1) Analýza aDNA člověka 2) Analýza první neandrtálské DNA 3) Analýza druhé neandrtálské DNA 4) Interpretace nalezených výsledků - Byli Neandrtálci odděleným druhem nebo byli odlišným poddruhem a jsou součástí naší vlastní historie? 5) Křížili jsme se s Neandrtálci? 6) Další nálezy a izolace neandrtálské DNA 7) Analýza jaderných sekvencí a sekvenování genomu Neandrtálce 8) Proč Neandrtálci vyhynuli? 8) Děnisované – co o nich víme Analýza archaické DNA • doposud byla řeč o analýze DNA současných, žijících lidí a populací • nyní se budeme zabývat analýzou tzv. ancient DNA (aDNA) • nejčastěji se získává z kostí nebo zubů problémy: - často velmi degradovaná, zachovány jen fragmenty – používá se proto hlavně mtDNA (velké množství kopií, relativně malá molekula) - při nálezu a odběru potřeba zamezit kontaminaci moderní (současnou) DNA - největší úspěšnost u nálezu několik až desítek tisíc let starých - používá se řada více či méně účinných izolačních metod, v poslední době především komerčně dostupných izolačních sad (tzv. kitů) • analýza je možná díky PCR – zvýšení velmi nízké koncentrace DNA získané po izolaci do analyzovatelného množství, amplifikace jen konkrétního úseku příčinou problémů jsou nejčastěji: - oxidativní poškození, modifikace bazí, křížové vazby - kontaminace současnou DNA 1) Analýza aDNA člověka • izolace a analýza je vzhledem k uvedeným problémům mnohem obtížnější než v případě analýzy současné DNA (její použití je ve studiích běžnější) Co ovlivňuje kvalitu DNA? • biologické faktory - nukleázy v odumírajících buňkách, mikroorganizmy • fyzikální faktory - záření • chemické faktory - složení půdy, mikroorganizmy Příklady některých důsledků: • fragmentace DNA (poškození cukrfosfátové kostry) • modifikace bazí před izolací DNA • modifikace bazí v průběhu PCR (lze ovlivnit částečně výběrem polymerázy) Tyto procesy bohužel nelze ovlivnit! = zabránit degradaci a kontaminaci již při odběru a analýze • ochranné pomůcky, speciální postupy, maximální sterilita prostředí, nástrojů, pomůcek a roztoků • systém negativních kontrol (bez aDNA) • systém opakování = min. dva odběry, dvě oddělené izolace, dvě oddělená opakování PCR, nejlépe ve dvou různých laboratořích • systém pozitivních kontrol - kontrolní amplifikace již potvrzeného specifického úseku pro aDNA - kontrolní amplifikace sekvence charakteristické pro moderní DNA nebo osoby pracující v laboratoři • > 1000 molekul DNA templátu aDNA • nová generace polymeráz – amplifikují i fragmentovanou a modifikovanou aDNA (Shapiro, 2008) • izolovat DNA jen z kostí s vysokým obsahem aminokyselin = vysoká úspěšnost zisku kvalitní DNA (Poinar et al., 1996; Serre et al., 2004) Jak lze problémy alespoň částečně překonat? 1) Analýza aDNA člověka 2) Analýza první neandrtálské DNA 3) Analýza druhé neandrtálské DNA 4) Interpretace nalezených výsledků - Byli Neandrtálci odděleným druhem nebo byli odlišným poddruhem a jsou součástí naší vlastní historie? 5) Křížili jsme se s Neandrtálci? 6) Další nálezy a izolace neandrtálské DNA 7) Analýza jaderných sekvencí a sekvenování genomu Neandrtálce 8) Proč Neandrtálci vyhynuli? 8) Děnisované – co o nich víme Analýza archaické DNA Analýzou mtDNA neandrtálce se pokusíme odpovědět na často kladené otázky: Byli Neandrtálci odlišným druhem nebo patří do vývojové linie moderního člověka? Byli izolovanou skupinou nebo se křížili s moderním člověkem? Máme v naší současné DNA nějaké neandrtálské geny nebo sekvence? Proč Neandrtálci zanikli? Co nám tyto výsledky říkají zajímavého pro naši diskuzi o původu moderního člověka? • Homo neanderthalensis nebo Homo sapiens neanderthalensis • žili v Evropě před zhruba 400 000 až 30 000 lety a v západní Asii asi před 150 000 lety Kdo byli Neandrtálci? • první