Moderní laboratorní přístupy v
cytogenetice člověka –
genetické príčiny mentální
retardace
Vladimíra Vallová
Odd. genetiky a molekulární biologie
UEB PřF MU
Odd. lékařské genetiky
FN Brno
Osnova
 Definice a klasifikace mentální retardace (MR)
(Definice a klasifikace vrozených vývojových vad)
 Negenetické příčiny MR
 Genetické příčiny MR
• MR a monogenní dědičnost
• MR a chromozomové aberace
 Vyšetřovací schéma u pacientů s MR
 Array-CGH a NGS při odhalování příčin
MR
Definice mentální retardace (MR)
 mental retardation = intellectual disability (ID) (mental handicap,
mental disability, cognitive impairment, intellectual developmental
disorder)
 charakterizovaná signifikantně podprůměrnými
intelektuálními funkcemi s nástupem před 18 rokem
věku s narušenými schopnostmi přizpůsobit se okolí
 narušené schopnosti u dvou a více z
následujících dovedností: komunikace,
starostlivost o sebe, plnění běžných
domácích úkonů, sociální interakce,
sebeovládání, zdraví a bezpečnost,
práce a zábava, začlenění do
společnosti
 u dětí < 5 let → opoždění vývinu
Klasifikace MR
 založená především na měření IQ
(první pokusy o měření rozumových schopností –
Francis Galton na konci 19. století; moderní IQ testy:
prostorové a verbální dovednosti, paměť)
 subnormalita s poruchami učení (IQ 85-70)
 mírná MR (IQ 50-70)
 střední MR (IQ 35-50)
 těžká MR (IQ 20-35)
 hluboká MR (IQ pod 20)
 neklasifikovatelná
 anglosaská literatura: lehká a těžká (IQ < 50)
MR
Prevalence
 postihuje asi 1-3 % populace
 2,5 % lehký defekt
 0,3 - 0,5 % těžký defekt
 poměr pohlaví 1,3-2M:1F
Zastoupení MR
84%
10%
4% 2%
lehká
střední
těžká
hluboká
Lehká MR
 statisticky významně vyšší
výskyt u socio-ekonomicky
znevýhodněných skupin
 příčina neznámá u 70 % případů
Lehká vs. těžká MR
Těžká MR
 výskyt rovnoměrně bez ohledu
na socio-ekonomický status
 40 % s neznámou příčinou
MR syndromická a nesyndromická
Syndromická (S-ID)
 MR různého stupně (častěji těžká)
 s přidruženou VVV či komplexem VVV,
 viditelná stigmatizace
Nesyndromická (NS-ID)
 MR různého stupně (častěji lehká)
 bez přidružených VVV
 žádná nebo mírná a nespecifická
stigmatizace
 není jen odrazem naší neschopnosti
adekvátně popsat všechny fenotypové
odchylky u raritních případů?
MR s určenou a neurčenou
genetickou příčinou.
Vsuvka:
Vrozené vývojové vady (VVV)
Vrozená vývojová vada (VVV) - kongenitální anomálie
- je morfologická/funkční abnormalita
- je následkem abnormálního prenatálního vývoje
- je přítomná při narození dítěte
- je pro svého nositele potenciálně patologická
• Malformace - abnormální vývoj tkáně/orgánu, vývoj
patologický již od počátku (např. rozštěpové vady)
• Disrupce – abnormální vývoj tkáně/orgánu, vývoj
narušen až v průběhu určitým zevním zásahem
(trauma, infekce, teratogen) (např. deformity po
thalidomidu)
• Deformace - abnormální fyzický zásah (mechanická
síla), který naruší vývoj jinak zdravé tkáně/orgánu
(např. komprese plodu způsobená
oligohydramnionem)
• Dysplázie - abnormální organizace buněk ve
tkáni/orgánu (např. achondroplazie)
Rujiwetpongstorn a
Tongsong, perinatol, 2008
Co vše je vrozená vývojová vada?
• Vrozené vady orgánů (srdce, ledvin, střev, mozku,
míchy, plic, pohlavních orgánů, a dalších)
• Vrozené vady končetin
• Rozštěpy (vrozené rozštěpové vady neurální trubice,
vrozené obličejové rozštěpy, vrozené rozštěpové
vady břišní stěny)
• Syndromy Downův, Edwardsův, Patauův, Turnerův
• Vrozené choroby (fenylketonurie, cystická fibróza,
svalové dystrofie, hematofilie)
Klasifikace VVV
Izolovaná vada
- vada vyskytující se samostatně (izolovaná polydaktylie).
