultury? • Byly endospory u různých kultur umístěné stejně? • Měly endospory stejný tvar a velikost? Další informace k této problematice najdete v následující literatuře • Prescott L., M., Harley J. P., Klein D. A., Microbiology, WCB, Dubuque, 1996, ISBN 0-697-29390-4. • Songer J. G., Clostridia as agents of zoonotic disease. Vet. Microbiol., 2010, 140: 399-404. • Seznam proteinů zahrnutých do procesu sporulace (zdroj: . 3. 2016). Kontrolní otázky 1. Kterou část preparátu barvíme při negativním barvení? 2. Jak je možno v preparátu zvýraznit pouzdra? 3. K čemu slouží preparát barvený Schaeffer-Fultonovou metodou, jaká barviva a k čemu se při této metodě používají? 4. Kolik je v bakteriální buňce přítomno endospor a jak je můžeme pozorovat? 5. Kde v buňce mohou být endospory umístěny? 6. Lze endospory pozorovat pod fázovým kontrastem? Pokud ano, jak se v preparátu jeví? 7. Co je germinace? 8. Zvláštnosti endospory (počet, umístění, tvar, složení). 9. Jmenujte 2 rody sporulujících bakterií. 10. Jaké výhody poskytuje negativně barvený a nativní preparát pro pozorování morfologie bakteriálních buněk? 11. Jakými mikroskopickými technikami se pozorují endospory? 12. K čemu slouží posouzení různého tvaru a umístění endospor u různých druhů rodu Bacillus? 13. Proč je barvení spor problematické? 14. Jsou negativním barvením obarveny buňky? 18 Základní mikrobiologický rozbor vody Cíl cvičení Stanovit celkový počet psychrofilních a mezofilních bakterií na univerzálním médiu a indikátorové skupiny bakterií na selektivně diagnostických médiích ze vzorku pitné (studna, kohoutková voda) nebo povrchové (rybník, řeka, přehrada, atd.) vody. Úvodní slovo Voda je jedním z přirozených stanovišť bakterií. Jejich množství a druhové zastoupení závisí na zdrojích uhlíku a dusíku a na přítomnosti kyslíku. Množství mikroorganizmů závisí na vlastnostech prostředí (hloubka, přítomnost živočichů a rostlin, proud vody, pH, teplota, vzdálenost od břehu, atd.). Mezi typické vodní bakterie (autochtónni vodní bakterie) patří např. Chromobacterium, Flavobacterium, Sphaerotilus, Leptothrix a Spirillum. Pokud je ve vodě velké množství organické hmoty, více se vyskytují anaerobní nebo fakultativně anaerobní bakterie (např. Clostridium). Splavováním půdy se do vody navíc dostávají aerobní půdní bakterie, např. Micrococcus, Streptomyces a koryneformní bakterie Corynebacterium, Brevibacterium. Vzhledem k mohutnému enzymatickému systému je jejich výskyt limitován koncentrací živin. Krátkodobě se ve vodě mohou vyskytovat pro člověka závažnější bakteriální kontaminanty, především zástupci termotolerantních (fekálních) koliformních bakterií a intestinálních enterokoků a některé druhy rodu Clostridium. Za určitých podmínek můžeme izolovat i patogenní bakterie (např. Salmonella typhi), ale voda pro ně není vhodným stanovištěm, přežívají jen omezeně. Cyanobakterie mají gramnegativní typ buněčné stěny a běžně se vyskytují ve vodě, půdě ale i na pouštích a v polárních oblastech. Mají schopnost fotosyntézy, buňky obsahují chlorofyl v tylakoidech a fykobilizomy (ostatní bakterie schopné fotosyntézy obsahují bakteriochlorofyl). Od ostatních prokaryot se odlišují přítomností vnějšího obalu z polysacharidu či polypeptidů (glyko-kalyx), plynných měchýřků a přítomností enzymu RUBISCO v karboxyzomech. Další zvláštností jsou diferencované buňky: heterocysty (fixace N2), akinety (klidová stádia), baeocyty (reprodukční funkce). Pro masivní rozvoj ve vodě potřebují fosfor, vyšší teploty, určité pH a dostatek živin. Mohou do prostředí uvolňovat cyanotoxiny a způsobovat tzv. vodní květ. Vybraní zástupci: Spirulina, Nostoc, Anabaena, Chroococcus, Cyanobacterium, Microcystis. Specifické prostředí pro mikroorganizmy jsou moře a oceány. Mikroorganizmy jsou součástí planktónu a účastní se koloběhu prvků, musí být tolerantní k soli, teplotě i tlaku, např. Shewanella, Vibrio, Marinobacter, Colwellia, Thiomargarita namibiensis. V hlubokomořských příkopech se vyskytují extremofilní mikroorganizmy (teplota, tlak), především z domény Archaea. Rutinní mikrobiologický rozbor vody je složkou komplexního posouzení kvality vody a jeho provedení a vyhodnocení se řídí státní normou. Při rozboru vody nelze pro materiálovou a časovou náročnost stanovit všechny přítomné mikroorganizmy včetně patogenních. Proto se pro zjištění výskytu z hygienického hlediska závadných bakterií využívá stanovení tzv. indikátorových skupin bakterií, které mají stejný ekologický charakter a lze je rychle a jednoduše stanovit. Stanovení indikátorových skupin (koliformní bakterie, fekální koliformní bakterie, enterokoky, me-zofilní bakterie, psychrofilní bakterie, bezbarví bičíkovci a další mrtvé a živé organizmy) napoví, jaké skupiny mikrobů voda obsahuje. Pitná voda nesmí obsahovat termotolerantní (fekální) koliformní bakterie a intestinální enterokoky. Termotolerantní koliformní, fermentující střevní bakterie jsou důkazem fekálního znečištění vody, což může znamenat i přítomnost patogenů. Na selektivních médiích pro stanovení indikátorů se test na využívání substrátů projeví určitým zbarvením kolonie. 100 Základní mikrobiologický rozbor vody Indikátorová hodnota intestinálních enterokoků a fekálních koliformních bakterií není a nemůže být jednoznačná, je diskutována, zatím však nebyly jako základní organizmy hygienického hlediska uspokojivě nahrazeny. Endo agar je selektivně diagnostické médium s bazickým fuchsinem, který eliminuje růst grampozitivních bakterií, a s laktózou jako zdrojem uhlíku. Štěpení laktózy je typické pro fermen-tující koliformní bakterie. Indikátorem proběhlé biochemické reakce štěpení substrátu laktózy je Schiffovo reagens, které indikuje acetaldehydy. Na Endově půdě roste většina nenáročných gramne-gativních aerobních a fakultativně anaerobních bakterií. Při hodnocení se počítají kolonie laktóza pozitivních bakterií, které rostou v tmavorudých koloniích (médium zčervená), Escherichia coli většinou i s kovově zlatým leskem. Laktózu neštěpící druhy rostou v růžových až průhledných koloniích a do výpočtu se nezahrnují. Kultivace probíhá při 37 °C. Slanetz-Bartley agar se využívá pro stanovení enterokoků. Médium obsahuje trifenyl-tetrazolium chlorid, který enterokoky redukují na červený formazan, kolonie s tmavě rudým pigmentem. Azid sodný slouží jako selektivní činidlo pro potlačení růstu gramnegativních bakterií. Doporučuje se kultivace při 44 °C, protože při 37 °C mohou na médiu vyrůst i streptokoky. Další konfirmační testy pro odlišení od ostatních streptokoků je např. využití antibiotik. Při hodnocení se počítají červené kolonie nebo kolonie s červeným středem a růžovými okraji; bílé a bezbarvé kolonie či malé červené kolonie (menší než 2 mm) se nepočítají. Agar mFC obsahuje laktózu. Selektivní činidlo pro grampozitivní organizmy jsou žlučové soli. Médium obsahuje anilínovou modř, která kolonie zbarví do modra. Při hodnocení se nepočítají světle růžové a šedé kolonie. Kultivace probíhá při 44 °C. TYEA agar obsahuje trypton, kvasničný extrakt a agar. Je to univerzální půda (nese-lektivní médium), která slouží pro stanovení celkového počtu mikroorganizmů (obecné znečištění vody). Při hodnocení se počítají všechny narostlé typy kolonií schopné růst za určité teploty. Kultivace probíhá při 22 °C pro psychrofilní a při 37 °C pro mezofilní mikroorganizmy. Psychrofilní mikroorganizmy jsou bakterie s optimem růstu okolo 20 °C, které indikují přítomnost organických látek rychle rozložitelných bakteriemi při nízkých teplotách. Jejich stanovení se provádí u pitných vod, u povrchových vod především v případě využití zdroje k úpravě na vodu pitnou. Pouze jejich velmi vysoký počet znamená přítomnost mnoha organických látek ve vodě. Psychrofilní bakterie jsou přirozenými autochtony vod. Mezofilní bakterie jsou bakterie s optimem růstu okolo 37 °C, které indikují znečištění mikroflórou teplokrevných živočichů a člověka, včetně možných patogenních mikrobů. Ve vodě je povolen pouze jejich nízký počet. Jako koliformní bakterie se označují některé druhy gramnegativních bakterií z čeledi Enterobacteriaceae, které při kultivaci na selektivně-diagnostických půdách rozkládají laktózu během 24-48 hodin. Typický a běžně rozšířený zástupce je druh Escherichia coli žijící převážně v trávicím traktu teplokrevných živočichů včetně člověka. Je indikátorem fekálního znečištění se schopností růstu i při teplotách 42-44 °C. Kromě E. coli patří ke koliformním termotolerantním bakteriím i druhy rodů Enterobacter, Citrobacter a Klebsiella, které se kromě trávicího traktu mohou vyskytovat i v jiných prostředích. Pro kultivaci koliformních bakterií se používá řada živných médií, většinou s obsahem laktózy. Přítomnost termotolerantních koliformních bakterií ve vodě je možným důkazem znečištění fekáliemi, tedy i případného znečištění střevními patogenními bakteriemi (Salmonella, enterotoxigenní Escherichia coli). V případě, že je podezření na přítomnost patogenů, je potřeba rozšířit základní rozbor o jejich stanovení. Stanovení termotolerantních fekálních koliformních bakterií provedením tzv. teplotního testu potvrdí čerstvé fekální znečištění. Odliší bakterie pocházející ze staršího znečištění, které jsou již součástí heterotrofního společenstva dané lokality. Test se provádí při teplotě 44 °C na mFC médiu. Enterokoky (např. E. faecalis, E. faecium, E. gallinarium, E. avium) jsou skupina fakultativně anaerobních grampozitivních koků, která se vyskytuje v trávicím traktu člověka a živočichů, ale i běžně v prostředí. Enterokoky, na rozdíl od ostatních streptokoků, rostou za přítomnosti Úvodní slovo 101 chloridu sodného (6,5%), při zásaditém pH 9,6 a v rozmezí 10-45 °C. Vyznačují se relativně vyšší termorezistencí a odolností vůči dalším fyzikálním a chemickým vlivům okolního prostředí. Pouze intestinální enterokoky (E. faecalis, E. faecium) jsou považovány za významný indikátor čerstvého fekálního znečištění, především ve vodách pitných, upravovaných dezinfekcí. Pravidla odběru vzorku před jeho kultivací - mikrobiologické rozbory Nádoby na vzorky musí být z průhledného a nezabarveného materiálu (sklo, polyetylén, polypropylen). Nádoby na vzorky musí být sterilizovaný v autoklávu při 121 °C po dobu nejméně 15 minut (sklo, polypropylen), projít suchou sterilizací při 160 °C až 170 °C po dobu nejméně 1 hodiny (sklo) nebo musí být deklarované jako sterilní přímo od výrobce. Při odběru vzorku musí být dodržena aseptická práce. Vzorky je nutno chránit během celé přepravy před vystavením světlu, zejména přímému slunečnímu záření. Vzorek je třeba až do příjezdu do laboratoře uchovávat v chladicím boxu nebo chladničce (podle klimatických podmínek) při teplotě okolo 4 °C. Potrvá-li přeprava do laboratoře déle než 4 hodiny, je nutná přeprava v chladničce. Doba mezi odběrem vzorku a provedením rozboru musí být co nejkratší, ideálně do 24 hodin při uchování vzorku v temnu při teplotě 4 °C ± 3 °C. Dojde-li k prodlení mezi odběrem vzorků a provedením rozboru, upraví se naměřená koncentrace bakterií podle známých vzorců rozkladu, aby byla stanovena koncentrace bakterií v okamžiku odběru. Pitná voda Problematiku pitných vod řeší vyhláška 252/2004 Sb. Posouzení kvality pitné vody se provádí rozbory 2 typů. Při kráceném rozboru jsou měřeny pouze některé chemické a mikrobiologické parametry. Většinou je vyžadován příslušným úřadem u kolaudací studen soukromých osob. V lokalitách, kde se nachází např. uran, arsen, antimon a další prvky, jejichž kvalitu je potřeba rovněž sledovat, je rozbor nutno rozšířit i o geologické souvislosti. Majitelé studní by si měli pravidelně nechávat provádět laboratorní rozbory pitné vody, které provádějí zdravotní ústavy i některé akreditované soukromé firmy. Zkrácený rozbor, který přijde řádově asi na 1500 - 3000 Kč, obsahuje vyšetření na mikroby, barvu, zákal, chemickou spotřebu kyslíku a velice omezené množství chemických látek. Zkoumají se látky obsahující dusík, tj. dusičnany, dusitany a amoniak. Kompletní rozbor vody, který je měřen dle celého rozsahu vyhlášky 252/2004 Sb. je požadován zdravotními ústavy u provozovatelů veřejných vodovodů, u podniků veřejného stravování, hotelů atd. s vlastním zdrojem pitné vody. Četnost rozborů určuje příslušný zdravotní ústav. Od roku 2004 se všechna data z měření vodovodů a také z bazénů, veřejných koupališť apod. zasílají do databáze pitných vod tzv. PiVo Ministerstva zdravotnictví ČR. Povrchová voda Sledování kvality vod ve vodních tocích a nádržích spravují jednotlivá povodí - Povodí Labe, Vltavy, Odry, Ohře a Moravy. Další měření provádí Český hydrometeorologický ústav, Výzkumný ústav vodohospodářský TCM a Státní meliorační správa. Jakost vod se významně zlepšila především díky výstavbě nových čistíren odpadních vod, omezením používání hnojiv v zemědělství a omezováním průmyslových výrob. Problémem zůstává mikrobiální znečištění, které pochází především z komunálních zdrojů znečištění. Nárůst počtu bakterií způsobený vypouštěním komunálních odpadních vod je příčinou, proč velké vodní toky většinou nejsou vhodné ke koupání. Mikrobiologické parametry nejsou při rozborech odpadních vod platnou legislativou vyžadovány (Nařízení vlády 61/2003). Samotné sledování vzniklou situaci neřeší a možností, jak snížit stupeň mikrobiálního znečištění odpadních vod je jejich dezinfekce, která je problematická z hlediska technologií a také finančně náročná. 102 Základní mikrobiologický rozbor vody Odpadni vody Velmi obecně lze říci, že odpadní vody jsou vody, které mají po použití změněnou jakost. U průmyslových odpadních vod jsou dány emisní limity pro jejich vypouštění, hodnoty průměrné a hodnoty maximální, tj. nepřekročitelné hodnoty, které stanovuje vodoprávní úřad. Analýza odpadních vod je prováděna v akreditovaných laboratořích periodicky na základě rozhodnutí příslušného úřadu. Pro některé typy odpadních vod bývá nařízen i tzv. 2hodinový, nebo i 24hodinový odběr, aby se zajistila průměrná hodnota měnících se parametrů v těchto vodách. Seznam přístrojů a mikroorganizmů • TYEA (trypton, yeast extract, agar) • Slanetz-Bartley (SB) agar, Endo agar, mFC agar • Fyziologický roztok, pipety, hokejky, zkumavky • Vzorek vody (pitná/povrchová voda) Postup Pitná voda - neočekáváme znečištění, používat neředěný vzorek a ředění 10_1. Povrchová voda - očekáváme znečištění, používat ředění 10_1 a 10-2. V protokolu vždy uvést zdroj vody! Každé ředění očkovat na min. 2 misky pro vytvoření aritmetického průměru (obr. 50). Postup ve cvičení vychází z normy ČSN 830521; v dnešní době je však platný postup dle Vyhlášky č. 252/2004 Sb. (modifikace použitých médií k záchytu daných bakteriálních druhů; upravená média pro jiné indikátorové skupiny bakterií po filtraci vody). Obecné znečištění • Vzorek vody naředit na koncentraci 10_1, případně 10-2 dle typu vzorku (0,5 ml vzorku do 4,5 ml fyziologického roztoku). • Vzorek dobře promíchat a 1 ml každého ředění pipetovat do sterilních Petriho misek. • Přelít zhruba 15 ml temperovaného TYEA média. • Kultivace probíhá při 22 (psychrofilové) a 37 °C (mezofilové). • Celkem je potřeba 8 misek pro jeden vzorek (2 ředění po 2 miskách a teploty kultivace 22 a 37 °C). Stanovení indikátorů pomocí selektivně diagnostických médií • Vzorek vody naředit na koncentraci 10_1, případně 10-2 dle typu vzorku (0,5 ml vzorku do 4,5 ml fyziologického roztoku). • Vzorek dobře promíchat a 0,1 ml vzorku každého ředění pipetovat na připravené agary v Petriho miskách (SB, ENDO a mFC agar) a rozetřít bakteriologickou L-kličkou. • Kultivace probíhá při 37 (ENDO agar) a při 44 °C (SB a mFC agar). Zhodnocení cvičení 103 • Při stanovení enterokoků z pitné vody (SB agar) je možné koncentrovat vzorek pomocí filtrace vzorku před kultivací. © G. Rotková Obr. 50: Počet misek pro 1 vzorek při rozboru vody (ředění jsou uvedena pro pitnou vodu) (archiv autorek) Zhodnocení cvičení Na TYEA agaru počítat všechny typy narostlých kolonií (obr. 51). Obr. 51: Růst bakterií na TYEA agaru (archiv autorek) Na Endo agaru (obr. 52) počítat kovově lesklé kolonie E. coli, tmavě červené kolonie ostatních koliformních bakterií. Růžové či průhledné kolonie značí laktóza negativní bakteriální izoláty, nepočítají se. Obr. 52: Růst bakterií na Endo agaru (archiv autorek) 104 Základní mikrobiologický rozbor vody Na SB agaru (obr. 53) počítat temně červené kolonie či kolonie s červeným středem a růžovým okrajem = presumptivní intestinální enterokoky. Obr. 53: Růst presumptivních enterokoků na SB agaru (archiv autorek) Na mFC agaru (obr. 54) počítat fialové až tmavomodré laktóza pozitivní kolonie (presumptivní intestinální enterokoky), nepočítat světle růžové a šedé kolonie. Obr. 54: Růst bakterií na mFC agaru (archiv autorek) Pro posouzení výsledků je nutné výsledky přepočítat na CFU/ml v původním vzorku. K hodnocení vybrat dvojici misek vhodného ředění (misky se zhruba 20 - 200 koloniemi) a spočítat počet kolonií. Kolonie počítat ze dna misky a označit fixou na sklo tečkou. Ze získaných hodnot vypočítat průměr, číslo vynásobit kladnou hodnotou ředění. V případě nanášení 0,1 ml vzorku na misku (selektivní média) navíc hodnotou 10 (přepočet na 1 ml). Výsledky porovnat s tabulkami hodnot pro rozbor vody Vyhlášky č. 252/2004 Sb. (obr. 55). Zhodnocení cvičení 105 Pitná voda Vyhláška č. 252/2004 5b,. kterou sc stanoví hygienickí poiadavky na pitnou a teplou vodu a tcinosi a rozsah kontroly pitné vody. Zmeny: vyhliíka i 187,2005 Sb., í. 293/2006 Sb. Bíleni \ckU .>;•*•>• : aru .'■ :.. . -, ."iiM ZľÍíľÍc NilitaJiii láuibcivuii, Miulny EsdiiľiiĽhifcťuli D KU.'[00 ,i, '.: k U 2VÓU KrUrflAnw i} Jcdnuduchi i>TihAlni ůprtvi i dtiinhkc*, nipNklad rychlá Jlltiicc ■ de*r>íel:cf Bŕim jyiikalui upnu chcraKkÉ úprtvi a dřsinltkce. nípílKM dilan>viiii ocfTlirovjaw vady. iráieni. vlorka-viril. ujuzcvánL filirkx, dciúfrfccc (ziwřrtíné chlorováni} Kfltefirnt ^ f Jntcniivni fyňkilm i chcmieti upraví, rozíiřfni úprava. » dejinlekce, tLiprilbd thlůto^ani du budit zlomu, sraženi, vlůfclsovini. U£a2ú\ui. filtrace, kdsorpce (aktivuj uhlil. desinfekc* lozo-mract. za^ťTečn< chlorování I Roisalt analýí krácetté p'tn.'i vi balená voda upravovaná z J..IWI Ikiv'iIiij «l'(ijc náhradní zásobováni, studny 1 ,l ImtIi lil.1 i .'li OK U/100 ml 0 K T J/250 ml ii Kl.lílrm rul O h 1 .lnul) n i ksliíormni haklerla (i Kl.l/HII) iril 1) 1', l.líll.ll n.l 0 KTJ/100 ml Closiridium in;iliimunit U KlJIUKl ml Peeudomonaa aaruijinosa Ľ KTj7?50iiiI jioíty kolonií pil 22 "C 2oa Ku/1 mi 500 KTJ/1 rul 200 KTJ/1 ml MO KTJ/1 ml počjy kolonii pil 3£i *C 10(1 KTJ/1 mP 20 KTJ/1 ml 100 KTJ/1 ml 1UO KTJ/1 ml pilná voda baleriá voda upravovaná z uovitliuvéliu zdroje náhradní zásobováni. ttu-Jny HscliBíinhla coli 0 Kl.I/Kl!) ml 0 KTJ/250 ml 0 KTJ/100 ml 0 KU/IDO ml Jtolif mm n I bakletie 0 KTJ/100 ml n KU/1B0 ml 0 KU/100 ml Clnstrklium porírlriflcní 0 KTJ/100 mí PsfludDmmias aoruplnosn 0 KTJ/250 ml [m ivk^lianlijň^-t; :J',n KI..I/I ml Ulil K UM ml 111j K 1.1/1 n.l MU) K [Jíl ji.; i-. lyh'U.............■(. ■m m.m rul . ■ M.M ,1, ion Kl.r/..... 100 KTJ/1 ml entirokoky □ KTJ/100 ml 0 KTJ/250 ml 0 KTJ/100 mí 0 KTJ/100 ml RfjzsaM malýz roíljoru teplé vudy podle 25Z/2004 teplá voda rkřniúl HĽB Iť^cj-innely 100 KTJ/100 ml (j KTaVSOm paétv kolonii při 36 "C 2U0 KTJ/t ml Rozsah atiíilýz ruzburu teplé vody z mdivlduáltilho zdroje pro hyíjienu zamósliianců podle 25Z/2004 ,l[)|;li:k,i liljkilliilk'.fli;i 1) ľ. 1 ,lí KU] ml l M lilii In. lidi i) K 1 JIIU...... Iľ ;......ly Ulil KLÍMOU lul poäy kolonii pfi :ic 'C 200 KTJ/1 ml ľsiiudumunas nnrui)lnosa 0 KTJMOO ml Slaphvlococcus ÍÍT'ľetrs 0KTJM0Q ml Obr. 55: Výběr požadavků na mikrobiologickou a biologickou analýzu pitné a povrchové vody (Vyhláška č. 252/2004 Sb.) 106 Základní mikrobiologický rozbor vody Další informace k této problematice najdete v následující literatuře • Baudišová D., Správnost a přesnost výsledků při mikrobiologických analýzách vody, VUV, 1998 (zdroj: http://www.mzp.cz/ris/ais-ris-info-copy.nsf/4d735ff9c7e64b58cl2569e7001a2d9c/ 3e5d5bba30el4c0a8025680e003396c6?OpenDocument; 13. 3. 2016) • Centrum pro cyanobakterie a jejich toxiny, www.sinice.cz (13. 3. 2016) • Fykologická laboratoř Přírodovědecké fakulty Jihočeské univerzity, www.sinicearasy.cz (13. 3. 