Biologie živočichů - cvičení Základy práce s mikroskopem, histologie Helena Nejezchlebová helanej@sci.muni.cz Cíle lekce üstudent se seznámí se základními fakty o světelné mikroskopii vč. správného postupu mikroskopování ü student nastuduje strukturu vybraných histologických preparátů • Studijní materiály üwww.sci.muni.cz/ptacek üJunqueira L.C., Carneiro J., Kelly R. Základy histologie. H+H, Jinočany. 1997, 502 s. üLüllmann-Rauch R. Histologie. Překlad 3. vydání. Grada, Praha. 2012, 556 s. üKnoz J. Obecná zoologie. I Taxonomie, látkové složení, cytologie a histologie. II Organologie, rozmnožování, vývoj živočichů a základy biologie. PřF UJEP, Brno. 1984. ü ü ü ü ü ü ü ü Histologie ünauka o tkáních (histos = tkáň, logos = nauka, řeč.), mikroskopická anatomie zaměřená na studium tkání ü ütkáně se diferencují a specializují během ontogenetického vývoje. Původně většinou z jediné buňky při pohlavním rozmnožování (nebo skupiny buněk při rozmnožování nepohlavním) se vytvářejí dělením a uspořádáním (polohou) první tzv. zárodečné listy, ze kterých se postupně diferencuje další tkáň. ü üv nejjednodušším případě je tkáň tvořena jediným typem buněk s určitou funkcí ü üčasto je základní buněčný typ doplněn jedním či více typy buněk jiných (fixní a volné buňky) ü üepitely, pojiva, svaly, nervové tkáně ü ü Světelná mikroskopie üzákladní technika pro pozorování ve všech oborech, kde předmětem pozorování je buňka (tkáň, pletivo, …), protože rozlišovací schopnost této techniky odpovídá velikosti buňky/organel. ü üsvětelný mikroskop: • - optický přístroj, založený na interakci fotonů a tkáňových složek • - teor. rozlišovací schopnost 0,17 μm • - zvětšuje obraz až 1 500x • - obraz je převrácený a zvětšený ü üzásada: Postupujeme od celku k detailům ü ü ü https://encrypted-tbn1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcTTJKVbiQefZoJgiXoo2L8CHCENL5VJNEWvYFV2C_pg1Bi PGAfL üObrázek převzat z archives.microbeworld.org Galileo Galilei (?) – zpráva o jeho práci s mikroskopem z roku 1610 Hans a Zacharias (syn) Janssenovi (?) – Hol., přelom 16. a 17. století J. Kepler: Dioptrica – 1611 – schéma kompaundního mikroskopu (objektiv a okulár) Antony van Leeuwenhoek (Hol., 1632–1723) - zdokonalení v 17. stolení, zakladatel mikroskopické anatomie Robert Hook (Ang.) - Micrographia (1665): mikroskopickém pozorování rostlinných tkání a struktury minerálů J. J. Lister (1829) - vynalezl achromatický objektiv – navýšení rozlišovací schopnosti, eliminace artefaktů! 1931: Max Knoll a Ernst Ruska: elektronový mikroskop - nositelem informace o objektu je elektron ve vakuu, teor. rozlišovací schopnost 0,002 nm, praktická 0,1 nm Galileo Galilei (?) – zpráva o jeho práci s mikroskopem z roku 1610 Hans a Zacharias (syn) Janssenovi (?) – Hol., přelom 16. a 17. století J. Kepler: Dioptrica – 1611 – schéma kompaundního mikroskopu (objektiv a okulár) Antony van Leeuwenhoek (Hol., 1632–1723) - zdokonalení v 17. stolení, zakladatel mikroskopické anatomie Robert Hook (Ang.) - Micrographia (1665): mikroskopickém pozorování rostlinných tkání a struktury minerálů J. J. Lister (1829) - vynalezl achromatický objektiv – navýšení rozlišovací schopnosti, eliminace artefaktů! 1931: Max Knoll a Ernst Ruska: elektronový mikroskop - nositelem informace o objektu je elektron ve vakuu, teor. rozlišovací schopnost 0,002 nm, praktická 0,1 nm Stavba mikroskopu üoptické části: okulár, objektiv üosvětlovací části: zdroj, kondenzor, clona polní a aperturní • staré mikroskopy: zrcátko J ümechanické části: podstavec, nosič, tubus, revolverový měnič objektivů, stolek - křížový posuv, mikro- a makrošroub ü üjednotky měření používané v histologii: μm, nm, dříve mikrony μ (stejná hodnota jako μm) a Å (1 ångström = 10-10 m) • Obrázek1 Jak správně mikroskopovat? üzkontrolujeme mikroskop. • üzkontrolujeme preparát