Mnohočetné vady
- napr. součást syndromu Izolované nevýznamné anomálie lze najít
až u 14% novorozenců (Jones, 1997).
http://www.vrozene-vady.cz
 komplexní etiologie; asi u 50-60 % případů nelze zjistit kauzální
příčinu (narušení vývoje mozku)
 negenetické příčiny (prenatální, perinatální, postnatální)
 genetické příčiny (monogenní, chromozomové, multifaktoriální)
Etiologie mentální redardace
Srivastava and Schwartz, 2014
Negenetické příčiny
Chiurazzi et al., 2016
Negenetické příčiny MR
Prenatální období
Fyzikální faktory
RTG záření
• do 10. tt více než 100 mSV – letální efekt
• později více než 100 mSV – PMR, VVV
Ionizující záření (gama záření apod.)
• efekt závisí na délce a intenzitě působení (dávce)
Vysoká teplota (hypertermie)
• prvních 6 tt
• např. sauna – 3x vyšší riziko VVV
• horečka > 38,5 ˚C déle než 48h – SA, IUGR, MR, VVV CNS…
Vyšetření plodu UZV a MR nemá prokázané škodlivé účinky.
Chemické faktory
Chemikálie
• užívané v průmyslu či zemědělství (organická rozpouštědla, barviva, PCB, těžké kovy)
Návykové látky
• Alkohol (Fetální alkoholový syndrom)
• Nikotin (prokázán byl i teratogenní účinek kouření marihuany)
• Jiné drogy (kokain), doping (steroidy)
Léky
• Cytostatika, antiepileptika, antibiotika, warfarin, ACE-inhibitory, i vysoké dávky vit. A
Fetální alkoholový syndrom (FAS)
 incidence 1/1 000 dětí; poškození
nervových buněk alkoholem
 chronické užívání alkoholu (2g/kg/den),
nárazová nadměrná konzumance
 alkohol v těhotenství ¾ žen, 1/3 do 3.
měsíce gravidity
 Růstová retardace plodu (novorozenci
jsou většinou hypotrofičtí, poruchy růstu
často přetrvávají i v dětství, postižené děti
celkově neprospívají)
 Typická kraniofaciální dysmorfie
(různý stupeň mikrocefalie, hypoplastická
maxilla, vyhlazené philtrum, plochá
střední část obličeje)
 Poškození CNS (různý stupeň mentální
retardace, kognitivní poruchy, poruchy
chování)
Negenetické příčiny MR
Negenetické příčiny MR
Prenatální období
Biologické faktory
Infekční agens
TORCH (akronym)
• Toxoplasma gondii
• Ostatní (Treponema pallidum, HIV atd.)
• Rubivirus
• Cytomegalovirus
• Herpesvirus
- ohrožující jsou zejména primoinfekce
Chronické onemocnění matky
• Diabetes mellitus (DM)
• Fenylketonurie (PKU)
• Thyreopatie
• Astma, epilepsie…
Negenetické příčiny MR
Perinatální období
 problémy při porodu - krvácení do mozku, hypoxie
 předčasný porod, nedonošenost
 nízká porodní hmotnost
– předčasný porod, těhotenství mladistvých,
vícečetné porody
- špatná výživa
- může vést až k 40-60% redukci mozkových buněk
Negenetické příčiny MR
Postnatální období
 infekce (černý kašel, neštovice, meningitida)
- můžou způsobit MR, pokud není poskytnuta
adekvátní lékařská péče
 úrazy hlavy
 intoxikace
- toxiny v životním prostředí
- těžké kovy – rtuť, olovo
 špatná výživa
Negenetické příčiny MR
Prevence
Primární prevence – plánované rodičovství
 reprodukce v optimálním věku
 včasná diagnostika léčitelných onemocnění – hypotyreóza
 kompenzace některých onemocnění před početím – diabetes,
astma, epilepsie, hypertenze
 úprava některých onemocnění – např. antikoagulační léčba
 vyvarovat se kontaktu s teratogeny - infekce, očkování,
minimalizovat radiační zátěž
 zdravý způsob výživy s dostatkem vitaminů a stopových prvků
Primární – prevence vzniku choroby
Sekundární – prevence narození postiženého dítěte
(Terciární – prevence komplikací choroby)
Genetické příčiny
Genetické příčiny MR
 MR spojená s monogenní dědičností
 MR podmíněná poruchami chromozomů aneuploidie,
CNVs
 MR podmíněná multifaktoriálně (polygenně)
• MR jako příznak je popisována u ~ 1000 syndromů popsaných v
databázi OMIM…
Monogenní dědičnost
Autosomálně
recesivní
metabolické vady:
 Fenylketonurie
