Kapitola II.2.2
Vznik a charakter dat -> Affymetrix
čipy
Výuka IBA
Anatomie GeneChipu® I.
Anatomie GeneChipu® II.
 Sondy = oligonukleotidy, jednořetězcové, délky 25 bp
(AGCATGACTAG……)
 Každý gen reprezentovaný sadou 11-20 párů sond (probeset)
 Každý pár sond se skládá z Perfect Match (PM) a Mismatch (MM) sondy
 PM je perfektní komplementární sekvenece genu
 MM – jako PM, kromě prostřední (13té) báze
 MM je interní kontrola, měřící nespecifické vazby
Skenování a analýza obrazu Affymetrix
 U jednokanálových oligonukleotidových mikročipů je použita pouze
jedna vlnová délka a pomocí UV skeneru je vytvořený jen jeden
obraz
 U Affymetrix mikročipů je tento obraz ve formátu DAT, a je
zpracovaný v software firmy Affymetrix
 Po nasazení mřížky pro identifikaci čtvercových spotů, jsou
obvodové pixely každého spotu vyřazeny z těchto důvodu:
• - tyto s největší pravěpodobností můžou patřit jinému spotu
vzhledem k možnosti špatného nasazení mřížky
• - signál na obvodu bývá nejslabší
• Z pixelů, které jsou zařazeny je signál odhadnut jako 75%
kvantil – tato informace/kvantifikace je uložena v .CEL souboru
• Mapování sond na sady sond je uloženo v souboru s
příponou .CDF
Affymetrix vs cDNA
 Vzhledem k odlišnému kontextu sond, odlišné úpravy dat než u
cDNA
 11-20 sond na gen - nutná sumarizace, je potřebná jediná
hodnota reprezentující gen!
 Rozlišujeme dvě úrovně základních datových matic – úroveň
sondy (anglicky probe level) a úroveň sady sond (anglicky
probeset level)
Kontrola kvality a normalizace
 Jen jeden kanál => většina kontroly kvality a normalizace
se vykonává vzhledem k ostatním čipům v experimentu
 Některé nástroje kontroly kvality využívají statistiky, které
jsou výsledkem modelování normalizovaných intenzit
sond
 Kontrolu kvality a normalizaci proto nebudeme dělit na
uvnitř čipu a mezi čipy, jako u dvoukanálových cDNA
experimentů, ale na kontrolu sond a kontrolu a
normalizaci celých mikročipů.
AffyBatch
 třída pro uskladnění a analýzu Affymetrix GeneChip dat v
Bioconductoru
 Tvoří se s pomocí read.affybatch() nebo ReadAffy()
 Sloty: cdfName, nrow, ncol, assayData, phenoData,
annotation, protocolData, featureData, experimentData
Příkladová data pro ilustraci
 Zde si načteme další datový soubor, na kterém budeme
demonstrovat kontrolu kvality. Jedná se o data akutní
lymfoblastické leukemie (Ross a kol., 2004). Soubor je součastí
balíku ALLMLL a již je ve formátu AffyBatch.
install.packages(ALLMLL)
library(ALLMLL)
data(MLL.B)
 Pro ilustraci z dat vybereme pouze osm mikročipů a jejich
názvy změníme na čísla.
Data = MLL.B[,c(1:7,14)]
sampleNames(Data) = c(1:7,14)
Kontrola kvality na úrovni sady sond I
 Najčastejší v případě, pokud potřebujeme vědět, zda je
určitá sada sond funkční ve smyslu správné reprezentace
cílové sekvence.
pm(Data,"240060_at")
par(mfrow=c(1,2))
matplot(pm(Data,"240060_at"), type="l", ylab="PM intensita
sondy", xlab="Sada sond 240060_at", las=1, main="PM")
matplot(mm(Data,"240060_at"), type="l", ylab="MM intensita
sondy", xlab="Sada sond 240060_at", las=1, main="MM")
Kontrola kvality na úrovni sady sond II
 Efekt dávky, gen ESR1, data karcinom kolorekta
 Porovnání ESR1 MM a PM intenzit u ER+ a ER- karcinomu prsu
ER+
ERDávka
1
Dávka 2
Kontrola kvality na úrovni mikročipu
Rozlišujeme 3 hlavní způsoby kontroly kvality na úrovni
mikročipu:
Kontrola kvality na základě parametrů Affymetrix
Kontrola kvality s pomocí základních diagnostických grafů
Kontrola kvality na základě modelu úrovně sondy (PLM – probe
level model)
Efekt barviva není problémem, protože máme pouze jeden kanál.