2016) • Kvalita pitné vody, http://sweb.cz/Hlavaty.Vaclav/kvalita.htm (13. 3. 2016) • Vyhláška č. 252/2004 Sb. (zdroj: http://sweb.cz/Hlavaty.Vaclav/vyhl.htm, 13. 3. 2016) Kontrolní otázky 1. Jaké mohou být zdroje nepřesností při mikrobiologickém rozboru vody? 2. Jak se liší postup při základním mikrobiologickém rozboru vody povrchové a pitné? 3. Jaký je postup stanovení celkového počtu psychrofilních a mezofilních bakterií ve vzorku vody pitné nebo povrchové? 4. Jaká selektivně diagnostická média můžeme použít při základním mikrobiologickém rozboru vody? Počítáme na nich všechny kolonie? 5. Jaká je bakteriální indikátorová skupina pro základní mikrobiologický rozbor vody? 6. Využívání jakého cukru se sleduje na Endově agaru? 7. Počítají se na selektivně diagnostických médiích všechny bakteriální kolonie? 8. Jmenujte alespoň 4 druhy bakterií přirozeně osídlující vody. 19 Úvod do identifikace bakterií, biochemické testy a standardizované identifikační systémy Cíl cvičení • Identifikace neznámého izolátu pomocí fenotypových vlastností. • Výběr vhodného kmene pro identifikaci pomocí ENTEROtestu 16. Úvodní slovo Základním předpokladem správné identifikace je práce s čistou kulturou a její základní kultivace pro pomnožení vzorku. U některých vzorků kultivace na diagnostických půdách napovídá, o kterou taxonomickou skupinu se jedná. Identifikace neznámých vzorků bakterií spočívá krok za krokem v hodnocení jejich morfologie (makroskopické a mikroskopické znaky, charakter růstu kolonií, identifikační barvení - Gra-movo, acidorezistentní, tvorba endospor, tvorba pouzdra aj.), fyziologických (vztah ke kyslíku, teplota růstu, rezistence a tolerance k NaCl, žlučovým solím, antibiotikům, typ metabolizmu aj.) a biochemických vlastností (zdroje uhlíku, redukce nitrátů, tvorba indolu aj.). Pokud tyto testy nevedou k úspěšně identifikaci, použijí se doplňující testy, např. serotypizace, fagotypizace, imuno-chemické reakce, chemická analýza buněčné stěny, produkce toxinu, průkaz specifických antigénu, aglutinace nebo genotypizace - PCR reakce, sekvenace 16S rRNA, ribotypizace, hybridizace aj. Testy je možno dělit na několik skupin: sklíčkové (KOH test, katalázový test), zkumav-kové (OF test, TSI test), papírkové (ONPG test, oxidázový test), mikrotesty (ENTEROtest). Destičkové mikrotesty oproti zkumavkovým (jeden test = jedna zkumavka) šetří materiál, energii, čas, prostor a jsou snadno proveditelné. Souprava zpravidla obsahuje reprezentativní soubor 10 až 20 biochemických testů. Mikrotesty pomáhají odstraňovat nesrovnalosti dané individuálními rozdíly v přípravě médií, provedení i hodnocení. K hodnocení se používají diagnostické tabulky a počítačové programy. Testy mají dostatečně dlouhou skladovací dobu. Pro identifikaci se u nás často využívají Mikro-LA-Testy (Erba-Lachema); pro identifikaci gramnegativních fermentujících tyček (čeleď Enterobacteriaceae) se využívá ENTEROtest a ENTERO Rapid, pro identifikaci anaerobů ANAEROtest 23, pro stafylokoky a mikrokoky STAPHYtest 24, pro rozlišení streptokoků a enterokoků STREPTOtest 24, pro identifikaci gramnegativních nefermentujících tyček NEFERMtest 24N. Příklad identifikace neznámého vzorku 1. KOH test - odlišení grampozitivních a gramnegativních buněk 2. Kultivace na MPA a krevním agaru, porovnání vzhledu kolonií a různé teploty kultivace 3. Gramovo barvení, mikroskopie 4. U grampozitivních buněk se hodnotí tvar buněk a další vlastnosti (a) tyčky - po barvení endospor - sporulující (dle vzhledu určíme rod Bacillus), nesporu-lující (Lactobacillus) (b) koky - dle morfologie shluků, hrozníčků (Staphylococcus) dvojic, čtveřic (Micrococcus), balíčků, sarcin (Sporosarcina), řetízků (streptokoky). 108 Uvod do identifikace bakterií, biochemické testy a standardizované identifikační systémy (c) katalázový test - pozitivní např. u rodu Staphylococcus 5. U gramnegativních buněk se hodnotí tvar buněk (gramnegativní koky jsou méně časté, většinou jde o patogeny) a další vlastnosti (a) OF test - bakterie fermentující (fakultativně anaerobní metabolizmus, např. enterobak-terie); bakterie s respiratorním metabolizmem (např. pseudomonády). (b) Oxidázový test slouží k odlišení bakterií s respiratorním a fermentatorním metabolizmem. Čeleď Enterobacteriaceae je klinicky nej důležitější početná čeleď (cca 150 druhů) gramnegativních tyčinek (1-6um dlouhé a 0,3-1 um široké), která je důležitá i pro neklinická odvětí mikrobiologie. Enterobakterie netvoří endospory ani cysty; jsou to nepohyblivé nebo peritrichální, nenáročné chemoautotrofní bakterie. Rostou v rozmezí 18-40 °C s optimem při 37 °C. Čeleď zahrnuje fakultativně anaerobní druhy, většina žije v prostředí a dále často v trávicím traktu obratlovců jako běžná součást mikroflóry. Většina zástupců je nepatogenních, některé druhy jsou však závažnými původci onemocnění. Mezi nejzávažnější patogeny způsobující celkové infekce patří Yersinia pestis, tzv. antropopatogenní serovary salmonel (serovary Typhi, Paratyphi A, Paratyphi B a Paratyphi C) a některé kmeny Escherichia coli. Protože se střevní enterobakterie spolu s výkaly dostávají do vnějšího prostředí, jejich přítomnost (např. ve vodě) ukazuje na fekální znečištění. Rody se navzájem rozlišují podle acidifikace cukrů a cukerných alkoholů, redukce nitrátů, tvorby sulfanu, hydrolýzy močoviny, KCN-testu, glycerolového testu, tvorby indolu, testu na pohyblivost aj.. Diagnostická média speciálně pro enterobakterie jsou např. Endův a MacConkey agar, deso-xycholát-citrátový agar, Salmonella-Shigella agar, agar s briliantovou zelení, Simmons-citrát agar. Jsou oxidáza negativní (kromě rodu Plesiomonas), tvoří katalázu, vždy štěpí glukózu a redukují nitráty. Testy použité ve cvičení KOH test slouží k rychlému odlišení grampozitivních a gramnegativních bakterií. Hydroxid draselný naruší tenkou peptidoglykanovou vrstvu buněčné stěny u gramnegativních bakterií. Buněčný lyzát tvoří viskózni suspenzi, která se táhne za kličkou. Nelze použít u bakterií tvořících sliz. Kataláza je enzym rozkládající peroxid vodíku na volný kyslík a vodu. Některé bakterie jsou schopny redukovat kyslík na peroxid vodíku, který je pro buňky toxický. Obranný mechanizmus snižující toto poškození spočívá v rozkladu peroxidu vodíku na vodu a kyslík. Pro OF test, test na oxidaci/fermentaci (aerobní/anaerobní metabolizmus), se používá médium s glukózou a acidobazickým indikátorem bromthymolovou modří. Při štěpení glukózy dochází ke vzniku kyselin a vzniká žluté zbavení (pozitivní reakce), v zásaditém prostředí indikátor modrá alkalizací a při neutrální reakci je barva média zelená. Médium ve 2 zkumavkách (bez parafinu pro aerobní podmínky, s parafinem pro zajištění anaerobních podmínek) je očkováno vpichem, ve sloupci je možno odečíst i pohyb bakterií. Pozitivní oxidaci i fermentaci glukózy (obě zkumavky žluté) mají fakultativně anaerobní mikroorganizmy. Pozitivní oxidací a zároveň negativní fermentací glukózy se vyznačují aerobní nefermentující druhy, např. Pseudomonas. Negativní oxidaci i fermentaci glukózy mají druhy, které glukózu nefermentují a ani aerobně neštěpí. Glukóza vstupuje do buňky a je dále kataboli-zována. Některé mikroorganizmy katabolizují glukózu oxidatívne za tvorby oxidu uhličitého a vody. Většina však katabolizuje glukózu fermentativně bez použití kyslíku, někdy i v přítomnosti kyslíku. Mikroorganizmy jsou schopny kromě glukózy fermentovat další monosacharidy, disacharidy či polysacharidy. Koncovými produkty fermentace jsou malé organické molekuly, obvykle organické kyseliny (např. kyselina mléčná). Některé mikroorganizmy vytvářejí při fermentaci plyny (vodík, oxid uhličitý). Tvorba kyseliny a plynu se testuje pomocí fermentační zkumavky. Pro zkvašování cukrů platí následující pravidla: pokud kultura nekvasí glukózu, nekvasí ani jiný cukr. Úvodní slovo 109 TSI test (tripple-sugar iron) slouží pro stanovení využití laktózy, glukózy, sacharózy a produkci H2S pomocí indikátoru železa podle Hajný či jiných plynů. Jako indikátor okyselování cukrů se využívá acidobazická bromkrezolová červeň, indikátor produkce H2S je železo. Některé bakterie uvolňují sirovodík z aminokyselin obsahujících síru. Některé enterobakterie tvoří sirovodík redukcí kyslíkatých sirných sloučenin. Produkce sirovodíku je detekována pomocí síranu železnatého (vytváří se černý, nerozpustný sulfid železnatý). Při produkci plynu kvašením glukózy dole ve zkumavce vznikají bubliny. Médium je očkováno vpichem a po šikmé části agaru tzv. hádkem. Využití glukózy jako zdroje uhlíku a energie se posuzuje ve sloupci, využití laktózy a sacharózy v šikmé části agaru. Oxidázový test identifikuje organizmy, které vytvářejí enzym cytochrom c oxidázu (poslední enzym dýchacího řetězce) účastnící se přenosu elektronů v elektronovém transportním řetězci aerobních bakterií na kyslík. Oxidázové činidlo obsahuje chromogenní oxidačně-redukční činidlo, které oxidací mění barvu do modré až tmavě fialové. Test se používá k diferenciaci druhů rodu Pseudomonas, Alcaligenes, Flavobacterium. Oxidáza pozitivní jsou např. Pseudomonas ae-ruginosa, P. putida, P. fluorescens, Plesiomonas atd. ONPG test slouží k důkazu produkce fi-galaktozidázy, která štěpí laktózu. K provedení testu je používán bezbarvý o-nitrofenyl-fi-D-galaktopyranozid, který je v pozitivním případě hyd-rolyzován na žlutý ortho-nitrofenol. ENTEROtest 16 se využívá pro identifikaci fermentujících (pozitivní test fermentace, negativní oxidázový test) zástupců čeledi Enterobacteriaceae izolovaných např. na Endově agaru. Jedná se o komerční systém 16 jamkových testů ve 2 řádcích. Na jedné destičce je možno zpracovávat 6 kmenů. Test je doplněn papírkovým testem pro přítomnost oxidázy. Potvrzení čeledi se provádí testem na fermentaci glukózy. Pro odlišení od čeledi Vibrionaceae se provádí oxidázový test, vibria či aeromonády jsou oxidáza pozitivní. Nejčastější příčiny neúspěšné identifikace jsou kontaminace vzorku, jiná hustota nebo objem suspenze, kápnutí inokula do sousední řady nebo činidla do jiného sloupce, druh nebo atypický kmen, jehož údaje nejsou uvedeny v tabulce. Testy v jamkách: produkce sirovodíku (H2S), dekarboxylace lysinu (LYS), produkce indolu (IND), dekarboxylace ornithinu (ORN), rozklad močoviny (URE), deaminace fenylalaninu (PHE), hydrolýza eskulinu (ESC), utilizace citrátu (SCI), utilizace malonátu (MAL), produkce kyseliny z inositolu (INO), adonitu (ADO), celobiózy (CEL), sacharózy (SUC), sorbitolu (SOR), trehalózy (TRE), mannitolu (MAN). Protože se v prostředí běžně vyskytují bakterie s vnitrodruhovou variabilitou fenotypových znaků, přechází se od identifikačních klíčů, které uváděly pouze pozitivní či negativní reakce, k tabulkám, které obsahují procento kmenů daného druhu, u něhož je test pozitivní. Při vyhodnocení se výsledky (+ či —) zapisují pod příslušné reakce (obr. 56), případně se využije automatizovaného readeru pro odečet s následným vyhodnocením pomocí příslušného softwaru. Každá reakce má pod svým označením uvedenu číslici, která slouží pro výpočet číselného kódu. Pokud je reakce pozitivní, hodnotu číslice přičteme. Pokud je reakce negativní, číslici nebereme v potaz, tzn. neodečítáme. Číselné kódy slouží ke snadnějšímu vyhodnocení a orientaci v tabulkách. 