Cvičení č. 4
Izolace a charakterizace genomové DNA
Přírodovědecká fakulta MUNI
Brno, duben 2019
CO NÁS DNES ČEKÁ…
1) Teoretický úvod k tématu
2) Seznámení se s protokolem
3) Nastudování protokolu k izolačnímu kitu
4) Izolace genomové DNA z tekuté bakteriální kultury
5) Ověření koncentrace a čistoty DNA spektrofotometricky
6) Příklady
IZOLACE NK
4
Nezbytná podmínka další práce/charakterizace…
2. Izolace nukleových kyselin
PRO IZOLACI NK POTŘEBUJEME ČTYŘI JEDNODUCHÉ KROKY
8
▪ Růst kultury a sklizení buněk
▪ Rozbití buněk a separaci jejich obsahu
▪ Purifikaci NK z buněčného extraktu
▪ Zakoncentrování NK
2. Izolace nukleových kyselin
RŮST BAKTERIÁLNÍ KULTURY
9
tekuté médium
vs. pevná půda
Jak izolujeme DNA z 99 % mikroorganismů,
které nejsou v laboratoři kultivovatelné?
2. Izolace nukleových kyselin
MÉDIA PRO KULTIVACI
10
Definovaná a minimální média
▪ Všechny komponenty známy (směs anorganických
látek, voda, stopové prvky, zdroj C a E)
2. Izolace nukleových kyselin
MÉDIA PRO KULTIVACI
10
Definovaná a minimální média
▪ Všechny komponenty známy (směs anorganických
látek, voda, stopové prvky, zdroj C a E)
Nedefinovaná (komplexní) média
▪ LB medium (lysogeny broth, Luria-Bertani médium)
▪ Složení není přesně známo! Dostačující pro izolaci NK.
2. Izolace nukleových kyselin
NAMNOŽENÍ ESCHERICHIA COLI
11
Podmínky
▪ Aerobní růst (50-250 RPM) v LB médiu, 37°C
Čeho dosáhneme
▪ Zdvojení buněk každých 20 min. (doubling time)
▪ Maximální hustota 5 x 109 buněk/ml
Jak měřit hustotu?
▪ Optická hustota při 600 nm (OD600)
▪ OD600 = 1 ~ 8 x 108 buněk/ml
2. Izolace nukleových kyselin
CENTRIFUGACE
16
▪ Separační metoda – i pro makromolekuly
▪ Chování částic v odstředivém poli dáno jejich
vlastnostmi a povahou prostředí
▪ RCF (Relative Centrifugal Force) = g (gravitační
zrychlení ≠ rpm (rotations per minute)
▪ Správné je uvádět g nebo RCF, případně rpm a typ
rotoru
RCF nebo g = 1.12 x r (mm) x (RPM/1000)²
2. Izolace nukleových kyselin
CENTRIFUGACE - OTÁZKY
16
▪ Jaké typy centrifugace znáte?
▪ Jaké jsou mezi nimi rozdíly?
▪ Co charakterizuje rychlost pohybu částice při
centrifugaci?
2. Izolace nukleových kyselin
PRO IZOLACI NK POTŘEBUJEME ČTYŘI JEDNODUCHÉ KROKY
21
▪ Růst kultury a sklizení buněk
▪ Rozbití buněk a separaci jejich obsahu
▪ Purifikaci NK z buněčného extraktu
▪ Zakoncentrování NK
2. Izolace nukleových kyselin
ODSTRANĚNÍ OBALŮ CHEMICKY
22
▪ Chemická činidla narušují integritu buněčných stěn
▪ Důležité je chemické složení buněčné stěny
▪ Klasický postup u E. coli a příbuzných bakterií:
lyzozym + EDTA + SDS
…a jak to funguje?