 Smith-Lemli-Opitz sy…
Autosomálně
dominantní
 Tuberózní skleróza
 Costello syndrom
 Cornelia de Lange…
X – vázané
 syndrom fragilního X
 Rettův syndrom
 Coffin-Lowry…
Genetické příčiny MR
… a u několika stovek genů u tzv. nesyndromické MR - AR, AD,
X-vázané
Curated lists of genes involved in ID have been published by some groups. Gilissen et al. created two lists
including 528 genes with a “confirmed” pathogenetic role and 628 “candidate” genes with mutations
reported in fewer than five patients. Another comprehensive list (DDG2P) was prepared to assist the
Deciphering Developmental Disorders Study, including 925 “confirmed” developmental disorder genes
up to November 2013. Yet another list of 565 genes associated with ID (253 “known” and 312
“candidate”) has been reported by Grozeva et al., who used the two previous lists as a starting point.
Chiurazzi et al., 2016
Genetické příčiny MR
Monogenní dědičnost - AD
 Intenzivní studium především v posledních letech
 Pravděpodobný model dědičnosti především u NS-ID
 MBD5 gen (2q23.1), DOCK8 (9p24)…
 Na odhalení AD genů se využívá mapování míst zlomů u
translokací a CNVs spolu se sekvenováním kanditátních genů
Cornelia de Lange sy 1 (CDLS 1)
- OMIM: 122470
- mutace v genu NIPBL (5p13.1) a vykazuje autozomálně dominantní dědičnost.
Charakteristika:
- difúzní svalová hypertrofie
- extrapyramidové poruchy
- psychomotorická retardace
Metabolické poruchy
 AA Aa aa (ztrátové mutace, vadná
funkce proteinu)
 téměř vždy AR, heterozygoti s 50%
reziduální aktivitou alely jsou klinicky
normální
 Všechny patofyziologické důsledky
enzymopatií mohou být připsány akumulaci
substrátu či nedostatku produktu
 Poruchy metabolismu aminokyselin, cukrů,
lipidů, purínů, pyrimidínů aj.
 fenylketonurie, alkaptonurie,
galaktosemie
Genetické příčiny MR
http://sfm.gynpor.cz/kozich.htm
Monogenní dědičnost - AR
Fenylketonurie (PKU)
 první důkaz genetického defektu jako příčiny
mentálních retardací (Fohling, 1934)
 porucha metabolismu fenylalaninu způsobená
mutacemi v genu pro fenylalaninhydroxylázu
(PAH) – přeměna fenylalaninu na tyrozin
 1/7-10 000 živě narozených dětí
 u pacientů s PKU dochází k hromadění
toxického fenylpyruvátu v organizmu – neléčené
onemocnění vede k poškození vyvíjejícího se
mozku
 fenotyp: mírná stigmatizace, světlé vlasy, modré
oči
 léčba: speciální dieta s omezeným množstvím
fenylalaninu
 nedodržování diety v graviditě může vést k
hyperfenylalaninémii a následnému poškození
plodu
• 400 různých mutantních alel
• 6 z nich - 80 % mutací
Monogenní dědičnost – X-vázané
Genetické příčiny MR
Asi nejlépe zmapovaný typ dědičnosti
– díky hemizygozitě u XR dědičnosti
 incidence 1: 4000 chlapců, 1:7000 dívek
 mentální postižení (IQ 20-60)
 ženy - méně postižené, ale 25% má MR IQ<70,
většina 75-90
 X-vázaný dominantní přenos
 velká hlava, dlouhý obličej, prominující čelo a
brada, velké uši, nízký svalový tonus
 některé rysy autistického chování –
nedostatečný oční kontakt, mávání rukama,
úzkostná porucha
 těžké opoždění vývoje řeči a jazykových
dovedností
Syndrom fragilního X
 gen FMR1; Xq27.3
 příčina: zmnožení repetice CGG
 6 – 54 opakování - zdraví
 52 – 200 opakování - premutace
 nad 200 - plná mutace
 efekt ANTICIPACE
Genetické příčiny MR
Geny spojené s MR se podílejí na
různých procesech v buňce
 Synaptické proteiny
 Synaptické vezikuly pro
vnitrobuněčnou a
mimobuněčnou komunikaci
 Proteiny asociované s
membránou
 Signální dráhy
- Rho GTPázy
- ERK/MAPK signální dráha
 Regulace transkripce
- proteíny s motivy zinkových prstů
 Proteiny metabolických procesů
 Degradace proteínů
 Remodelace chromatinu
Kaufman et al., 2010
Monogenní dědičnost – možnost léčby?