okem (proti světlu) – získáme orientační představu o počtu, umístění, velikosti mikroskopovaných objektů. Případně preparát očistíme (alkoholéther, alkohol). ü üumístíme preparát krycím sklem nahoru na stolek, přichytíme svorkou. Stolek je vyšroubovaný úplně nahoru (za pomoci makrošroubu). ü üzačínáme mikroskopovat nejmenším objektivem (4x) tak, že pomalu pohybujeme stolkem dolů až do okamžiku, kdy je obraz ostrý. ü ümáme-li takto zaostřeno, pokračujeme při druhém nejmenším zvětšení, analogicky postupujeme k objektivům s větším zvětšením. ü üu silnějších objektivů pozor na rozdrcení krycího skla preparátu! • Objektiv •soustava čoček zajišťujících zvětšení a rozlišení •čočky: skleněné nebo plastové, alespoň 1 plocha je kulová (vypouklá nebo vydutá) • vytváří skutečný, převrácený, zvětšený obraz (okulár tento obraz zvětšuje – funkce lupy - a promítá na sítnici pozorovatele). • •demonstrace: Objektivem 4x pozorujeme vytištěné a vystřižené písmo: co je v zorném poli vpravo/nahoře, je v preparátu vlevo/dole. Tím se řídíme při hledání objektu v preparátu • •celkové zvětšení: součin zvětšení objektivu a okuláru • •údaje na objektivu: např. 10x /0,45 (zvětšení objektivu/ numerická apertura NA) • •numerická apertura NA ─› rozlišovací schopnost RS (čím blíže je NA k 1, tím RS větší). U imerzních objektivů je NA i RS vyšší. • NA = n . sin α/2 α …..otvorový úhel, n …..index lomu prostředí Objektivy üsuché: mezi čočkou a preparátem je vzduch üponorné (imerzní): při pozorování ponořeny do tekutiny (voda/olej). Imerzní kapalina má podobný index lomu jako sklo, k odklonu světelných paprsků dochází v menší míře než u světelného mikroskopu a objektiv jich potom zachytí více ü •Zásady práce s imerzním objektivem: ü imerzní tekutina se aplikuje na krycí sklíčko (1 kapka stačí) a objektiv se do této kapky zanoří, mezi preparátem a objektivem nesmí být vzduch. Po ukončení mikroskopování imerzní objektiv očistíme (alkoholether (3:7), alkohol)! üimerzní tekutina se nesmí používat s objektivy, které nejsou imerzní!!! ü Kondenzor üsoustava čoček, soustřeďujících paprsky na preparát ü üzásada: čím silnější objektiv, tím výše je kondenzor ü üv blízkosti kondenzoru: aperturní clona, optimálně otevřená na 80 % numerické apertury použitého objektivu ü üpoužívání clon vyžaduje určitou zkušenost Ekvivalentní obraz, artefakt üobraz fixovaných buněk může být jiný než u živých buněk, ale vlastnosti těchto umělých obrazů mohou být při nezměněné metodě konstantně dobře reprodukovatelné (je možno zpětně určit poměry panující za živa), jde o tzv. ekvivalentní obrazy üartefakt = nereprodukovatelná změna (sraženina barviva, přehyb, trhlina, …) http://www.ihcworld.com/royellis/artefacts/ans6.htm http://www.ihcworld.com/royellis/artefacts/images/6c3.JPG Artefakty https://secure.health.utas.edu.au/intranet/cds/histoten/images/Foreign_artefacts01.jpg https://secure.health.utas.edu.au/intranet/cds/histoten/images/Folds_artefact01.jpg https://secure.health.utas.edu.au/intranet/cds/histoten/images/Proc_artefact01.jpg https://secure.health.utas.edu.au/intranet/cds/histoten/images/Section_artefact01.jpg Řízené studium preparátů Epitely, svaly, pojiva Ve vztahu ke studovaným preparátům prosím věnujte pozornost výkladu vyučující, je návodný pro vypracování protokolu Epitely •souvislá hustá vrstva buněk navzájem těsně sousedících, minimální množství mezibuněčné hmoty, buňky dosedají na tenkou blanku (bazální membránu) • 2_1 üa. jednovrstevný dlaždicový epitel üb. jednovrstevný kubický epitel üc. jednovrstevný válcový (cylindrický) epitel üd. cylindrický víceřadý řasinkový epitel ü e. vícevrstevný kubický epitel ü f. vícevrstevný dlaždicový (nerohovějící) epitel ü g. vícevrstevný dlaždicový (rohovějící) epitel ü h. tzv. přechodný epitel - stěna prázdného dutého orgánu ü i. přechodný epitel (naplněný močový měchýř) Krycí epitel üstudovaný preparát = řez kůží žáby üepidermis: mnohovrstevný epitel žlaznatý nerohovatějící üškára: jedová žláza vlevo (ohraničená granula), dále hlenové žlázy, jde o exoepitelové alveolární mnohobuněčné žlázy üpodkožní vazivo: silná vrstva, zpevňuje kůži (růžově zbarvené) ü zcela dole je relativně volné řidší pojivo upevňující kůži ke skeletu a svalstvu. V něm se nachází příčně rozříznutá céva s jádrem vybavenými erytrocyty. üsilná pigmentace všech kožních útvarů (ochrana funkčních a kmenových buněk). http://www.sci.muni.cz/ptacek/ORGANOLOGIE-a_soubory/image037.jpg •http://www.sci.muni.cz/ptacek/ORGANOLOGIE-a.htm#krycioppoh Pojiva üprostorové tkáně, spojují tkáně v orgány, původ hlavně z mezodermu a z něj odvozeného mezenchymu üepitely mají velmi málo mezibuněčných hmot, u pojiv jsou naopak většinou výrazné üfunkce: strukturální, střádací, ochranná a obranná, výživa, transport, reparace übuňky fixní (fibroblasty/-cyty, osteoblasty/-cyty, …) a volné (makrofágy, lymfocyty, plazmatické buňky, …) ümezibuněčná hmota (matrix): amorfní (různě tuhá) a vláknitá složka (kolagen, elastin, retikulární vlákna) ü Zdroj: http://www.sci.muni.cz/ptacek/HISTOLOGIE2.htm#tukove Pojiva oporná üstudovaný preparát = kompaktní kost: sekundární lamelózní kost, osteoblasty/-cyty, matrix kalcifikovaná, kolagenní vlákna uspořádaná do lamel ükomplex koncentrických lamel obklopujících kanálek s krevními cévami a nervy v řídkém vazivu = Haversův systém = osteon, osteocyty jsou v lakunách. Osteony komunikují s periostem pomocí příčných či šikmých Volkmannových kanálků, které přivádějí cévy z periostu. üdutiny houbovitých kostí a dutiny dlouhých kostí obsahují kostní dřeň: • - červená kostní dřeň (hematopoetická) • - žlutá kostní dřeň (tuk) ü http://www.sci.muni.cz/ptacek/HISTOLOGIE2_soubory/image179.jpg •http://www.sci.muni.cz/ptacek/HISTOLOGIE2.htm#tukove Svaly üprostorové specializované tkáně: kontraktilní systémy (aktin, myosin, dynein u řasinek) a excitovatelné cytoplazmatické membrány (sarkolema), schopné reagovat na nervové stimuly ü obratlovci: hladká, příčně pruhovaná a srdeční svalovina, nespecifický kontraktilní systém (myoepitely) ü hladké svaly: jednotlivé vřetenovité buňky, ve stěně cév a dutých orgánů, v dermis kůže a klcích střeva • - u bezobratlých: pohyb vnitřních orgánů i lokomoce (kontrola CNS), výjimka: např. členovci ükosterní svaly (příčně pruhované): ze soubuní (syncytia): jádra buněk pod sarkoplazmou (u myokardu a hladké sval. jsou centrálně) üstudovaný preparát = myokard (srdeční svalovina): viz dále ü ü http://www.sci.muni.cz/ptacek/HISTOLOGIE2_soubory/image241.jpg http://www.sci.muni.cz/ptacek/HISTOLOGIE2_soubory/image249.jpg Myokard •- studovaný preparát •- v srdci, pulmonárních cévách u některých živočišných druhů •- z kardio(myo)cytů spojených interkalárními disky •- příčné pruhování jako u kosterní svaloviny, ale jádra uložená centrálně •- smršťuje se automaticky (pacemakers: sinoatriální Keith - Flackův a atrioventrikulární Aschoff - Tawarův uzel), převodní systém je tvořen buňkami Purkyňových vláken •- vegetativní nervy jsou schopny ovlivnit frekvenci stahů • Obrázky převzaty z http://clcpages.clcillinois.edu/home/bio567/pages/newtissues/cardiacmuscle.htm a http://www.cvphysiology.com/Arrhythmias/A002.htm C:\Users\Nejezchleb\Desktop\A002%20SAN-AVN.gif Přehled úkolů ünastudujte mikroskopickou stavbu těchto preparátů: • - mnohovrstevný epitel nerohovatějící (řez kůží žáby) - 6 • - kompaktní kost - 18 • - myokard (srdeční svalovina) - 25 ü üdůkladně si osvojte základní postup mikroskopování ü üdetailně se seznamte s obsluhou mikroskopu: http://www.sci.muni.cz/~anatomy/ ü ü domácí úkol: protokol (nelinkovaná A4, teorie + nákresy: max. 2 obr. na 1 A4, kreslíme tužkou, popis propiskou, odevzdejte za týden) •