2. Izolace nukleových kyselin
ODSTRANĚNÍ OBALŮ FYZIKÁLNĚ
262. Izolace nukleových kyselin
Skleněnými kuličkami (Bead beating)
Sonikace
Osmotický šok
PRO IZOLACI NK POTŘEBUJEME ČTYŘI JEDNODUCHÉ KROKY
29
▪ Růst kultury a sklizení buněk
▪ Rozbití buněk a separaci jejich obsahu
▪ Purifikaci NK z buněčného extraktu
▪ Zakoncentrování NK
2. Izolace nukleových kyselin
PURIFIKACE NK
30
Centrifugace lyzovaných buněk
▪ Nerozpustné buněčné zbytky sedimentují, zatímco
rozpustné složky vč. NK, lipidů proteinů,
polysacharidů a nízkomolekulárních látek zůstávají v
supernatantu a tvoří tzv. bezbuněčný extrakt (cellfree
extract)
2. Izolace nukleových kyselin
PURIFIKACE NK Z EXTRAKTU
31
Degradace
Separace/extrakce
2. Izolace nukleových kyselin
Kyselý fenol
→RNA
→DNA
EXTRAKCE PROTEINŮ NK SMĚSÍ FENOL-CHLOROFORM
34
Fenolová extrakce podle Marmur 1961
▪ Denaturace a vysrážení proteinů mezi dvěma fázemi
▪ Po centrifugaci oddělení těžší organické fáze od lehčí
vodné fáze obsahující NK (pokud fenol ekvilibrován
neutrálním či zásaditým pufrem)
2. Izolace nukleových kyselin
JINÉ ZPŮSOBY ODSTRANĚNÍ KONTAMINANT
Detergent cetyltrimetylamonium bromid (CTAB)
▪ S nukleovými kyselinami tvoří nerozpustný komplex
▪ V supernatantu po centrifugaci proteiny atd.
▪ DNA v peletu, rozpustíme ji v 1 M NaCl a dočistíme
Guanidium thiokyanát
▪ Denaturuje vše kromě NK
▪ V jeho přítomnosti se DNA váže na oxid křemičitý –
chromatografická kolona
PRO IZOLACI NK POTŘEBUJEME ČTYŘI JEDNODUCHÉ KROKY
38
▪ Růst kultury a sklizení buněk
▪ Rozbití buněk a separaci jejich obsahu
▪ Purifikaci NK z buněčného extraktu
▪ Zakoncentrování NK
2. Izolace nukleových kyselin
Zakoncentrování NK precipitací
39
▪ Jedna ze základních metod izolace a koncentrace
biologických makromolekul
▪ Do roztoku, obsahujícího danou makromolekulu, se
přidá precipitační činidlo (síran amonný, ethanol se
solí, aceton se solí apod.)
▪ Makromolekuly se vysráží, aniž dojde k nevratné
denaturaci. Mohou se proto znovu rozpustit a použít
ve své nativní, biologicky aktivní podobě
2. Izolace nukleových kyselin
POSTUP PRECIPITACE
40
▪ Přidání ethanolu (absolutního) či izopropanolu
▪ Přidání jednomocných kationtů (K+, Na+) v podobě
soli (2 M NaCl, 3 M octan sodný…)
▪ Koncentrování vychlazeného (až -70°C) vzorku
centrifugací
▪ Promytí sedimentu s NK 70 % ethanolem
▪ Odpaření zbytkového ethanolu a rozpuštění NK ve
vodě či nízkomolárním TE pufru (Tris-HCl, EDTA)
2. Izolace nukleových kyselin
…a jaký je vlastně princip???
41
Na+
Na+
Na+
Rozpustná
Nerozpustná
C2H5OH Na+
2. Izolace nukleových kyselin
KOMERČNÍ KITY PRO IZOLACI NK (SPIN COLUMNS)
33
https://en.wikipedia.org
▪ Kolonky s křemičitou matricí
▪ Vazba usnadněna guanidinium
thiokyanátem
5. Chromatografické metody
SPEKTROFOTOMETRICKÁ METODA
602. Izolace nukleových kyselin
Která část NK absorbuje UV?
minimum
maximum
Spektrum DNA (230-320 nm)
KONCENTRACE NK
612. Izolace nukleových kyselin
OD260 = 1.0
dsDNA ~ 50 μg/ml
ssDNA ~ 33 μg/ml
ssRNA ~ 40 μg/ml
ČISTOTA DNA
622. Izolace nukleových kyselin
Stanovuje se na základě
poměrů absorbancí při
různých vlnových délkách
A260/280 = 1.8
< 1.8 = kontaminace proteiny
> 1.8 = kontaminace RNA
A260/230 > 2.0 (ale < 3.0)
< 2.0 = kontaminace látkami z izolačních
souprav