Genetické příčiny MR
U monogenně podmíněné MR
• možnost genové terapie
- např. MECP2 (Rett sy) – zavedení genu u MECP2 null myší
• exon skipping
– využitím antisense oligonukleotidů anebo siRNA
• aminoglykosidy
- zprostředkované potlačení non-sense mutace
Chromozomové aberace
Genetické příčiny MR
 Početní změny chromozomů (aneuploidie) – 50 %
 Strukturní změny chromozomů:
 (mikro)delece/(mikro)duplikace - 10 %
 translokace, komplexní přestavby
 subtelomerické přestavby - 7 %
Komplexní chromozomové přestavby
 vrozené komplexní přestavby se vyskytují zřídka
 jsou charakterizovány 3 nebo více zlomy
lokalizovanými na dvou nebo více chromozomech
 možná asociace s
- mentální retardací
- vrozenými anomáliemi
- opakovanými spontánními aborty
46,XY,t(1;14),(p34;q24),t(4;6)(q25;p23)pat
Syndrom kočičího křiku (Cri du chat)
 1 : 50 000
 delece 5p, kritická oblast 5p15
 10 – 15 % potomci přenašečů
translokace
 typický křik novorozence -
laryngomalacie
 mikrocefálie, kulatý obličej PMR,
srdeční vady, mikrognátie, hypotonie
Jerome LeJeune, 1963
http://www.youtube.com/watch?v=TYQrzFABQHQ
Genetické příčiny MR – CHA
Submikroskopické přestavby
– mikrodelece a mikroduplikace - CNVs
Genetické příčiny MR – CHA
 skupina geneticky
podmíněných chorob, jejichž
příčinou jsou drobné delece
DNA segmentů, které nejsou
detekovatelné klasickými
cytogenetickými metodami
 pacienti mají specifické
klinické příznaky
 častý výskyt MR
Nejznámější mikrodeleční syndromy
Jakou úlohu hraje architektura lidského genomu při
vzniku submikroskopických přestaveb?
Náhodné (non-recurrent) přestavby
- nacházené u jednotlivců
- liší se velikostí a místy zlomu na chrom.
- můžou vznikat několika různými
mechanizmy – např. nehomologním
spájením konců (NHEJ)
Opakovaně se vyskytující (recurrent)
- nacházené u vícero pacientů
- stejná velikost a stejné místa zlomů na
chromozomech
- vznikají díky specifické architektuře
genomu
 důležitou úlohu hrají segmentální
duplikace (SD) (opakovaní s nízkým
počtem kopií)
 bloky DNA (1-500 kb), z více než 95% sekvenčně podobné,
lokalizovány v různých oblastech genomu
Vznik mikrodelecí/mikroduplikací nealelická
homologní rekombinace (NAHR)
Díky velikosti a sekvenční homologii, mohou být SD příčinou
přestaveb díky nealelické homologní rekombinaci.
Rekombinanční hotspots
- preferenční místa rekombinace
- oblast v rámci SD mající 100% sekvenční homologii (1-3 oblasti, o
velikosti 300 bp - >2kb)
- nalezeny pro několik známých syndromů (Williams-Beuren, SmithMagenis,
Sotos sy, atd.)
- ovlivňuje rekombinaci polymorfizmus v počtu kopií SD bloků u
rodičů?