110 Uvod do identifikace bakterií, biochemické testy a standardizované identifikační systémy MIKRCH&TES7* ENTEROtest 16 Erfca Lactiorna mo. Karásek 1d 621 33 Brno, CZ ENTERQle&l 16 ľ ..r non« a ■třl^CrpMri 1 ftao*h,'Ri3dok''S:rip Cípm 2 h HjS : G LVS 4 F IND E OfW D URE 4 c PHE 1 B 2 A SCI M UAL 1 G INO 2 P M» J CEL 0 suc SOS p TRE 2 ÔXI ■ - - .-■ -■ 4- + — - - - - -f - — 1 0 4. O MIKRO©TEST* ENTEROtest 16 r^ijiiTimn.irwiri^i i Eľba Lagherna ;r« KarÉMfc Id 621 33 Bmo. CZ ŕi ŕ Sírni h- V*, Ať ENTEFtOtEst 16 ■ : ■ Pum k . rp««fi i Oonoeta N 0 F E D c B H G F E a c B ■■■■ DNF H,S LYS ■NO om URE PKE •Cl UAL INO MX> CEL suc SOR TRE MAN 1 2 .1 1 í 4 1 2 1 2 4 ■ a 4 1 7 r -r + - — +■ © J. Kopecká, G. Rotková Obr. 56: Vyhodnocení ENTEROtestu 16 (archiv autorek) Pro vyhodnocení lze využít program TNW, který u vybraného výsledku vypočte identifikační skóre a T index. Identifikační skóre je míra výlučnosti identifikace, procento pravděpodobnosti, že kmen náleží právě k tomuto taxonu (druhu) a žádnému jinému: > 99 % je výborné odlišení; 96-99 % značí velmi dobré odlišení; 90-96 % kmen je odlišen a < 90% značí neodlišený kmen. T index určuje typičnost identifikovaného kmene vzhledem k vypsanému taxonu. Čím vyšší T index, tím podobnější je daný kmen obecné charakteristice daného taxonu: > 75 typický kmen; 0,5--7, 75 méně typický kmen; 0,25-0,5 netypický kmen; < 0, 25 zcela netypický kmen. Pro atypický kmen program TNW doporučí další rozlišující testy, případně ukáže nestandardní výsledky. Jako kontrola kvality použitých chemikálií a kontrola interpretace barevných reakcí se používají kontrolní kmeny bakterií, které dávají standardní výsledky. Kontrolní kmeny jsou dodávány Českou sbírkou mikroorganizmů v lyofilizovaném stavu nebo na želatínových discích. Závěrem je třeba zdůraznit, že neznámý izolát je vždy nutné posuzovat komplexně, tzn. přihlédnout k charakteru růstu kolonií, optimálním kultivačním teplotám, původu vzorku, druhu materiálu a nakládání se vzorkem. Seznam přístrojů a mikroorganizmů 111 Seznam přístrojů a mikroorganizmů Pomůcky a chemikálie • Sterilní destilovaná voda, fyziologický roztok • Očkovací kličky, podložní sklíčka, automatické pipety • Mikrotest ENTEROtest 16 • Oxidázové a ONPG proužky • 3 % peroxid vodíku, 3% KOH Mikroorganizmy • Neznámý bakteriální kmen Postup Ve cvičení se používá kombinace testů, některé jsou pouze demonstrační pro odečtení výsledků. KOH test • Do kapky 3% KOH na podložním sklíčku nanést kulturu. • Pokud kultura po rozmíchání kličkou tvoří viskózni suspenzi, která se táhne se za kličkou (lyže stěny a vylití obsahu buňky), je kultura gramnegativní (obr. 57). Obr. 57: Provedení KOH testu u gramnegativní kultury (viskózní suspenze táhnoucí se za kličkou) (archiv autorek) 112 Uvod do identifikace bakterií, biochemické testy a standardizované identifikační systémy Katalázový test • Do kapky 3% H2O2 na podložním sklíčku nanést kulturu. • Pozitivní test se ihned projeví uvolňováním bublinek kyslíku (obr. 58) Obr. 58: Provedení katalázového testu (archiv A. Vávrové) OF test, test na oxidaci/fermentaci glukózy (aerobní/anaerobní metabolizmus) • Test je demonstrační pouze pro odečet výsledků. Pro každý kmen jsou připraveny 2 zkumavky, jedna s parafinem (anaerobní prostředí pro zkvašování glukózy) a jedna bez parafinu (aerobní prostředí pro oxidatívni využívání glukózy). • Žluté zbavení média značí pozitivní reakci; modrá a zelená barva média značí negativní reakci (obr. 59). Ve sloupci je možno odečíst i pohyb bakterií. Obr. 59: Vyhodnocení OF testu. Obě reakce pozitivní (žluté) - kmen využívá glukózu jak aerobně, tak anaerobně; pozitivní aerobní reakce, negativní anaerobní reakce - kmen je schopen glukózu využívat pouze aerobně; obě reakce negativní (zelené až modré) - kmen nevyužívá glukózu jak aerobně, tak ani anaerobně (archiv autorek) TSI test (tripple-sugar iron) • Test je demonstrační pouze pro odečet výsledků. • Médium ve zkumavce je očkováno vpichem a vzápětí rovně šroubovitým roztěrem po šikmém agaru v jediné zkumavce. Postup 113 • Sleduje se zabarvení média a roztrhaní agaru (obr. 60). Zkvašuje-li kultura pouze glukózu, zežloutne pouze sloupec a šikmá plocha zůstane červená (např. salmonely). Pokud bakteriální kultura zkvašuje současně s glukózou laktózu nebo sacharózu, zežloutne sloupec i šikmá část agaru. Produkce H2S se projeví zčernáním média ve sloupci (pozor na odečet fermentace glukózy, kdy černá barva překryje žlutou!). Potrhání agaru či jeho nadzvednutí značí tvorbu plynu (CO2) z glukózy. Obr. 60: TSI test (archiv autorek) Oxidázový test • Na detekční zónu proužkového testu plastovou kličkou (NE kovovou!) nanést 24hodinovou kulturu nebo papírek přímo zatlačit do kultury. • Médium, ze kterého se kultura odebírá, nesmí obsahovat glukózu nebo nitráty. • Pokud reakční plocha do 30 sekund intenzivně modrá, je reakce pozitivní; pokud zmodrá do 2 minut, je reakce opožděně pozitivní. Pokud zůstane barva beze změny nebo se objeví reakce po 2 minutách, reakce je negativní (obr. 61). Obr. 61: Oxidázový test (archiv autorek) 114 Uvod do identifikace bakterií, biochemické testy a standardizované identifikační systémy ENTEROtest 16 • Pro ENTEROtest je důležité vybrat vhodný kmen, tzn. kmen, který pravděpodobně patří do čeledi Enterobacteriaceae (gramnegativní, kataláza pozitivní, fermentuje i oxiduje glukózu, oxidáza negativní). • Z 24 hodinové kultury připravit suspenzi buněk ve 3 ml fyziologického roztoku se zákalem o hodnotě 1 podle stupnice McFarlanda. • Destičku orientovat na výšku, odříznout krycí folii a označit destičku číslem kmene. • Pipetovat 100 ul důkladně protřepané suspenze do každé jamky příslušného řádku. • Některé testy probíhají v anaerobních podmínkách, příslušné jamky zakápnout dvěma kapkami sterilního parafinového oleje: test pro sirovodík (H2S), lysin (LYS), indol (IND), ornitin (ORN), ureáza (URE), arginin (ARG). • Testy před kultivací uložit do sáčku, aby jamky nevysychaly. • Kultivace probíhá při 37 °C po dobu 18 až 24 hodin. • Při hodnocení zakápnout jamku (IND) činidlem pro indol, jamku (PHE) činidlem pro feny-lalanin a jamku (VPT) činidlem pro acetoin dle návodu. • Odečíst všechny reakce ENTEROtestu (obr. 62), fenylalanin do 3 minut, protože po této době pozitivní reakce mizí. Orientovat se dle interpretační tabulky (obr. 63) přiložené k soupravě (případně dle barevné srovnávací stupnice). I O ~n m o o rjrj j> H,S Ufgj IND dg UR RE . PHE MAL li 1 - ijÄÉJ S0R' TRE ^m • • »ů • • ů H2S LYS k IND ORN URE l PHE ESL SCI MAL INO ADO , CEL SUC SOR, TRE MAN JTH*S 0$ URE, PHE ESL SCI ^ MAL 1^ ,1^, ^£ SOR, TRE MAN • • «ů • • ů HSS LYS , IND ORN URE , PHE ESL SCI MAL INO ADO, CEL SUC SOR, TRE MAN --._© A. Vávrová Obr. 62: ENTEROtest 16 (archiv A. Vávrové) Postup 115 ENTEROtest 16 (ft Lachema Barevná škála .' Farebna stupnica f Colour seal* f UeeTHan mxa/ia / Porównaweia skala barw/Siíns-kálay Farbskala / Escala de col&res 1 h g f e d c b a h,s lys ind orn ure phe esl sci © •• ## •• •• •• 0 • • # ill • 2 h g f e d c b a mal ino ado cel sue sor tre man © •• 0 • OXItest ONPtest © •• © 0 0 MIKROdpTEST* ENTEROtest 16 BLUE P«INT OF QUALITY HGFEDCBA 1oooooooo 2oooooooo HGFEDCBA 1oooooooo íoooooooo Ml = H^: ěě 01 ■ LYS: * * r1 - N "j i é El = ŮRM:44 □ 1 ■ LIRE: 4 é 1e-24h 35-37"C HGFEDCBA 1oooooooo oooooooo F1 «IND: 6 CI f'i-L.C1 HGFEDCBA HGF&DCBA_^ é = P-arařlIOVy Olei - Parraffl"l Oll - nap-.Mgono - Olei parBllngwy - ParaffinolaJ - Pataffinol - Acsite do paralina £ = Chiclc - RiBdgenL - Pod^Mb OJ-.rv iV< íůůýens K&assivmittal - Reaclivo ^= Fyziologický rozlo* - Salině - GMspscn-Bpp - RoztwórHili fizjolngicznej - Fiíiůtógíás sóldatban - FTi/sloJog ibcTi& Lósuvig ■ Sduclon fiwlogica šalina Obr. 63: Interpretační tabulka pro ENTEROtest 16 (zdroj: Manuál MikroLaTest, Erba Lachema) ONPG test • Do zbylé suspenze po provedení ENTEROtestu sterilně vložit papírek s ONPG testem. 116 Uvod do identifikace bakterií, biochemické testy a standardizované identifikační systémy • Kultivace probíhá spolu s ENTEROtestem 24 hodin při 37 °C. • Pozitivní výsledek je jasně žluté zbarvení (obr. 64). Obr. 64: Test produkce /3-galaktozidázy (archiv A. Vávrové) Zhodnocení cvičení • Identifikace neznámého vzorku. Další informace k této problematice najdete v následující literatuře • Systém MIKROLA (zdroj: https://www.erbalachema.com/produkty-a-reseni/mikrobiologie/ systém-mikrola/; 21. 3. 2016) • Česká sbírka mikroorganizmů (zdroj: http://www.sci.muni.cz/ccm/; 21. 3. 2016) Kontrolní otázky 1. K čemu slouží KOH test? 2. Proč se místo Gramová barvení používá k rozlišení grampozitivních a gramnegativních buněk KOH test? Je možno tím úplně nahradit Gramovo barvení? 3. Co se stane, pokud vybereme pro ENTEROtest bakterie z jiné skupiny (např. nefermentující)? 4. Co je důležité pro správnou identifikaci neznámého vzorku? 5. Jaké jsou výhody mikrotestů oproti testům zkumavkovým? 