nález popsán v roce 1856 v údolí Neander v Německu • nově na základě DNA analýz byl jejich výskyt prokázán dokonce i v Centrální Asii a na jihu Sibiře (Krause et al., 2007) 2) Analýza první neandrtálské DNA • v roce 1997 byla poprvé získána aDNA – izolace mtDNA z pažní kosti Neandrtálce z roku 1856 (Mathias Krings et al.) • konkrétně se jednalo o prvně nalezené pozůstatky Neandrtálského člověka v jeskyni Feldhofer v údolí Neander v Německu, žil před zhruba 35 000 až 70 000 lety (Larsen et al., 1998) • Kringsovi a kol. se podařilo analyzovat sekvenci dlouhou 378 pb (HVR1) • porovnali tuto sekvenci s 994 různými sekvencemi žijícího moderního člověka, provedli párová porovnání a hledali odlišnosti mezi neandrtálskou a moderní DNA • nalezli v průměru 27 odlišností (rozdíly kolísaly od 22 do 36 v jednotlivých párových srovnáních) • jako kontrolu provedli také srovnání sekvencí moderní DNA mezi sebou = průměrně 8 rozdílů (1 až 24) • průměrný počet rozdílů v neandrtálské DNA byl tedy asi 3x větší oproti rozdílům v současné DNA (podíl vzorků s rozdíly 23 a 24 v moderní DNA tvořil jen 0,002 %) = Neandrtálci se geneticky odlišují od současných lidí • na základě tohoto srovnání však nelze odpovědět, zda-li byli Neandrtálci zcela oddělenou vývojovou linií 550 000 až 690 000 let • později Krings et al. (1999) izolovali DNA z dalšího jedince z lokality Feldhofer • vedle HVR1 se podařilo získat ještě 340 pb dlouhou sekvenci z hypervariabilního regionu (HVRII) • získané výsledky byly velmi podobné výsledkům z roku 1997 • Neandrtálci se v HVRII regionu odlišují od žijících lidí v průměru na 35 místech (s rozpětím 29 až 43 rozdílů) 1) Analýza aDNA člověka 2) Analýza první neandrtálské DNA 3) Analýza druhé neandrtálské DNA 4) Interpretace nalezených výsledků - Byli Neandrtálci odděleným druhem nebo byli odlišným poddruhem a jsou součástí naší vlastní historie? 5) Křížili jsme se s Neandrtálci? 6) Další nálezy a izolace neandrtálské DNA 7) Analýza jaderných sekvencí a sekvenování genomu Neandrtálce 8) Proč Neandrtálci vyhynuli? 8) Děnisované – co o nich víme Analýza archaické DNA 3) Analýza druhé neandrtálské DNA • Igor Ovchinnikov et al. (2000) – analyzovali DNA neandrtálského dítěte z jeskyně Mezmaiskaya na severním Kavkazu, stáří asi 29 000 let, mtDNA získána z žebra • analyzován úsek HVRI 345 pb dlouhý • Mezmaiskaya mtDNA obsahuje 23 rozdílů oproti současné mtDNA (22 je tisková chyba) (Feldhofer 27 a 35 rozdílů) • Mezmaiskaya mtDNA obsahuje 12 rozdílů oproti mtDNA Feldhofer = i tato neandrtálská mtDNA potvrdila jasnou genetickou odlišnost od DNA současných žijících lidí 1) Analýza aDNA člověka 2) Analýza první neandrtálské DNA 3) Analýza druhé neandrtálské DNA 4) Interpretace nalezených výsledků - Byli Neandrtálci odděleným druhem nebo byli odlišným poddruhem a jsou součástí naší vlastní historie? 5) Křížili jsme se s Neandrtálci? 6) Další nálezy a izolace neandrtálské DNA 7) Analýza jaderných sekvencí a sekvenování genomu Neandrtálce 8) Proč Neandrtálci vyhynuli? 8) Děnisované – co o nich víme Analýza archaické DNA 4) Interpretace nalezených výsledků Byli Neandrtálci odděleným druhem nebo jsou součástí naší vlastní historie? • jasná odlišnost neandrtálské mtDNA potvrzuje závěry na základě fosilních nálezů, tedy že Neandrtálci jsou odlišní Existují dva názory: 1) Neandrtálci byli odlišným druhem, který byl kompletně nahrazen moderním člověkem po jeho příchodu do Evropy. - tento názor však nevylučuje možnost kulturních i sexuálních kontaktů, i když asi s neplodným potomstvem v případě, že se jednalo o tak odlišné druhy, jak se zdá 2) Druhou možností je, že Neandrtálci nebyli odlišným druhem, ale byli součástí jedné vývojové linie, jak předpokládá multiregionální model. - pokud