Nealelická homologní rekombinace
(NAHR) – inverze
-další rys lidského genomu, který hraje důležitou roli při vzniku
chromozomových přestaveb
- např. Williams-Beuren, Angelman sy – rodiče přenašeči mají inverzi
zahrnující deletovanou oblast
- inverze může způsobovat NAHR
Nová mikrodelece 17q21.31
Nově objevené
mikrodeleční/mikroduplikační
syndromy
Genetics of Mental Retardation, 2010, Editor: S.J.L.Knight
Telomery
 ochrana konců chromozomů před působením
exonukleáz
 párování homologních chromozomů v meióze
 udržují architekturu interfázního jádra
 replikace konců lineární DNA (telomeráza)
 stárnutí buněk – zkracování
délky telomer
 pokud chybí→ přestavby
chromozomů (např. translokace,
fúze, kruhové či nestabilní
dicentrické chromozomy)
Subtelomerické přestavby
Klinický význam přestaveb telomer
 subtelomerické oblasti na chromozomech – největší hustota genů v
genomu
 aberace v této oblasti - příčina spontánních abortů, VVV a MR
 většinou neexistuje výrazná korelace genotyp-fenotyp
 jsou však i specifické syndromy:
 delece 1p36 (Slavotinek)
 delece 9q34
 delece 22q13 (Phelan-McDermid)
Jak hledat příčinu u pacientů s MR (a/nebo VVV)?
?
Proč hledat příčinu MR?
 Umožní určit prognózu (především u malých dětí) stanovení
vhodných vyšetření – snížení neefektivních testů
 Umožní stanovit vhodný plán péče a léčbu
 Umožní stanovit riziko pro postiženou rodinu a podklady
pro genetické poradenství
přenašeč der(14;21) – teoretické riziko postižení dítěte D.S. 33 %
populační studie – 10 až 15 %
Co by jste jim jako genetici řekli?
?
Postupy při vyšetřování příčin MR
Klinická část:
 genealogická analýza – solitární výskyt vs. suspektní X-vázané,
AR, AD onemocnění, nemendelovský výskyt onemocnění
 osobní analýza – hledání možných příčin MR – od prenatálních po
postnatální vlivy
 fyzické zhodnocení - zhodnocení fenotypu, přidružených VVV,
dalších anamnestických dat
Klinická diagnóza
Postupy při vyšetřování příčin MR
Laboratorní část:
„Cílené“ genetické vyšetření
 při klinickém podezření na konkrétní jednotku
 karyotypizace, cílené vyšetření mikrodelečních syndromů (FISH,
MLPA), cílené molekulárně-genetické vyšetření, FRAX
„Necílené“ genetické vyšetření
 karyotypizace, necílená detekce submikroskopických přestaveb
(MLPA), array-CGH, NGS
Specializovaná vyšetření:
 Vyšetření metabolických vad
 Zobrazovací vyšetření a antropologické vyšetření
 Další odborná vyšetření Konečná diagnóza
Postupy při vyšetřování příčin MR
Metody při vyšetřování příčin MR
• Metafázní cytogenetika
● Interfázní cytogenetika
FISH
● Cytogenetika založená na izolaci DNA
Mikročipové technologie
MLPA
SKY
NGS
 FraX (záchyt 1-2%)
 Karyotyp (balancované přestavby?)
 FISH – cílené vyšetření, ověřování nálezů z MLPA a aCGH,
mozaiky
 MLPA – skrínink subtelomerických přestaveb a známých
mikrodelečních/duplikačních syndromů, detekce delecí/duplikací v
známých genech (MECP2, DMD)u vybraných pacientů
Metody při vyšetřování příčin MR
aCGH – celogenomový
skrínink u vybraných
pacientů (10-15%)
 NGS – celogenomový
(exomový) skrínink
Vissers et al., 2015
1970s - conventional karyotyping.
1990s - Sanger sequencing and FISH (+6–10%)
Beginning of this century - genomic microarrays (+15–23%).
2010 – WES (+24–33%)
2014- WGS (+26%),
An overall diagnostic yield of 55–70% for moderate to severe ID.