6. Využití jakého cukru se sleduje u OF testu? Část II Cytologie a morfologie bakterií 1 Gramovo barvení, negativní barvení, nativní preparát Cíl cvičení Barvení a pozorování mikroskopických preparátů. Úvodní slovo Nativní preparát Při pozorování suspenze nativního preparátu buňky nikdy nefixujeme. Preparát je nebarvený, slouží ke zjištění skutečného tvaru a struktury buněk neporušených fixací a barvením. Využívá se při pozorování růstu, množení a pohybu bakterií. Význam má při studiu buněčných útvarů, které se obtížně barví, např. spor. Pro pozorování struktur se využívá jasné pole, fázový nebo Nomarského kontrast. Fixace preparátu Podstatou fixace je vysrážení buněčných koloidů, zejména bílkovin. Fixací buňky lépe přilnou ke sklíčku, nespláchnou se aplikací barviva či rozpouštědla a lépe přijímají barvivo. Preparát se fixuje až ve chvíli, kdy je nátěr suchý, aby nedošlo k uvaření buněk. Fixace se provádí 3x protažením podložního skla s nátěrem buněk, který je umístěn na horní straně sklíčka, nesvítivou částí plamene. Pokud byly buňky kultivovány v tekutém cukerném prostředí, je nutné buňky od média separovat centrifugací a následně je promýt vodou či pufrem. Buňky kvasinek a vláknitých hub jsou větší než buňky bakterií, tepelná fixace může pozměnit jejich tvar. Proto se většinou fixují chemikáliemi. Fixace i barvení mírně buňky deformují, jejich charakteristický tvar zůstává. Pro měření přesné velikosti buněk se využívá nefixovaný preparát negativně obarvený (obarvení okolí buňky). Barvené preparáty Slouží ke zjištění typu buněčné stěny, tvaru buněk a uspořádání jejich shluků, přítomnosti a uložení endospor, přítomnosti pouzder a vnitřních buněčných struktur (inkluzí) a životaschopnosti buněk. Pro určení morfologie buňky a charakteristických shluků stačí jednoduché barvení buněčné stěny (např. krystalovou violetí) bez rozlišování grampozitivního či gramnegativního typu. Vitální barvení je barvením mrtvých buněk, protože mrtvé buňky přijímají barvivo nebo ho efluxními systémy nevylučují. Struktury buňky se rozlišují diferenciačním barvením, a to jak vnitřní a vnější morfologické útvary (endospory, pouzdra, buněčné stěny), tak chemické složky (volutin, glykogen, škrob). Diagnostické barvení napomáhá identifikaci bakterií (např. Gramovo, acidorezistentní barvení karbolfuchsinem, barvení dle Giemsy). Při negativním barvení se buňky nefixují ani nebarví, obarveno je pouze jejich okolí (např. tuší, nigrosinem). Využívá se pro měření přesné velikosti buněk nedeformovaných fixací a barvením. Preparát se před barvením fixuje vždy kromě barvení negativního a vitálního testu. K barvení se používají zředěné vodné roztoky organických barviv, obvykle soli. Bazická barviva mají barevný kationt, kyselá aniont. Při barvení bakterií se většinou používají bazická barviva (např. krystalová violeť, metylenová modř, safranin, bazický fuchsin, malachitová zeleň). Barvení lze zvýraznit mořením buněk (např. fenolem, taninem), při kterém má moridlo roli prostředníka s vyšší afinitou k buňce a zároveň k barvivu, než je afinita buňky k samotnému barvivu. Úvodní slovo 119 Gramovo barvení Gramovo barvení je jednou z nej důležitějších diagnostických metod při identifikaci bakterií. Rozlišuje skupinu grampozitivních (barví se modrofialově) a gramnegativních buněk (barví se červenorů-žově) a udává některé fyziologické a chemické vlastnosti buňky. Podstata rozdílného chování při Gramové barvení nebyla dosud uspokojivě objasněna, s největší pravděpodobností se uplatňují rozdíly ve složení buněčné stěny obou skupin bakterií. Jde o barvení fixovaného preparátu krystalovou violetí a následné moření buněk jódem v roztoku KI. Vzniká komplex barvivo-jód-buněčná stěna. Rozdíl při barvení vzniká při promývání preparátu organickým rozpouštědlem (acetonem nebo alkoholem). U gramnegativních buněk odbarvovací činidlo rozpustí vnější lipopolysachari-dovou vrstvu, komplex krystalové violeti s jódem se vymyje přes tenkou vrstvu peptidoglykanu a buňky se odbarví, naopak grampozitivní bakterie si zbarvení ponechávají. Pro zvýraznění rozdílu se gramnegativní bakterie dobarvují jiným kontrastním barvivem (např. bazickým safraninem, karbolfuchsinem) a barví se do červena, růžová. Grampozitivní buňky mají v buněčné stěně navázánu krystalovou violeť, která se alkoholem nevyplavila a zůstávají zbarveny do modra, modrofialová. Chyby, které mohou nastat při barvení, jsou: příliš silný nátěr buněk na sklíčku; uvaření buněk při fixaci; příliš dlouhé odbarvování buněk alkoholem. Gramovo barvení je do jisté míry ovlivněno fyziologickým stavem buněk, stářím kultury a složením kultivačního média. Pro barvení se využívají buňky staré 24 hodin. Buňky mohou ztratit svoji grampozitivitu např. mechanickým poškozením, UV zářením, působením kyselin, zásad či rozpouštědel. Mikroorganizmy, které se někdy barví pozitivně a někdy negativně, označujeme jako gramlabilní/gram variabilní. Některé bakteriální rody Gramovým barvením nelze obarvit, jsou to rody bez buněčné stěny (mykoplazmata), spirálovité bakterie a silně acidorezistentní rody (mykobakterie); např. Mycobacterium bovis, M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M. leprae, M. marinum, a dále patogenní Borrelia burgdorferi, B. recurrentis, Bartonella henselae, Chlamydia trachomatis, C. pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Coxiella burnetii, Ehrlichia chaffeensis, Anaplasma phagocytophilum, Legionella spp., Leptospira spp., Rickettsia rickettsii, Orientia tsutsugamushi, Treponema pallidum. Buněčná stěna bakterií Buňky gramnegativního typu (obr. 65B) mají buněčnou stěnu složenou z vnější lipopolysachari-dové membrány a vnitřní relativně tenké peptidoglykanové (zhruba 5-10 % buněčné stěny) vrstvy obsahující kyselinu muramovou. Spojení mezi peptidoglykanem a vnější membránou zajišťují lipo-proteiny. Lipopolysacharidy jsou složeny z lipidu A, jaderného (též základního, dřeňového) polysacharidu a O-antigenu (též O-řetězec). Vnější membrána slouží jako ochranná bariéra před vnějším prostředím, brání prostupu látek nebo postup alespoň zpomaluje (žlučové soli, antibiotika, jedy, atd.). V buněčné stěně grampozitivního typu (obr. 65A) chybí vnější membrána a peptidogly-kanová vrstva je poměrně tlustá. Někteří zástupci mohou mít jako složku buněčné stěny kyselinu teichoovou, lipoteichoovou anebo neutrální polysacharidy, u několika zástupců jsou ve stěně přítomny mykolové kyseliny. Zvláštní skupinou jsou bakterie bez buněčné stěny, tzv. mykoplazmata, které nejsou schopny syntetizovat prekurzory peptidoglykanu. Buňky jsou obklopeny pouze cytoplazmatickou membránou. 120 Gramovo barvení, negativní barvení, nativní preparát Obr. 65: Buněčná stěna grampozitivního (A) a gramnegativního (B) typu (Prescott a kol., 1996, upraveno). Negativní barvení Negativním barvením se obarví okolí buněk, nikoli buňky samotné. Velikost ani tvar buňky není deformovaný fixací a barvivem. Využívá se pro měření přesné velikosti a tvaru bakteriální buňky, pro stanovení pouzder, kapsul a slizu. Vlastnosti vybraných mikroorganizmů Haloarcula extrémně pleomorfní tyčky, většinou plochého průměru a tvaru trojúhelníků a čtvercových nebo nepravidelných disků; gramnegativní; extrémně halofilní (2-5,2 M NaCl); bakterioruberiny a žluté pigmenty Haloferax extrémně pleomorfní, většinou tvar plochých disků nebo pohárků; gramnegativní; kolonie s mukózním vzhledem, extrémně halofilní (1,5-4,5 M NaCl); bakterioruberiny a žluté pigmenty Sporosarcina kulaté či oválné buňky uspořádané jako diplokoky, tetrády nebo krychlovité balíčky; grampozi-tivní; pohyblivé několika bičíky; tvorba spor; krémově až oranžově zbarvené kolonie Leuconostoc sférické či ovoidní buňky uspořádané po dvou či v řetízcích, občas jako krátké tyčky v dlouhých řetízcích; grampozitivní Azotobacter velké ovoidní a pleomorfní buňky, jednotlivě, po dvou, v nepravidelných shlucích či řetízcích; tvorba cyst; gramnegativní Yarrowia lipolytica kvasinky, rozmnožování vegetativně pučením; pseudohyfy i pravé hyfy; jednotlivé vejčité nebo kulovité asky vyrůstající laterálně nebo terminálne; barví se jako grampozitivní bakterie Saccharomyces cerevisiae kvasinky, elipsoidní, kulovité někdy i protáhlé buňky; v některých případech tvoří větvené pseudo-mycelium; pravé mycelium nevytváří; rozmnožování pučením; haplo-diplobiotický životní cyklus, spory diploidních kmenů pol-4 v asku; barví se jako grampozitivní bakterie Seznam přístrojů a mikroorganizmů 121 Seznam přístrojů a mikroorganizmů Pomůcky a chemikálie • Krystalová violeť, Lugolův roztok, safranin • Nigrosin, Kongo červeň, metylenová modř, HC1 Mikroorganizmy • Bacily, G+ tyčky různé tvary (48 hodinová kultura se sporami - fázový kontrast) — Bacillus thuringiensis CCM 19 — Bacillus sphaericus CCM 1615 — Bacillus mycoides CCM 145 — Bacillus cereus CCM 2010 — Bacillus megaterium CCM 2007 — Bacillus subtilis CCM 2216 • G+ koky, krátké tyčky — Azotobacter vinelandii CCM 289 - slizovité kolonie, pouzdra — Leuconostoc mesenteroides CCM 1803 - řetízky, pouzdra, sliz — Sporosarcina ureae CCM 860 — Staphylococcus aureus — Micrococcus luteus CCM 169 • G- tyčky — Serratia marcescens CCM 303 — Escherichia coli CCM 3954 — Pseudomonas putida • Archaea — Haloarcula hispanica CCM 3601T — Haloferax mediterranei CCM 3361T • Eukaryota — Saccharomyces cerevisiae — Yarrowia lipolytica Postup Nativní preparát • Doprostřed podložního sklíčka nanést kapku sterilní destilované vody. • Ožehnutou, vychladlou očkovací kličkou vnést do kapky malé množství kultury, rozmíchat. Kultury stačí nepatrné množství, aby preparát nebyl hustý. 