byli Neandrtálci součástí jedné vývojové linie, pak by měl existovat genový tok mezi Neandrtálci a dalšími archaickými populacemi - pokud nebyli reprodukčně izolovaní, pak musíme jejich stopy objevit také v DNA současných lidí Abychom mohli podrobit zkoumání tyto dvě hypotézy na základě genetických údajů, pak potřebujeme mít k dispozici sekvence DNA: 1) žijících lidí 2) Neandrtálců 3) fosílií anatomicky moderních lidí Pak je potřeba prozkoumat genetické a evoluční vztahy: - neandrtálských populací mezi sebou - neandrtálských populací a populací současného člověka - neandrtálských populací a populací starověkého moderního člověka z doby Neandrtálců - populací starověkého moderního člověka a žijícího moderního člověka - 40 000 až -30 000 let současnost Neandrtálec Cromaňonec Láďa Křížek   Interpretace genetických údajů dvou neandrtálských jedinců ve srovnání s DNA žijícího člověka. • mezi Feldhofer a Mezmaiskaya – 12 sekvenčních rozdílů x • v rámci populace žijícího člověka v Evropě najdeme v průměru 5,3 rozdílů (u Asiatů 6,3) • 12 rozdílů (jako neandrtálci mezi sebou) má jen méně než 1 % žijících Evropanů = je tu statisticky významný rozdíl v počtu odlišností v rámci současné žijící populace Evropanů a nežijících Neandrtálců (mezi 5,3 a 12 rozdíly) • oproti tomu uvnitř současné africké populace je četnost rozdílů mezi jedinci v průměru 8,4 • 12 rozdílů má 37 % žijících Afričanů = v porovnání s Neandrtálci statisticky nevýznamný rozdíl = odlišnosti mezi Neandrtálci navzájem jsou podobné jako mezi současnými Afričany • ovšem nutno pamatovat, že porovnáváme pouze dvě neandrtálské sekvence, které ani nepochází z téže doby - Mezmaiskaya je 29 000 let stará a Feldhofer 35 000 až 70 000 let – značný rozdíl ve stáří může stát za většinou rozdílů, jimiž se liší Jak velkou odlišnost bychom očekávali, pokud by byli Neandrtálci stejný druh jako moderní člověk? • podle Kringse et al. je to v průměru 8,0 změn – 27,2 změn je 3x více = Neandrtálci se (na základě dvou / tří sekvencí) spíše zdají být odlišným druhem od žijícího moderního člověka Odlišnost neandrtálské DNA je tedy asi 3x větší než je odlišnost mezi současnými lidmi, kteří jsou zástupci téhož druhu. Je však tento počet rozdílů dostatečný proto, abychom jednoznačně řekli: Neandrtálci byli z genetického hlediska odlišným druhem? • v této sekvenci nalezli: v průměru 25,6 rozdílů mezi Feldhoferem a žijícími lidmi (20-34) v průměru 55,0 rozdílů mezi lidmi a šimpanzi (46-67) • mezi Neandrtálci a žijícími lidmi je i v této sekvenci opět trojnásobný rozdíl (25,6/8,0 = 3,2) a asi poloviční rozdíl oproti odlišnosti mezi žijícími lidmi a šimpanzi (25,6/55,0 = 0,47) • Krings et al. také srovnali 986 sekvencí mtDNA žijících lidí s 16 sekvencemi žijících šimpanzů (333 pb dlouhá sekvence, která se vyskytuje u obou druhů) • na obrázku jsou výsledky zachyceny graficky: • Neandrtálci jsou geneticky odlišní od současných lidí, avšak tato odlišnost není tak velká, jako je odlišnost mezi současnými lidmi a šimpanzi • tento intermediární výsledek je očekávatelný, protože šimpanzi se jako druh oddělili od lidí mnohem dříve (před asi 6 miliony let), zatímco Neandrtálci se od společného předka odvětvili teprve v průběhu posledního milionu let • odhad doby oddělení Neandrtálců a moderního člověka na základě molekulárních hodin (kalibrace 4-5 milionů MRCA člověk-šimpanz) – 550 000 až 690 000 (v souladu s paleoantropologickými odhady) • platí samozřejmě za předpokladu, že Neandrtálci byli odlišným druhem, v opačném případě údaje vypovídají o historii mtDNA, nikoliv o historii dávných populací člověka • stejné analýzy byly provedeny také pro druhou mtDNA Feldhofer • výsledky (viz obrázek) byly stejné: • rozdíly mezi neandrtálskou DNA a DNA žijících