Molekulární karyotypování – 1000x
citlivější než klasická cytogenetika
Moderní metody analýzy genomu:
DNA čipy
 princip: hybridizace značené vyšetřované DNA s
imobilizovanými sondami na čipu
 sondy: jednotlivé molekuly DNA o známé sekvenci,
které jsou upevněny ve shlucích (spoty) na pevném
podkladu (sklo, mikrokuličky…)
 počet spotů: od řádově stovek do milionů podle typu
čipů
 historie: Southern blot (polovina 70. let), skutečné
mikročipy - polovina 90. let 20.st., pak masivní rozvoj a
vývoj různých adaptací a variací; komerční trh
Array-CGH: detekce zisků a ztrát na úrovni DNA
SNP-arrays: oblasti ztráty heterozygotnosti (AOH)
Typy DNA čipů
Zdroje cílových DNA
Agilent ISCA CGH+SNP Microarray
CGH probes
SNP probes
60K SNP probes ~5-10 Mb LOH
Agilent Human CGH Microarray
Vyhodnocování array-CGH
aCGH Analytics Software, Agilent Technologies
Princip hodnocení array-CGH dat
Hodnotíme rozdíl mezi intenzitou fluo signálu mezi
vzorkem DNA a referencí vyjádřený jako log2X(= vzorek
/ reference). Data jsou lehce komprimovaná kvůli
biologické variabilitě vzorku
Porovnání záchytu chrom. aberací
pomocí HR-CGH a oligonukleotidových
čipů – různý formát
Pacient s del(1)(p36), ~ 3,2 MB
HR-CGH
negativní
8x15K
negativní
4x44K
del(1)(p36)
2x105K
del(1)(p36)
Human CGH Microarray, Agilent Technologies, CGH Analytics 3.5, Aberration algorithm: ADM-1, Treshold: 6.0, Genome: hg18
Karyotyp
normální
Výhody a nevýhody array-CGH
Advantages of array-CGH
• Ability to analyze DNA from nearly
any tissue, including archived tissue or
tissue that cannot be cultured.
• Detection of abnormalities that are
cytogenetically cryptic by standard
G-banded chromosome analysis.
• Better definition and
characterization of abnormalities
detected by a standard chromosome
study.
• Ability to customize the platform to
concentrate probes in areas of interest.
• A ready interface of the data with
genome browsers and databases.
Limitations of array-CGH
• The inability to detect genetic events
that do not affect the relative copy
number of DNA sequences, e.g.,
molecularly balanced chromosomal
rearrangements.
• Low-level mosaicism for unbalanced
rearrangements and aneuploidy may not
be detected.
• Ploidy levels may be difficult to detect.
• Copy number variations (CNVs) of
genomic regions not represented on the
platform will not be detected.
• Current array-CGHs are not designed to
detect duplications and deletions below
the level of detection according to
probe coverage and performance, point
mutations, gene expression, and
methylation anomalies that may
contribute to the patient’s phenotype.Genetics in Medicine volume15, pages901–909 (2013)
Význam array-CGH u pacientů s MR
Záchyt CNVs pomocí array CGH u
pacientů s MR/VVV závisí na:
 typu čipu, rozlišení
 pokrytí známých syndromů
 kritériích výběru pacientů
Buysse et al., 2009
Literární údaje: 4 až 28 %
• hledání příčin u pacientů s MR, VVV, dysmorfickými črtami a normálním
anebo zdanlivě balancovaným karyotypem
• definování a upřesnění mikrodelečních/mikroduplikačních syndromů
• původ nadbytečného materiálu, marker chromozomů …
Doporučená kritéria určená pro klinickou
preselekci pacientů s MR (de Vries et al. 2001)
Výskyt MR v rodině 1
Prenatální růstová retardace 2
Postnatální růstové abnormality 2
Mikrocefalie, krátké končetiny,
Makrocefalie, dlouhé končetiny
po 1 bodu
(max.2)
Faciální dysmorfie – dva a více příznaků, zejména
hypertelorismus, anomalie nosu, uší
2
Jiné vrozené abnormality, zejména srdeční vady,
hypospadie
po 1 bodu
(max.2)
skóre ≥ 3, senzitivita = 1.00, specificita = 0. 27
• se stále se zvyšujícím rozlišením je
stále obtížnější nalézt hranici mezi
benigními (polymorfními) a
patogeními CNVs
• získat data je snadné
• interpretovat výsledek je obtížné
• existuje normální karyotyp?
Array-CGH a variabilita v počtu kopií (CNVs)
Array-CGH a CNVs
• doposud detekováno 29 133 CNV
• 12 % lidského genomu obsahuje CNV
• 0,12 – 7,3 % rozdíly v CNV mezi jedinci
• 41 % všech CNV pokrývá geny
CNV patogenní x benigní
CNV nejasného významu
CNVs – segmenty DNA větší
než 1 kb přítomné ve
variabilním počtu kopií v
porovnání s referenčním
genomem
Global variation in copy number in the human genome
Richard Redon et al.: Nature. 2006 November 23; 444(7118): 444–454.