122 Gramovo barvení, negativní barvení, nativní preparát • Kapka se neroztírá, překrývá se krycím sklíčkem tak, aby v preparátu nebyly vzduchové bublinky (nepřikládat svrchu na kapku, ale nejprve jednou hranou, nepřitlačovat). • Přebytečnou kapalinu odsát filtračním papírem. • Buňky z tekutého média pozorovat přímo v médiu bez ředění v kapce vody. • Pro nativní preparát zvolit objektiv s fázovým kontrastem (Ph). • Preparát pozorovat do 5 minut z důvodu rychlého vysychání. Jednoduché bavení • Zaschlý nátěr buněk na sklíčku fixovat plamenem. • Ponořit do roztoku krystalové violeti nebo safraninu na 15-20 sekund. • Opláchnout slabým proudem vody, usušit a pozorovat při zvětšení 1000 x. Gramovo barvení (obr. 66) • Doprostřed podložního sklíčka nanést kapku sterilní destilované vody. • Ožehnutou, vychladlou očkovací kličkou vnést do kapky malé množství kultury. • Suspenzi z kultury rozetřít po sklíčku, nechat dobře zaschnout a fixovat plamenem (několikrát sklíčko protáhnout plamenem). • Preparát ponořit do roztoku krystalové violeti na 30 sekund, opláchnout vodou. • Preparát ponořit do Lugolova roztoku na 30 sekund, opláchnout vodou. • Preparát převrstvit etanolem/acetonem, maximálně na 15-20 sekund, opláchnout vodou. • Preparát ponořit do safraninu na 1 minutu (takto se dobarví pouze buňky gramnegativní, u kterých došlo k vyplavení krystalové violeti; safraninem však dobarvujeme každý preparát, i když předpokládáme přítomnost grampozitivních buněk - předem nevíme, o jaký typ buněčné stěny se v preparátu jedná). • Preparát osušit mezi dvěma filtračními papíry a pozorovat při zvětšení 1000 x v jasném poli (objektiv BF). Postup Obr. 66: Čisté kultury bakterií obarvené dle Grama. Acinetobacter grimontii (A), Arthrobacter sp. (B), Bacillus mycoides (C), B. subtilis (D), Corynebacterium glutamicum (E), Escherichia coli (F), Haloarcula hispanica (G), Lactobacillus casei (H), Leuconostoc mesenteroides (I), Paenibacillus polymyxa (J), Sporosarcina ureae (H) (archiv autorek) Negativní barvení nigrosinem • Aseptický přenést buňky do kapky destilované vody na podložním sklíčku, přidat kapku nigrosinu. • Kapky smíchat kličkou a rozetřít jemným tahem druhého sklíčka (přiloženého pod úhlem 45° po celé ploše podložního skla), nechat zaschnout na vzduchu. • Pozorovat při zvětšení 1000 x s imerzí. Hodnocení V preparátu jsou viditelné neobarvené buňky na šedém pozadí (obr. 67). Porovnat mezi preparáty tvar a velikost buněk různých druhů jednoho bakteriálního rodu. Výsledek ovlivňuje tloušťka vrstvy barviva (silný nános může po zaschnutí praskat) a koncentrace barviva. Obr. 67: Negativní barvení Saccharomyces cerevisiae (A), Bacillus cereus (B), B. subtilis (C), B. subtilis (D), Bacillus sp. (E), Corynebacterium glutamicum (F), Haloferax mediterranei (G), Lactobacillus brevis (H), Lactobacillus casei (I) (archiv autorek) 124 Gramovo barvení, negativní barvení, nativní preparát Negativní barvení Kongo červení • Aseptický přenést buňky do malé kapky Kongo červeně na podložním sklíčku. • Rozetřít jemným tahem druhého sklíčka (přiloženého pod úhlem45° po celé ploše podložního skla) a nechat zaschnout na vzduchu. • Opláchnout 1 % HC1, ihned slít, neoplachovat, případně dosušit filtračním papírem. • Pozorovat při zvětšení lOOOx s imerzí. Nativní preparát pro pozorování tvaru a umístění spor rodu Bacillus (fázový a Nomarského kontrast, obr. 68 a 69) • Do kapky sterilní destilované vody na podložním sklíčku nanést kulturu, rozmíchat a překrýt krycím sklíčkem (nepřikládat svrchu na kapku, ale nejprve jednou hranou, nepřitlačovat). • Buňky z tekutého média pozorovat přímo v bujónu bez ředění v kapce vody. • Ihned pozorovat při fázovém kontrastu (objektiv 60x nebo lOOx), preparát rychle vysychá. Obr. 69: Nomarského kontrast u sporulujících bakterií; Bacillus megaterium (A), B. megaterium (B), B. mycoides (C), B. pumilus (D) (archiv autorek) Zhodnocení cvičení 125 Zhodnocení cvičení • Všímáme si tvaru buněk, spor, poměru šířky a délky buněk, a zda je patrné vyklenutí buněk způsobené endosporami. Další informace k této problematice najdete v následující literatuře • Prescott L., M., Harley J. P., Klein D. A., Microbiology, WCB, Dubuque, 1996, ISBN 0-697-29390-4. • Sedláček I., Taxonomie prokaryot, Masarykova univerzita, Brno, 2007, ISBN 80-210-4207-9. Kontrolní otázky 1. Vysvětlete pojmy bakteriální druh a bakteriální kultura. 2. Jmenujte alespoň 4 barviva používaná v mikrobiologii. 3. Doplňte tabulku: 2 Struktury buňky (barvení inkluzí a pouzder) Cíl cvičení Barvení a pozorování buněčných inkluzí a pouzder. Úvodní slovo Inkluze či inkluzní tělíska (granule organických nebo anorganických látek) jsou viditelné ve světelném mikroskopu a jsou umístěny v buněčném matrix. Některé inkluze nemají membrány a nachází se volně v cytoplazmě (polyfosfátová a některá glykogenová granula), některé inkluze jsou obklopeny jednovrstevnou membránou (tloušťka membrány zhruba 2-4 nm), např. poly-/3-hydroxybu-tyrát, některá glykogenová a sirná granula, karboxyzomy, plynové vezikuly. Membrány inkluzí mohou být tvořeny bílkovinami či lipidy. Fosfáty jsou ukládány ve formě volutinových nebo polyfosfátových granulí a slouží jako zdroj fosfátu, např. pro stavbu nukleových kyselin. Polyfosfát je lineární polymer ortofosfátu spojeného esterovými vazbami. V některých případech může polyfosfát sloužit i jako zdroj energie. Tuk se v buňce se vyskytuje buď rozptýlený ve formě kapének, nebo zabudovaný v membránách. Shromažďuje se v přítomnosti kyslíku, v buňce běžně 2-3 % tuku. Tyto intracelulární inkluze se vyskytují zejména u kvasinek a mikromycet. Nejčastěji se k jejich barvení používá sudan III (0,1 g sudanu III se rozpustí ve směsi 50 ml glycerolu a 50 ml bezvodého 100 % etanolu). Do 20-30 minut se tuk zbarví do růžovo-červena (barvivo se rozpustí v tuku). Glykogen je rozpustný polymer glukózy s a-1,4-vazbami a a-1,6 větvením na každém 8-10 monomeru. Může tvořit až 50% sušiny, je náhodně rozmístěn v celém matrix buňky jako malé granulky (20-100 nm). Ve světelném mikroskopu není viditelný. Může a nemusí mít membránu. Barví se Lugolovým roztokem. Bakteriální glykogen je silně větvený. Slouží jako pohotová rezerva. Je primární zásobní polysacharid u hub. Slouží jako zdroj uhlíku pro zisk energie a biosyntézu. Lugolovo činidlo (též Lugolův jódový roztok) je činidlo skládající se z 1 % jódu a 2 % jodidu draselného a destilované vody. Jodid draselný se přidává pro zlepšení rozpustnosti jódu ve vodě. Činidlo bylo poprvé připraveno francouzským fyzikem J. G. A. Lugolem v roce 1829. Používá se jako povrchové antiseptikum, dezinfekce a jako indikátor přítomnosti organických látek, zejména škrobů, v jejich přítomnosti mění barvu do modrofialové až černé. Barvicích schopností činidla je využíváno při Gramové barvení a dalších technikách úpravy preparátů. Některé bakterie tvoří vrstvu materiálu, která je umístěna vně buněčné stěny. Pokud je tato vrstva organizovaná a nesmývá se snadno, jedná se o bakteriální pouzdro. Pouzdro je většinou složené s polysacharidu, ale může obsahovat i jiné látky, např. pouzdro Bacillus anthracis je složené z kyseliny poly-D-glutamové. Pouzdra jsou dobře viditelná ve světelném mikroskopu při negativním barvení preparátu. Pouzdro poskytuje bakterii řadu výhod: maskuje patogenní bakterii v makroorganizmu, brání vysychání díky zvýšenému obsahu vody, zadržuje řadu bakteriálních virů a hydrofobní toxické látky, např. detergenty. Seznam přístrojů a mikroorganizmů 127 Seznam přístrojů a mikroorganizmů Pomůcky a chemikálie • Mety lenová modř, Sudan III, Lugolův roztok • Kongo červeň, nigrosin • Krycí a podložní skla, klička, destilovaná voda Mikroorganizmy • Saccharomyces cerevisiae • Bacillus cereus CCM 2010 • Bacillus megaterium CCM 2007 • Azotobacter vinelandii CCM 289 • Leuconostoc mesenteroides CCM 1803 Postup Barvení volutinu polychromatickou metylenovou modří (obr. 70) • Nátěr buněk usušit na vzduchu a převrstvit polychromatickou metylenovou modří (Lôfflerova modř, vyzrálá alespoň 12 měsíců) na 1-3 minuty. • Opláchnout, osušit a pozorovat při zvětšení lOOOx. • V preparátu jsou vidět purpurová volutinová zrna a lehce namodralá cytoplazma. Obr. 70: Volutin u Saccharomyces cerevisiae (archiv autorek) 128 Struktury buňky (barvení inkluzí a pouzder) Tuk — barvení Súdánem III (obr. 71) • Smíchat buňky s barvivem Sudan III, nechat působit 10-30 minut. • Překrýt krycím sklíčkem a pozorovat cihlově červené kapičky tuku. Obr. 71: Tuk u Saccharomyces cerevisiae (archiv autorek) Glykogen (obr. 72) • Připravit nativní preparát, vedle krycího sklíčka kápnout Lugolův roztok. • Bezprostředně pozorovat hnědá granula glykogenu. Obr. 72: Glykogen u Saccharomyces cerevisiae (archiv autorek) Postup 129 Negativní barvení pouzder nigrosinem u zástupců rodu Azotobacter • Do kapky vody na podložním sklíčku přenést malé množství buněk ze slizovité kolonie, smíchat s kapkou nigrosinu a přikrýt krycím sklíčkem. Zbytek tekutiny odsát a pozorovat. • Sedavé buňky jsou obklopeny bílými pouzdry a pozadí je tmavé. Nigrosin nabarví buňky a pozadí, nikoli pouzdra, ta jsou takto nebarvitelná. Negativní barvení pouzder nigrosinem u zástupců rodu Azotobacter, do-barvení buněk metylenovou modří • Rozmíchat na podložním sklíčku kapku nigrosinu s kapkou vody, do suspenze přenést buňky, rozetřít po sklíčku a nechat zaschnout. • Nátěr pokrýt na 3 minuty roztokem mety lenové modře, opláchnout vodou a osušit. • Pozorovat při zvětšení lOOOx s imerzí. Hodnocení Modré buňky jsou obklopeny světlými pouzdry, pozadí je tmavé. Negativní barvení pouzder Kongo červení u zástupců rodu Azotobacter, dobarvení buněk metylenovou modří • Do kapky Kongo červeně na podložním sklíčku nanést kulturu, suspenzi rozetřít a nechat zaschnout. • Převrstvit na několik sekund HC1. Kyselinu slít, neoplachovat, dosušit filtračním papírem. • Na 3 minuty převrstvit metylenovou modří, slít, opláchnout vodou a usušit na vzduchu. • Pozorovat při zvětšení lOOOx s imerzí. Hodnocení (obr. 73) Modré buňky a cysty obklopené světlými pouzdry na tmavém pozadí. Obr. 73: Negativní barvení rodu Azotobacter (archiv autorek) 130 Struktury buňky (barvení inkluzí a pouzder) Zhodnocení cvičení • Vyfocení a popis mikroskopických preparátů. Další informace k této problematice najdete v následující literatuře • Prescott L., M., Harley J. P., Klein D. A., Microbiology WCB, Dubuque, 1996, ISBN 0-697-29390-4. Kontrolní otázky 1. Co jsou to inkluze? 2. Jsou všechny inkluze obalené membránou? 3. Jako zdroj čeho může buňka využívat volutinová granula? 4. Jako zdroj čeho může buňka využívat glykogen? 5. V čem je pro patogenní bakterii výhodné pouzdro? 6. Z čeho se skládá bakteriální pouzdro? 