Kontrola kvality na úrovni mikročipu
Rozlišujeme 3 hlavní způsoby kontroly kvality na úrovni
mikročipu:
Kontrola kvality na základě parametrů Affymetrix
Kontrola kvality s pomocí základních diagnostických grafů
Kontrola kvality na základě modelu úrovně sondy (PLM – probe
level model)
Efekt barviva není problémem, protože máme pouze jeden kanál.
Kontrola kvality na základě
parametrů Affymetrix
Affymetrix vydal sadu odporúčaní k analýze dát GeneChip
mikročipu ”GeneChip® Expression Analysis Data Analysis
Fundamentals”
http:
//media.affymetrix.com/support/downloads/manuals/data_analysi
s_fundamentals_manual.pdf
Kontrola kvality na základě
parametrů Affymetrix I
Balík simpleaffy implementuje základní funkce, které počítají
sumarizace parametrů kvality Affymetrix GeneChip mikročipu
library(simpleaffy)
Data.qc = qc(Data) #funkce qc()
Podle návodu Affymetrixu by průměrné hodnoty pozadí měly
být porovnatelné (a mezi 20 a 100)
> avbg(Data.qc)
1 2 3 4 5 6 7 14
67.34494 68.18425 42.12819 61.31731 53.64844 49.39112 75.14030
128.41264
 Škálové faktory by se neměly lišit více než trojnásobně mezi čipy:
> sfs(Data.qc)
4.905489 9.765986 10.489529 7.053323 7.561613 13.531238 3.394921
2.475224
Kontrola kvality na základě
parametrů Affymetrix II
 Procento nalezených (present) sond by mělo být
porovnatelné, přičemž extrémně nízké hodnoty jsou znakem
nízké kvality. V našem případě je na tom nejhůř čip 6.
> percent.present(Data.qc)
1.present 2.present 3.present 4.present 5.present 6.present 7.present
14.present 26.53124 21.65158 25.58181 23.53279 23.35615 17.96423
25.98808 25.25061
 Nakonec, 3’/5’ poměry interních kontrolních genů (beta
actin a GADPH) by neměly překročit hranici tří, v našem
příkladu tedy nenalézáme problém s degradací RNA.
> ratios(Data.qc)
Kontrola kvality na úrovni mikročipu
Rozlišujeme 3 hlavní způsoby kontroly kvality na úrovni
mikročipu:
Kontrola kvality na základě parametrů Affymetrix
Kontrola kvality s pomocí základních diagnostických grafů
Kontrola kvality na základě modelu úrovně sondy (PLM – probe
level model)
Efekt barviva není problémem, protože máme pouze jeden kanál.
Kontrola kvality na základě
základních diagnostických grafů I
 Krabicové grafy a hustoty rozložení logaritmovaných hodnot
intensit sond u všech mikročipů
par(mfrow=c(1,2))
boxplot(Data, las=1, ylab="log intensity")
hist(Data, las=1, col=c(1:8), lty=1)
legend("topright",col=c(1:8), lty=1, legend=c(1:7,14))
X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X14
6
8
10
12
14
logintensity
6 8 10 12 14
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
log intensity
density
1
2
3
4
5
6
7
14
Kontrola kvality na základě
základních diagnostických grafů II
 Podobně jako u cDNA mikročipů, i u oligonukleotidových čipů
může dojít k prostorovému efektu nerovnoměrné hybridizace,
která se pak také odhaluje pomocí heatmapy virtuálně
zrekonstruovaného mikročipu
par(mfrow=c(1,2))
hist(Data[,2], las=1, col=2, lty=1)
image(Data[,2])
Kontrola kvality na základě
základních diagnostických grafů III
 Jako další lze podobně jako u cDNA čipů vykreslit MA graf
 M a A hodnoty se buď počítají mezi dvěma mikročipy, nebo úlohu
referenčního kanálu zastoupí referenční pseudo-mikročip (medián)
windows(12,7)
par(mfrow=c(2,4), mar=c(2,2,3,1))
MAplot(Data, cex=0.75, las=1)
mtext("M", 2, outer=T, line=-1.5, las=1)
mtext("A", 1, line=2, at=-6)
Kontrola kvality na základě
modelu úrovně sondy (PLM – probe level model) I.
PLMres <- fitPLM(Data)
Kontrola kvality na základě
modelu úrovně sondy (PLM – probe level model) II.
Jak kvantifikovat kvalitu?
