Cvičení č. 5 Detekce virové DNA v biologickém materiálu metodou real-time PCR Přírodovědecká fakulta MUNI Brno, duben 2019 CO NÁS DNES ČEKÁ… 1) Teoretický úvod k tématu 2) Seznámení se s protokolem ke cvičení 3) Nastudování protokolu ke kitu pro detekci virové DNA 4) Izolace virové DNA ze vzorku simulované moči 5) Real-time PCR se vzorkem izolované virové DNA 6) Příklady VÝZNAM REAL-TIME PCR V MIKROBIOLOGII Široké využití v mikrobiální diagnostice: ▪ detekce NK infekčních agens v klinické mikrobiologii ▪ Hodnocení kvality potravin ▪ Hodnocení biologického rizika ▪ Hodnocení kvality vody ▪ Detekce GM mikroorganismů atd. … PRINCIP REAL-TIME PCR ▪ Kombinovaná amplifikace a detekce cílové NK současně v jedné zkumavce pomocí světelného signálu z fluoroforů (základ stejný jako klasická PCR) ▪ Je možno dynamicky (v reálném čase) posuzovat průběh syntézy PCR produktu ▪ Možné kvalitativní (NK je/není ve vzorku přítomna) i kvantitativní (ve vzorku je X molekul NK) vyhodnocení DĚLENÍ REAL-TIME PCR DLE POUŽITÝCH FLUOROFORŮ 1) Nespecifické metody: nespecifická vazba fluoroforu přímo do vznikajících produktů PCR (ds DNA), např. SYBR® Green I ▪ Výhody: jednoduché provedení, nízká cena ▪ Nevýhody: možná detekce i nespecifických produktů (fluorofor se váže do všech dsDNA produktů) DĚLENÍ REAL-TIME PCR DLE POUŽITÝCH FLUOROFORŮ DĚLENÍ REAL-TIME PCR DLE POUŽITÝCH FLUOROFORŮ 2) Specifické metody: na PCR produkty se váží hybridizační sondy značené fluoroforem, např. TaqMan®, lineární či vlásenkové sondy FRET, Beacons ▪ Výhody: vysoká specifita sond k cílové sekvenci NK, možnost kombinace různých sond v jedné reakci ▪ Nevýhody: vyšší cena DĚLENÍ REAL-TIME PCR DLE POUŽITÝCH FLUOROFORŮ R Q R5´ Princip technologie TaqMan R: např. 6-karboxyfluorescein (FAM) Q: např. tetramethylrhodamin (TAMRA) FRET: Försterův rezonanční přenos energie VÝSLEDEK REAL-TIME PCR JE VŽDY STEJNÝ 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 2 6 10 14 18 22 26 30 34 38 42 46 50 Počet PCR cyklů Fluorescence KVANTITATIVNÍ VYHODNOCENÍ POMOCÍ KALIBRÁTORŮ 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 6 10 14 18 22 26 30 34 38 42 46 50 Počet PCR cyklů Fluorescence Standard 10exp4 Standard 10exp3 Standard 10exp2 Standard 10exp1 Vzorek 1 Vzorek 2 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 10exp1 10exp2 10exp3 10exp4 Koncentrace Tresholdcyclus Vzorek Typ vzorku Ct Koncentrace (kopií/ul) 1 Neznámý 25,64 3,50E+03 2 Neznámý 29,23 2,50E+02 K1 Standard 23,97 1,00E+04 K3 Standard 27,16 1,00E+03 K3 Standard 30,68 1,00E+02 K4 Standard 33,53 1,00E+01 y = ax + b PŘÍSTROJE PRO REAL-TIME PCR ZABRÁNĚNÍ KONTAMINACE URACIL-DNA GLYKOSYLÁZOU https://eng.bioneer.com/20-k-6714-cfg.html