3 Pohyb buněk Cíl cvičení • Pozorovat pohyb buněk mikroskopicky a makroskopicky pohyb kultur na misce. • Sledovat pohyb bičíků ve visuté kapce. • Obarvit bičíky a pozorovat v jasném poli a při fázovém kontrastu. • Očkovat polotekuté médium - na misky i do zkumavek. Úvodní slovo Většina pohyblivých bakterií se pohybuje pomocí bičíku, který je ukotven na vnější části plazmatické membrány a v buněčné stěně. Bičík má v průměru zhruba 20 nm a je 15-20 um dlouhý. Bičík je mikroskopicky viditelný až po obarvení, které zvětší jeho tloušťku. Umístění bičíku na buňce může být různé (obr. 74). Figure 12.1 Arrangement of FLagella on Bacterial Cells. (a) In monotrichous, polar, a single flagelluin is located at one end of the cell; (b) in lophotrichouj, polar, many ilagella arc grouped at one end of the cell; (c) in amphitrichous, polar, a single nagellum is located at both ends of the cell; and (d) in peritrichous, flagella ate located all around the cell. Obr. 74: Umístění bičíku na bakteriální buňce. Monotricha (a), polární bičík je umístěn na jednom z konců buňky; lofotricha (b), polární umístění více bičíků na jednom z konců buňky; amfitricha (c), polární bičík je umístěn na obou koncích buňky; peritricha (d), bičíky jsou umístěny na celém povrchu buňky (Prescott a kol. 1996, upraveno) 132 Pohyb buněk Bakteriální bičík je složen ze tří základních částí. Nejdelší část tvoří vlákno, bazální tělo je usazeno v buňce a s vláknem je spojeno háčkem. Vlákno je duté a pevné, složené pouze z jediného proteinu, fiagelinu. Rozdíly ve stavbě bičíku u gramnegativních a grampozitivních bakterií jsou znázorněny na obr. 75. Obr. 75: Stavba bakteriálního bičíku u gramnegativních (a) a grampozitivních (b) bakterií (Pre-scott a kol. 1996, upraveno) Směr rotace bičíku určuje povahu pohybu bakterie (obr. 76). Kromě pohybu pomocí bičíku se bakterie přirozeně pohybují Brownovým pohybem. Spirochety a helikální bakterie se mohou pohybovat slizem díky tzv. axiálnímu filamentu. Dalším typem pohybu bakterií je klouzavý pohyb, např. u cyanobakterií, některých druhů myxobakterií a mykoplazmat. Ačkoli nemají žádné viditelné struktury spjaté s klouzavým pohybem, mohou dosahovat rychlosti až 3 um za sekundu. Obr. 76: Bakteriální pohyb. Vztah mezi rotací bičíku a pohybem bakterie, pohyb pomocí mo-notrichálního bičíku (a, b), peritrichálních (c, d) a polárních bičíků (e), (Prescott a kol. 1996, upraveno) Vlastnosti vybraných mikroorganizmů Bacillus rovné tyčky po dvojicích nebo v řetízcích se zakulacenými nebo čtvercovými konci; grampozitivní; peritrichální; tvorba endospor P s eudomonas gramnegativní; rovné či mírně zakřivené tyčky; jeden či několik polárních bičíků Próteus gramnegativní; rovné tyčky; peritrichální bičíky E. coli gramnegativní; jednotlivé tyčky či ve dvojicích; peritrichální bičíky Seznam přístrojů a mikroorganizmů 133 Seznam přístrojů a mikroorganizmů Mikroorganizmy • mladé kultury (4 nebo 16 hodinové) • Bacillus cereus CCM 2010 • Pseudomonas fluorescens CCM 2115T • Proteus vulgaris CCM 1799 • Escherichia coli CCM 3954 • Micrococcus luteus CCM 169 - pro srovnání nativního preparátu, nepohyblivý Postup Při pozorování bičíků se nesmí pracovat se skleněnými předměty (krom sklíček), protože snadno ulamují bičíky. Pracovat s mladými kulturami 4-16 hodin starými vždy z tekutého média, staré buňky odhazují bičíky. Pozorování pohybu bičíku Visutá kapka • Připravit nativní preparát, kapku suspenze buněk z média pipetovat na podložní sklo. • Nepřekrývat krycím sklem, pozorování objektivem 20x při Nomarského kontrastu, nezanořovat! • Pro vitalitu buněk je důležitý dostatek kyslíku, citlivější buňky se hýbou jen nahoře. • Nutno opatrně přiostřovat na horní část kapky. Barvení bičíků (obr. 77) Barva obsahuje moridlo tanin, které se obalí kolem bičíku, zvětší jeho průměr a zviditelní ho. Barvička na barvení bičíků: roztok I (10 dílů) a II (1 díl), uchovávat zamraženou Roztok I: 10 ml 5% vodného roztoku fenolu, 2 g taninu, 10 ml KA1(S04)2 • 12 H20 Roztok II: nasycený roztok krystalové violeti (12 g) v etanolu (10 ml, 96%) • Připravit nativní preparát na odmaštěné podložní sklo a opatrně překrýt krycím sklem. • Vedle krycího sklíčka kápnout barvičku pro barvení bičíků. • Barvičku prosát filtračním papírem a preparát pozorovat při zvětšení lOOOx s imerzí. 134 Pohyb buněk Obr. 77: Obarvené bičíky Próteus vulgaris (A) a Bacillus cereus (B, C, D) (archiv autorek) Pozorování pohybu na agaru pro testování pohybu Médium obsahuje nízké procentuální množství agaru, polotekuté médium (nižší viskozita prostředí). Složení média: 100 ml demineralizované vody, 0,1 g kvasničného extraktu, 0,01 g K2HPO3, 0,2 g agaru. • Na agar se očkuje jen do středu misky, aby se rozrůstala 1 kolonie. • Kličku s kulturou zanořit ve středu misky do agaru. • Pohyblivé kultury udělají rozrůstající se kruh, někdy vlnící se. Nepohyblivé rostou jen v místě vpichu do určité velikosti. • Výsledky za 3-5 dní. S miskou se nesmí hýbat. U rodu Próteus lze využít jak tuhé (fenomén příbojové vlny, plazivý nárůst), tak polotekuté médium (plavání buněk v médiu). Zhodnocení cvičení 135 Složení Luria-Bertani swarming média s 0,7 % agarem: 100 ml destilované vody, 1 g enzymatického hydrolyzátu kaseinu, 0,5 g kvasničného extraktu, 1 g NaCl, 0,7 g agaru. Zhodnocení cvičení • Pozorujeme pohyb bakterií ve visuté kapce a pohyb bakterií na miskách ve formě mohutně se rozrůstajících kolonií. • Pomocí obarvených bičíků pozorujeme rozdíly mezi různými bakteriemi (monotricha, perit-richa). Další informace k této problematice najdete v následující literatuře • Prescott L., M., Harley J. P., Klein D. A., Microbiology, WCB, Dubuque, 1996, ISBN 0-697-29390-4. • Sedláček I., Taxonomie prokaryot, Masarykova univerzita, Brno, 2007, ISBN 80-210-4207-9. Kontrolní otázky 1. Co jsou to inkluze? 2. Popište typy pohybu: Brownův pohyb, pohyb pomocí bičíků a klouzavý pohyb. 3. Popište rozdíly ve složení bičíku u grampozitivních a gramnegativních bakterií. 4. Z jakého proteinu je složen bakteriální bičík? 5. Cím lze zviditelnit bakteriální bičík pro světelnou mikroskopii? 6. Proč se při pozorování bičíků nepoužívají skleněné pomůcky? 4 Acidorezistentní barvení Cíl cvičení Acidorezistentní barvení a Gramovo barvení gramlabilních buněk. Úvodní slovo Jako gramvariabilní či gramlabilní mikroorganizmy se označují ty, u nichž se v čisté kultuře část buněk obarví grampozitivně a část gramnegativně. Acidorezistentní mikroorganizmy obsahují v buněčné stěně vysoký podíl glykolipidů, zejména my kolových kyselin, mastných kyselin a vyšších alkoholů. Z toho důvodu se neodbarvují anorganickými kyselinami ani směsí kyseliny a alkoholu při barvení dle Ziehl-Neelsena. Acidorezistence má význam k odlišení některých bakteriálních druhů, např. Mycobacterium tuberculosis a M. lepme. Acidorezistentní bakterie jsou relativně nepropustné a rezistentní k slabým barvivům. Pokud se ale obarví barvivem se silnou barvicí schopností (např. bazický fuchsin rozpuštěný v 5 % fenolu), neodbarví se ani 20 % kyselinou sírovou. Acidorezistence závisí na integritě buňky, obsahu lipidů a pravděpodobně i na jejich zvláštním anatomickém uspořádání. Vlastnosti vybraných mikroorganizmů Acinetobacter krátké tyčky až kokotyčky ve dvojicích či řetízcích; gramnegativní či gramvariabilní (obr. 78) Obr. 78: Acinetobacter grimontii obarvený metodou dle Grama (archiv autorek) Corynebacterium rovné či mírně zakřivené štíhlé tyčky se zúženými či ztluštělými konci (kyjovité formy) nebo v krátkých palisádach; grampozitivní; neacidorezistentní Mycobacterium rovné či mírně zakřivené tyčky, občas se větvící; netvoří vzdušné hyfy, konidie ani pouzdra; slabě Seznam přístrojů a mikroorganizmů 137 grampozitivní; acidorezistentní; některé druhy rostou velice pomalu (až několik týdnů) Nocardia mírně či silně větvená vlákna substrátového mycelia rostoucí na povrchu nebo pronikající do agaru, tvorba redukovaného vzdušného mycelia; grampozitivní až gram variabilní; někteří zástupci acidorezistentní Rhodococcus tyčky tvořící silně větvené substrátové mycelium, vlákna se rozpadají do krátkých tyček a koků; někteří zástupci produkují slabé vzdušné hyfy; grampozitivní, mohou být acidorezistentní Seznam přístrojů a mikroorganizmů Mikroorganizmy • Mycobacterium phlei CCM 5639 - acidorezistentní • Nocardia carnea CCM 2756 - acidorezistentní • Rhodococcus erythropolis CCM 277 • Corynebacterium glutamicum CCM 2428 • Acinetobacter grimontii CCM 7198TT Postup Acidorezistentní barvení dle Ziehl-Neelsena • Připravit plamenem fixovaný preparát. • Převrstvit koncentrovaným karbolfuchsinem, zahřát do výstupu par a v případě nutnosti doplňovat barvivo. Preparát zahřívat 3-5 minut (nesmí se vařit). • Opláchnout kyselým alkoholem 2x, maximálně na 15 sekund. • Dobarvit Löfflerovou metylenovou modří nebo malachitovou zelení po dobu 30 sekund. • Opláchnout vodou a pozorovat při zvětšení lOOOx. • Červeně zbarvené acidorezistentní buňky by měly být dobře patrné proti zelenému či modrému pozadí (obr. 79). Obr. 79: Barvení buněk dle Ziehl-Neelsena, Mycobacterium phlei (A), Nocardia carnea (B, C), Rhodococcus erythropolis (D) (archiv autorek) 138 Acidorezistentní barvení Zhodnocení cvičení • Vyfocení a popis mikroskopických preparátů obarvených dle Ziehl-Neelsena. • Dařilo se Gramovým barvením obarvit acidorezistentní kultury? Další informace k této problematice najdete v následující literatuře • Greenwood D., Slack R. C. B, Peuthere J. F., a kol., Lékařská mikrobiologie, Grada Publishing, 1999, ISBN 80-7169-365-0. • Sedláček L, Taxonomie prokaryot, Masarykova univerzita, Brno, 2007, ISBN 80-210-4207-9. Kontrolní otázky 1. Co je cílem acidorezistentního barvení? 2. Jaký je význam dobarvení metylenovou modří při acidobazickém barvení? 3. Pro původce jakých onemocnění se využívá acidorezistentní barvení? 4. Co způsobuje, že jsou mikroorganizmy acidorezistentní? 