lidí jsou větší než rozdíly mezi žijícími lidmi, ale menší než rozdíly mezi lidmi a opicemi (zde šimpanz i bonobo) • odlišnost mezi Neandrtálci a lidmi je také menší než odlišnost mezi zkoumanými opicemi (avšak porovnávány byly dva odlišné druhy – šimpanz a bonobo) • odhad stáří MRCA Neandrtálců a moderního člověka je 317 000 až 741 000 let (365 000 až 853 000 lety podle Mezmaiskaya) • odhad stáří společného předka obou neandrtálských zástupců je mezi 151 000 až 352 000 lety • podle některých tak získané výsledky potvrzují model nahrazení – Neandrtálci a moderní člověk představují odlišné druhy, které se oddělily od společného předka (možná H. heidelbergensis) v období středního Pleistocénu • !!! avšak musíme mít na paměti, že porovnáváme sekvence, které se liší stářím o několik desítek tisíc let (rozdíl mezi neandrtálskou a současnou DNA) = velký rozdíl v sekvencích tak může být odrazem působení genového posunu za dobu zhruba 40 000 let (Nordborg, 1998) • navíc jde o stále malý počet analyzovaných sekvencí Rozmanitost Neandrtálské DNA ve vztahu k regionálním populacím aneb platnost multiregionálního modelu (Neandrtálci jsou poddruhem) stále žije • porovnáme-li HVRI sekvenci prvního zástupce z Feldhoferu s DNA žijících lidí jednotlivých kontinentálních populací, získáme následující údaje: Feldhofer x Evropani = průměrně 28,2 rozdílů Feldhofer x Afričani = průměrně 27,2 rozdílů Feldhofer x Asiati = průměrně 27,7 rozdílů Feldhofer x původní Američani = průměrně 27,4 rozdílů Feldhofer x Austrálie a Oceánie = průměrně 28,3 rozdílů • velmi podobné údaje získáme i pro Feldhofer 2 (HVRII) a pro Mezmaiskaya = odlišnost Neandrtálců je od všech regionálních populací stejná (neplatí pro genomovou DNA – viz později), jinými slovy nenalézáme tu očekávanou větší podobnost s Evropany v případě platnosti multiregionálního modelu • podstata může být v dostatečně dlouho trvajícím genovém toku • důsledkem dostatečně dlouho trvajícího genového toku je, že obě populace jsou si téměř podobné = totéž mohlo nastat v případě populací moderního člověka, pokud trval genový tok dostatečně dlouho, pak je populace Evropanů stejně odlišná od původní Neandrtálské populace jako populace z ostatních regionů = oba modely (nahrazení i multiregionální) mohou tedy vést ke stejnému výsledku • pokud by Neandrtálci s námi sdíleli stejnou vývojovou linii (podle multiregionalistů), pak by jejich genetická odlišnost mohla nasvědčovat tomu, že byli odlišným poddruhem než je moderní člověk • podle některých antropologů Homo sapiens neandrthalensis x Homo sapiens sapiens (poddruhy moderního člověka Homo sapiens ) Byli tedy Neandrtálci odlišným poddruhem? Lze najít důkaz této alternativy také v DNA? • rozdíly mezi jednotlivými poddruhy šimpanze (312 pb oblasti HVRI): mezi centrálním a východním poddruhem = průměrně 19,7 rozdílů mezi západním a východním poddruhem = průměrně 33,0 rozdílů mezi západním a centrálním poddruhem = průměrně 36,2 rozdílů mezi Neandrtálci a žijícími lidmi = průměrně 25,6 rozdílů Jak velká je odlišnost v mtDNA mezi geneticky odlišnými poddruhy? Byli tedy Neandrtálci odlišným poddruhem? • Krings et al. porovnali sekvenčních odlišností v 312 pb dlouhé sekvenci mtDNA mezi jednotlivými poddruhy šimpanzů Pan troglodytes schweinfurthii (východní poddruh) Pan troglodytes troglodytes (centrální poddruh) Pan troglodytes verus (západní poddruh) • počet rozdílů mezi Neandrtálci a žijícími lidmi je menší než mezi dvěma ze tří poddruhů šimpanzů Neandrtálci a žijící moderní člověk mohou představovat odlišné poddruhy v rámci stejného druhu. Prokázanou odlišnost mtDNA Neandrtálců v porovnání s DNA současného člověka je možné prozatím vysvětlit jak pomocí modelu nahrazení, tak i modelu multiregionálního.