Buysse et al., 2009
Interpretace CNV nalezených pomocí array-CGH
v klinické genetice – rozhodovací kriteria
Buysse et al. (2009)
Používaný algoritmus vyšetření
pomocí aCGH
Vždy v kontextu
• s fenotypem pacienta
• s vyšetřením rodičů
• s databázemi
Interpretace array CGH
Moderní metody analýzy genomu:
NGS
• zavedeno do genetických laboratoří asi před 10 lety
• dnes široce využívána metoda, která nahrazuje (nahradila) klasické
sekvenování
Tradiční sekvenování vs. NGS
96 DNA fragmentů
sekvenováno zároveň
Milión DNA fragmentů
sekvenováno zároveň
Prof. J. Veltman,
Newcastle Univerzity, 2018
Využití NGS
Výzkum
• objevování nových genů asociovaných s lidskými nemocemi
• odhalování molekulárního podkladu komplexních nemocí
Diagnostika
• v posledních letech široké využití i v klinické laboratoři
• krátká doba odezvy a snižující se náklady
• dědičné nemoci, infekční nemoci, nemoci imunitního systému, neinvazivní
prenatální diagnostika i onkologické onemocnění
Prof. J. Veltman, Newcastle
Univerzity, 2018
Number of publications in PubMed using the search terms “next-generation sequencing,” “autism spectrum
disorder” (ASD), “intellectual disability” (ID), “epileptic encephalopathy” (EE), “schizophrenia” (SCZ), and “bipolar
disorder” (BD) annually since 2009
Cold Spring Harb Perspect Med. 2017 Mar;7(3):a026864.
Výzkum
• objevování nových genů asociovaných s MR
• Příklad: Schinzel-Giedion syndrom
• Zřídkavé sporadické onemocnění, bez rodinné historie
Variants Patient with SGS
Genes with
variants in other
SGS patients
Variants in genes 12,196 3,331
Variants affecting
protein
5,556 1,634
Variants not in
normal population
180
1
Additional proof: Healthy parents do not carry the mutation!Schinzel & Giedion. Am J Med
Genet 1978
Hoischen et al. Nat Genet 2010
NGS a MR
De novo mutace u pacientů s MR
Vissers et al. Nature Genetics
2010; de Ligt et al.NEJM 2012
Diagnostic exome sequencing
in 100 ID trios
De novo mutations in 10 novel candidate ID genes
Lelieveld et al. Nature Neuroscience 2016
Diagnostika
MR – velké množství genů, široké spektrum fenotypových projevů
NGS
• umožňuje testovat velký počet genů zároveň – finančně výhodné
• „všechny“ varianty v jednom experimentu
MR
Nádorové
onemocnění
Prof. J. Veltman, Newcastle
Univerzity, 2018
NGS a MR
Patient
Father
Mother
De novo duplication on chr 4
Duplication in chr X
Duplication disturbs
IQSEC2 gene
Prof. J. Veltman, Newcastle
Univerzity, 2018
• Panel genů
• Celoexomové sekvenování (WES)
• Celogenomové sekvenování (WGS)
DiResta et al., 2018
Jakou strategii NGS testování vybrat?
Targeted panel WES (60× coverage) WGS (60× coverage)
Relative costs compared with
WES (2015)
Depends on size of gene
panel
1 ∼3× as expensive as WES
Gene panel coverage 100%, when complemented
with Sanger sequencing
97.5% >97.5%
Analysis of new disease
genes
– + +
CNV‐calling Depends on size of gene
panel
>3 exons All
Intronic variants (>30 bp from
splice site)
– – +
Incidental findings – + +
Comparison of Targeted Panels, WES, and WGS Sun et al., 2015
WES
37% of exomes to diagnose
intellectual disability (ID)
Prof. J. Veltman, Newcastle
Univerzity, 2018
Number of hits or publications per year in Google Scholar broken
down into sequencing strategy, using the search terms
“intellectual disability” + “whole-exome sequencing” (labeled
WES), “intellectual disability” + “whole-genome sequencing”
(labeled WGS), “intellectual disability” + “targeted sequencing”
(labeled “Targeted sequencing”), “intellectual disability” +
“somatic mutations” (labeled “Somatic mutations”), and
“intellectual disability” + “X-linked” + “sequencing” (labeled “X-
linked”).