5 Sklíčkové kultury Cíl cvičení Kultivace aktinomycet. Pozorování vzdušného, substrátového mycelia a srovnání rozdílů. Aktinobakterie (např. Actinomyces, Nocardia, Rhodococcus, Streptomyces) jsou grampozitivní bakterie s vysokým procentuálním obsahem G+C, které většinou tvoří pravé mycelium, často se rozmnožují pomocí exospor, ale na rozdíl od kvasinek a mikromycet se vyznačují prokaryotickou stavbou buňky. Mycelium (stabilní nebo dočasné) je souborem hyf síťovité struktury. Kvasinky mohou vytvářet tzv. pseudomycelium či nepravé mycelium. Kvasinky pučí na pólech a jednotlivé buňky se od sebe neoddělují, zůstávají navzájem spojené. Vlákno pseudomycelia je složeno z protáhlých buněk a jeví se jako zaškrcované. Hyfy pravého mycelia jsou rozděleny přehrádkami a hyfa má po celé délce stejný průřez a nezaškrcovaný vzhled. Pokud části mycelia vrůstají do substrátu, jedná se o mycelium substrátové, pokud jeho části vyčnívají nad povrch substrátu, jde o mycelium vzdušné (obr. 80). Vzdušné mycelium produkuje spory jednotlivě, ve dvojicích, v řetízcích či v různě utvářených váčcích, tzv. sporangiích neboli sporoforech (seskupení spor). Sporangia mohou být umístěna i na myceliu substrátovém, pokud se vzdušné netvoří. Tvar a umístění spor nebo sporangií je významný identifikační znak. Obr. 80: Průřez kolonií aktinomycet, živé buňky jsou označeny zeleně, mrtvé hyfy bíle (Prescott a kol. 1996, upraveno) Nokardioformní aktinomycety tvoří buď substrátové mycelium (Rhodococcus), substrátové i vzdušné mycelium (Nocardia) nebo výjimečně pouze vzdušné mycelium (Sporichthya). Strepto-mycety tvoří bohatě větvená, dlouhá vlákna, substrátové i vzdušné mycelium, na jehož koncích jsou kulaté spory v rovných řetízcích, převážně na vzdušném myceliu. Velikost buňky je v průměru 0,5-2,0 um. Růst je pomalý, kolonie se objevují po 3 až 4 dnech, pokud se tvoří vzdušné mycelium, zralé se objevuje až po 7 až 14 dnech. Tyto hyfy jsou zpočátku bílé, ale s tvorbou spor nabývají různé zbarvení. Aktinomycety mohou růst i v tekutém médiu, ale vyžadují značnou aeraci a protřepávání, protože vytváří shluky na rozdíl od rovnoměrného růstu jiných druhů bakterií. Jsou široce rozšířeny v prostředí, v půdě, na rostlinách; jsou mezi nimi patogeny člověka, zvířat a rostlin. Nokardioformní Úvodní slovo 140 Sklíčkové kultury aktinomycety i streptomycety vytváří charakteristické kolonie s drsným a vrásčitým povrchem a pigmentací. Při snaze pozorovat neporušené substrátové a vzdušné mycelium vycházíme ze skutečnosti, že při odebírání vzorku kolonie pro mikroskopický preparát se mycelium většinou poškodí a nelze jej sledovat v původní podobě nárůstu při zachování jeho struktury. Při pozorování preparátu sklíčkové kultury lze naopak pozorovat hyfy a rozpadající se vlákna bez jejich porušení tak, jak narostly na krycím sklíčku. Očkování kultury musí být přísně sterilní, aby nedošlo ke kontaminaci kultury, nejlépe ve fiowboxu, s vyžíhanou kličkou, ožehnutým skalpelem a ožehnutou pinzetou. Pro sklíčkovou kulturu neexistuje univerzální médium, vychází se z optimálního média doporučeného pro kultivaci daného typu mikroorganizmu. Vlastnosti vybraných mikroorganizmů Nocardia mírně či silně větvená vlákna substrátového mycelia rostoucí na povrchu nebo pronikající do agaru, tvorba i vzdušného mycelia; grampozitivní až gramvariabilní; někteří zástupci acidorezistentní Rhodococcus tyčky tvořící silně větvené substrátové mycelium, vlákna se rozpadají do krátkých tyček a koků; někteří zástupci produkují slabé vzdušné hyfy; grampozitivní, mohou být acidorezistentní Streptomyces vegetativní vlákna tvoří větvené mycelium; vzdušné mycelium tvoří řetízky ze tří i více spor; produkce pigmentů; tvorba trvalých vláken; kolonie vzhledu lišejníků či kožovité, máselnaté kolonie Seznam přístrojů a mikroorganizmů Pomůcky a chemikálie • Sterilní pinzeta, skalpel, destilovaná voda, krycí sklíčka • Sterilní miska se skleněnými kuličkami a podložním sklíčkem • Kultivační média podle typu kultury (v silné vrstvě pro přípravu kultivaci na krycím sklíčku, v tenké vrstvě pro kultivaci na podložním sklíčku) • Očkovací klička Mikroorganizmy • Rhodococcus erythropolis CCM 277 (obr. 81) • Nocardia carnea CCM 2756 (obr. 82) • Streptomyces griseus subsp. griseus CCM 3362 (obr. 83) Seznam přístrojů a mikroorganizmů 141 Obr. 81: Substrátové mycelium Rhodococcus erythropolis (archiv autorek) Obr. 82: Nocardia carnea, substrátové (A), vzdušné (B) mycelium a přechod mezi nimi (C) (archiv autorek) Obr. 83: Streptomyces griseus, substrátové (A), vzdušné (B) mycelium a přechod mezi nimi (C) (archiv autorek) 142 Sklíčkové kultury Postup Vlhké komůrky — kultivace na podložním sklíčku (obr. 84) • Podložní sklo aseptický umístit na kuličky ve sterilních Petriho miskách. • Na podložní sklíčko vyžíhaným skalpelem umístit tenký čtvereček agaru. • Typ agaru vybrat dle kultivovaného mikroorganizmu: Nocardia - médium M8 (yeast glu-cose agar); Rhodococcus - médium MPA či M8; Streptomyces - médium M15 (streptomyces medium). • Vyžíhanou kličkou očkovat podél okrajů a překrýt sterilním krycím sklíčkem (18 x 18 mm nebo 22 x 22 mm). • Pod podložní sklíčko na kuličky pipetovat cca 5 ml sterilní destilované vody. • Kultivovat při 30 °C po dobu 3-5 dní. Pozorování Přímo nárůst na sklíčku, zvětšení 200x nebo 400x, Nomarského kontrast, vzdušné substrátové Krycí SKIICKD ereček agaru krycí sklíčko mycelium mycelium lum myceimm / *^ podložní sklo L o^ocjo p O Op 0"oOqOOqOQoo_) kuličky © j. Kopecká Obr. 84: Kultivace na podložním skle (archiv autorek) Kultivace na krycím sklíčku (obr. 85) • Použít médium dle očkovaného kmene - silnější agar na Petriho misce. • Do agaru zapíchnout sterilní krycí sklíčko vyžíhanou pinzetou pod úhlem 45°. • Kulturu naočkovat z horní strany podél žlábku. Substrátové mycelium prorůstá i agar. • Před pozorováním výsledků (po 3-5 dnech) vytáhnout sklíčko a označit horní i dolní stranu pro rozpoznání vzdušného a substrátového mycelia. Pozorování Sklíčko s narostlou kulturou položit nárůstem na podložní sklíčko. Pozorovat při zvětšení 400 x s imerzí v jasném poli nebo Nomarského kontrastem. Zhodnocení cvičení 143 vzdušné mycelium krycí sklíčko substrátové mycelium © J. Kopecká Obr. 85: Kultivace na krycím sklíčku (archiv autorek) Zhodnocení cvičení • Podařilo se sterilně očkovat sklíčkové kultury? • Byl patrný rozdíl mezi substrátovým a vzdušným myceliem? • Jaký byl typ mycelia, tvar a umístění sporangií, pokud se vyskytovaly? Další informace k této problematice najdete v následující literatuře • Prescott L., M., Harley J. P., Klein D. A., Microbiology, WCB, Dubuque, 1996, ISBN 0-697-29390-4. • Sedláček I., Taxonomie prokaryot, Masarykova univerzita, Brno, 2007, ISBN 80-210-4207-9. Kontrolní otázky 1. Které bakterie a které kvasinky se kultivují technikou sklíčkové kultury a proč? 2. Jakých kultivačních médií se v tomto cvičení využívá? 3. Proč je důležitá sterilita práce? 4. Co je to mycelium, které mikroorganizmy mycelium vytváří a jaké typy mycelií rozeznáváme? 5. Co je to pseudomycelium? 6 Fluorescence Cíl cvičení • Seznámit se s fluorescenční mikroskopií. • Pozorovat autofluorescenci a flourescenci mikroorganizmů vyvolanou fluorochromem (barvivem) při různých vlnových délkách. Úvodní slovo Fluorescence je schopnost některých látek po ozáření světlem o kratší vlnové délce (excitační záření) emitovat světlo o delší vlnové délce. Lze rozlišit dva typy fluorescence primární (autofluorescenci) a sekundární fluorescenci. Autofluorescence je schopnost některých přirozeně se vyskytujících látek (např. chlorofyl), fluoreskovat po dopadu UV záření. Sekundární fluorescencí rozumíme fluorescenci barviva tzv. fluorochromu kovalentně navázaného na sledované buněčné struktuře. Mezi běžně užívané fluorochormy patří fluorescein, rhodamin, auramin a akridinová oranž. SYBR Green je barvička vázající se na nukleové kyseliny (nejvyšší afinitu má k dsDNA). Komplex nukleová kyselina-SYBR Green absorbuje modré světlo (Amax = 497 nm) a emituje zelené světlo (Amax = 520 nm). Při fluorescenční mikroskopii je vzorek vystaven ultrafialovému, fialovému nebo modrému světlu. Mikroskop musí být vybaven zdrojem krátkovlnného světla, jako jeho zdroj slouží xenónová výbojka. Světlo prochází dvěma sadami světelných filtrů. První sada (excitační) propouští pouze žádané vlnové délky a odstraní paprsky o delší vlnové délce. Excitační filtry jsou různě silná barevná skla, modrá až fialová. Druhá sada brání zábranným filtrem vstupu krátkovlnných paprsků do oka. Kondenzor s tmavým polem poskytuje černé pozadí, na kterém fluorescentní objekty září. Pseudomonas fluorescens produkce fluoresceinu; výskyt v půdě, vodě, potravinách, humánním klinickém materiálu Seznam přístrojů a mikroorganizmů Pomůcky a chemikálie • MPA, SYBR Green, PBS pufr Mikroorganizmy • Saccharomyces cerevisiae • Bacillus thuringiensis CCM 19 • Bacillus megaterium CCM 2007 • Pseudomonas fluorescens CCM 2115T Postup 145 Postup Autofluorescence (obr. 86) • Vystavit nárůst fiuoreskující kultury UV záření. Obr. 86: Kultura Serratia marcescens (červený pigment) a Pseudomonas fluorescens bez (A) a s UV ozářením (B) (archiv autorek) Fluorescence emitovaná barvivem SYBR Green (obr. 87 a 88) • Narostlou kulturu promýt v PBS pufru (1,81 g Na2HP04-12 H20, 0,203 g NaH2P04-2 H20, 0,85 g NaCl, 100 ml H20, pH 7), obarvit barvivem SYBR Green a pozorovat fluorescenčním mikroskopem při různých vlnových délkách. Obr. 87: Kultura Bacillus thuringiensis obarvená barvivem SYBR Green a vystavená záření o různé vlnové délce (archiv autorek) 146 Fluorescence Obr. 88: Kultura Saccharomyces cerevisiae obarvená barvivem SYBR Green a vystavená záření o různé vlnové délce (archiv autorek) Zhodnocení cvičení • Fluoreskovala samotná kultura při UV záření (miska/mikroskop)? • Jsou rozdíly ve fluorescenci při různé vlnové délce, proč? Další informace k této problematice najdete v následující literatuře • Prescott L., M., Harley J. P., Klein D. A., Microbiology, WCB, Dubuque, 1996, ISBN 0-697-29390-4. • Sedláček I., Taxonomie prokaryot, Masarykova univerzita, Brno, 2007, ISBN 80-210-4207-9. • Votava M., Lékařská mikrobiologie - vyšetřovací metody, Brno, Neptun, 2010, ISBN 978-80-86850-04-8. Kontrolní otázky 1. Která část buňky fluoreskuje po navázání barviva SYBR Green? 2. Co způsobuje autofiuorescenci? 3. Na co se váže SYBR Green?