Kontrola kvality na základě
modelu úrovně sondy (PLM – probe level model) III.
 Relative Log Expression (RLE)
 Normalized Unscaled Standard Error (NUSE)
kde gi predstavuje intenzitu genu g na sklíčku i a mg medián
genu i počítaný přes všechny sklíčka
 Počítané pro každý gen, mohou se využít jako kontrola kvality
sond aj sklíček
Kontrola kvality na základě
modelu úrovně sondy (PLM – probe level model) IV.
 Pokud vzhledem k druhu experimentu a mikročipu můžeme
očekávat, že platí předpoklad o nezměněné expresi většiny
transkriptů, můžeme odstranit čip jako nekvalitní, pokud má
výrazně posunuté RLE hodnoty mimo 0, a NUSE hodnoty nad 1
(>1.02)
> nuse.stat = nuse(PLMres, type="stats")
> W = nuse.stat["median",]<1.02
> W
1 2 3 4 5 6 7 14
TRUE FALSE TRUE TRUE TRUE TRUE TRUE TRUE
> Data.clean = Data[,W]
Funkce Mbox vykreslí krabicové grafy RLE hodnoty pro všechny čipy a
funkce NUSE vykreslí krabicové grafy hodnot NUSE :
> Mbox(PLMres, main="RLE", las=1)
> NUSE(PLMres, ylim=c(0.9,2), las=1, main="NUSE")
 
Normalizace a sumarizace
 Mnoho metod pro úpravy dat oligonukleotidových mikročipů
představuje algoritmy, které provedou komplexní normalizaci a
sumarizaci dat.
 V případě, že tyto metody poprvé představily některou
z metod, na tuto metodu se pak odkazuje jménem algoritmu.
 2 nejznámější algoritmy
 MAS 5.0 (Microarray Suite 5.0)
 http://www.affymetrix.com/products/software/specific/ma
s.affx
 RMA (log scale Robust Multi-array Analysis)
 Methods for Affymetrix Oligonucleotide Arrays R package
 http://www.bioconductor.org
MAS 5.0 algoritmus
RMA algoritmus
 Robust Multichip Average:
1. Odpočet hodnoty pozadia (odhadnutá zo všetkých MM)
2. Kvantilová normalizace
3. Sumarizace
 Používá už všechny microarray sklíčka, počítá jen s PM hodnotami,
všechny MM používá na odhad pozadí
> Data.bg.rma = bg.correct(Data, method="rma")
Normalizace mezi mikročipy
 Podobně jako u cDNA mikročipů hlavně:
 Centrování mediánem
 Loess
 Kvantilová normalizace
 Funkce normalize implementuje několik normalizačních metod.
Centrování průměrem:
> Data.norm.scale = normalize(Data, method="constant")
Kvantilová normalizace:
> Data.norm.quant = normalize(Data, method="quantiles")
Cyklická loess:
> Data.norm.loess = normalize(Data, method="loess")
Také funkce threestep balíku affyPLM implementuje několik druhů
normalizace. Jak již bylo řečeno výše, tato funkce vrací již
sumarizované hodnoty.
Příklad 2
 Načteme knihovnu affy pro základní práci s Affymetrix
GeneChip daty:
library(affy)
 Vytvoření datové struktury AffyBatch budeme demonstrovat
na příkladu mikročipů z experimentu porovnávajícího ER
(estrogen receptor) pozitivní a ER negativní karcinomy prsu.
 Pomocí funkce ReadAffy načteme základní datové matice (CEL
soubory) našeho příkladu do datové struktury AffyBatch.
breast = ReadAffy(celfile.path="Raw/")
Názvy čipů upravíme, odstraníme koncovku ".CEL":
ns = length(sampleNames(breast))
nm = unlist(strsplit(sampleNames(breast), split=".",
fixed=TRUE))[seq(1,2*ns,2)]
sampleNames(breast) = nm
Gén
mRNA vzorky
M hodnota genu i vzorku j
M =
Log2(Cy5 / Cy3) – cDNA arrays
Funkce(PM, MM) z MAS, dchip nebo RMA
vzorek1 vzorek2 vzorek3 vzorek4 vzorek5 …
1 0.46 0.30 0.80 1.51 0.90 ...
2 -0.10 0.49 0.24 0.06 0.46 ...
3 0.15 0.74 0.04 0.10 0.20 ...
4 -0.45 -1.03 -0.79 -0.56 -0.32 ...
5 -0.06 1.06 1.35 1.09 -1.09 ...
Konečná podoba dat