Cold Spring Harb Perspect Med. 2017 Mar;7(3):a026864.
Normal start site
De novo mutation in 5’UTR of SLC2A1! :
NM_006516.2:c.-107G>A
Chr1(GRCh37):g.43424429C>T
p.?
exon2exon1
Mutation introduces a novel ATG start site, which
would lead to a premature stop codon in exon 2:
mutation
wildtype
Willemsen et al. EJHG 2017
WGS – nekódující mutace
Prof. J. Veltman, Newcastle
Univerzity, 2018
Problémy NGS v klinické praxi
Variant
type
Variants in
Genome
Variants in
Exome
SNV 3,440,782 21,575
Insertion 263,282 272
Deletion 272,266 242
Deletion/Ins
ertion
90,263 380
CNVs 270 45
Total 4,066,863 22,514
• Získaní relevantních dat – zkušení bioinformatici
• Interpretace získaných dat – co se všemi těmi variantami?
Nature Genetics volume42, pages1109–1112 (2010)
Kritéria hodnocení nálezů stanovena podle „American college of medical
genetics and genomics“ (ACMG)
a. disease causing (class V): the sequence variation is previously reported and
recognized as causative of the disorder
b. likely disease causing (class IV): the sequence variation is not previously
reported as expected to cause the disorder, frequently in a known disease gene
c. variant of unknown clinical significance (VUS; class III): the sequence
variation is unknown or expected to be causative of disease and is found to be
connected with a clinical presentation;
d. likely not disease causing (class II): the sequence variation is not previously
reported and it is probably not causative of the pathology;
e. not disease causing (class I): the sequence variation is already reported and
documented as neutral variant.
Interpretace nalezených variant
Interpretace založena na klinických nálezech, populačních
frekvencích, publikovaných případech, predikčních databázích
Vyšetřování „trií“ – pacient + rodiče
Use trio-approach to filter
for de novo mutations
Prof. J. Veltman,
Newcastle Univerzity, 2018
a
Patient
reads
Mother
reads
Father
reads
4 million inherited variants, 100 new mutations per person
Predikční programy, populační studie
Kircher et al. Nat Genet 2014; Lelieveld, Veltman & Gilissen. Hum Genet 2016
Nature 2016; Nucleic Acids Research 2017
Databáze
http://www.matchmakerexchange.org/ Prof. J. Veltman,
Newcastle Univerzity, 2018
WES/WGS jako vynikající nástroj pro odhalování
příčin MR
vs. vedlejší (nechtěné) nálezy
Gilissen et al. Nature 2014
According to the European Society of Human
Genetics (ESHG) guidelines, the targeted
diagnostic testing should be performed
minimizing the likelihood of detecting
incidental findings, focusing only on genes
clinically actionable.
It means that genetic testing should aim to
analyze the causative genes associated to the
primary clinical questions, even if a broader
panel of genes or the WES/WGS sequencing
has been performed.
DiResta et al., 2018
In particular, if it can bring minor consequences or if a clinical
intervention is possible, then the variant should be reported.
On the contrary, if the variant is associated to a late onset
disorder or has major consequences, counselling and consent
will determine if and when the variant can and should be
reported to the patient.
Genetické přesahy u pacientů s MR
a autismem
• MR a ASD – dvě diagnózy s
výrazným přesahem
• Autismus – problémy s řečí, sociální
a stereotypy
- Vyskytují se i u pacientů s MR
- Naopak až 67 % pacientů s
autizmem má nějakou formu MR
Mnoho genů je asociováno jak s
MR tak s ASD
Častá neúplná penetrance těchto
genů
 etiologie mentální retardace je stále nedořešený problém a
představuje výzvu nejen pro genetické poradenství
 množství příčin způsobujících MR svědčí o komplexnosti lidské
inteligence - je proto poměrně snadné její vývoj poškodit
geneticky i negeneticky
 se vzrůstajícím rozlišením moderních metod prudce roste počet
nalezených variant
 moderní technologie „předběhly“ naše klinické znalosti, často
tedy nejsme schopni získané výsledky správně interpretovat
 pouze v případě prokázané asociace je možno poskytnout
rodině cílené genetické poradenství
Závěr
DĚKUJI ZA POZORNOST