Next-generation sequencing (NGS) Sanger sequencing TTCAGTCAGATTTACGCTAACCCT Rev. Primer - F Primer - R Primer - F - AAGTC=O Primer - F - AAGTCAGTCTA=O Primer - F - AAGTCAGTCTAA=O Primer - F - AAGTCA=O Primer - F - AAGTCAGTCT=O Primer - F - AAGTCAGTC=O Primer - F - AAGTCAGT=O Primer - F - AAGTCAG=O - + Fig1 AAGTCAGTCTAAATGCGATTGGGA Primer - F Rev. Primer - R krátké -------------- dlouhé (rychlé) ------------ (pomalé) Sequencing – Sangerova metoda Fig1 DNA PCR product cloned fragment - + laser beam detector capillary electrophoresis G C G A G C T Sanger tools_1a 4-kapilární sekvenátor = 96 x 500 bp/12 hodin = cca 100 000 bp/den Evoluce Sangerova sekvenování Sequencing – Sangerova metoda Fig1 DNA PCR product cloned fragment - + laser beam detector capillary electrophoresis G C G A G C T Sanger tools_1a 96-kapilární sekvenátor = 2304 x 500 bp/12 hodin = cca 2 400 000 bp/den NGS (Illumina HiSeqX10) = cca 600 000 000 000 bp/den Next-generation sequencing (NGS) Next Generation Sequencing Historie „Next generation sequencing“ 454 pyrosequencing ... první komerčně dostupná NGS technologie od srpna 2007 2016 – ohlášené stažení z trhu (Roche) Široké spektrum technologií Ale jen některé přežijí Dnes dostupné NGS platformy •Roche 454 •Illumina HiSeq a MiSeq •ABI SOLiD •IonTorrent (Life Technologies) •SMRT (Pacific Biosciences) •Oxford Nannopore •… 454 pyrosequencing • •emulzní techniky amplifikace pikolitrové objemy • •simultánní sekvenování na destičce z optických vláken detekce pyrofosfátů uvolňovaných při inkorporaci bazí • •První generace GS20 → 200 000 reakcí najednou (zhruba 20 milionů bp) FLX systém → 400 000 reakcí najednou = eukaryotní genom za týden!!! • •Délka jednotlivých sekvencí 100 – 400 (800 bp) • 1 600 000 well plate DNA Fragmentation (Nebulization): Adaptor Ligation: Adaptor A + Adaptor B -Slouží jako vazebné místo primerů pro následnou PCR amplifikaci a sekvenování -Slouží k uchycení na kuličky (na adaptor B je připojen biotin) Library Immobilization: ssDNA Library Isolation: 1. Příprava jednořetězcové DNA knihovny (ssDNA library preparation) 2. Namnožení každé jednotlivé molekuly pomocí emulzní PCR (emPCR) Preparation of the Amplific. Mixes DNA Library Capture: Emulsification: emPCR Amplification: - poměry nastavit tak aby 1kulička ≤ 1 molekula DNA Sequencing Primer Annealing: 3. Pyrosekvenování („sequencing by synthesis“) pikotitrační destička Na jedné desticče 400 000 až 1milión jamek -postupně se přidávají nukleotidy v definovaném pořadí: např. TACG TACG TACG -po přidání každého nukleotidu a detekci signálu se nukleotid odmyje a přidá se další C T CC G T A C G T A C G DNA sekvence: C T C C G Problém!!!! Homoplymery např. AAAAAAAAAA 3. Pyrosekvenování – detekce signálu http://www.youtube.com/watch?v=bFNjxKHP8Jc High-throughput – paralelní sekvenování !!! Samozřejmě nestačí mít každou bázi osekvenovanou 1x !!! - Pospojování (reads assembly) do souvislé sekvence - Nepřesnosti – pokrytí (coverage) Mus: 2700 Mb → 7 run 1x coverage Caenorhabditis: 100 Mb → 1 run 4x coverage E. coli: 5 Mb → 1 run 80x coverage mitoch. Mus: 0.016 Mb → 1 run 25000x coverage HIV: 0.01 Mb → 1 run 40000x coverage Kapacita destičky 400 Mb (GS FLX Titanium): -k dispozici 12 odlišných MID („multiplexing“) 16 „gaskets“ V každém max. 12 vzorků (každý označen svým MID) 12 MID X 16 gaskets = max. 192 vzorků 1.CCCCCCCCCC 2.GGGGGGGGG . . . 12. CCCCCAAAG - v současné době nejrozšířenější typ (cca 70%) na trhu - v horizontu následujících let její používání spíš poroste https://www.youtube.com/watch?annotation_id=annotation_228575861&feature=iv&src_vid=womKfikWlxM&v=f Cd6B5HRaZ8 Illumina HiSeq/MiSeq Illumina HiSeq Illumina MiSeq https://www.youtube.com/watch?annotation_id=annotation_228575861&feature=iv&src_vid=womKfikWlxM&v=f Cd6B5HRaZ8 NovaSeq 6000 Sequencing System (2017) ca. 48 human genomes/run https://emea.illumina.com/systems/sequencing-platforms/comparison-tool.html?langsel=/cz/ NGS technologie 454 pyrosequencing (Roche) Illumina Ion sequencing: Life Technologies Ion Torrent technology Využívá změny pH při syntéze DNA SMRT („single molecule real-time sequencing“) – Pacific Biosciences dlouhé čtení (15 kb), hodně chyb http://www.youtube.com/watch?v=v8p4ph2MAvI 3rd generation: Oxford Nannopore „Run until sequencing ...“ Princip technologie http://www.youtube.com/watch?v=3UHw22hBpAk Sekvenování přímo v terénu (?) Deployment of the portable genome surveillance system in Guinea. Ebola outbreak Quick et al., Nature 2016 Přehled současných metod NGS Výkonnost jednotlivých metod Chybovost jednotlivých metod Bioinformatika – největší brzda dalšího rozvoje Sekvenační strategie •nutno velmi dobře počítat než se začne sekvenovat • •celkový výtěžek sekvenování = počet „reads“ * délka „reads“ * coverage • •zásadně závisí na konkrétním cíli výzkumu a použité technologii • …JEDEN VZOREK NA RUN JE MÁLO Sekvenační strategie Kapilární sekvenátor Sekvenátor druhé generace U kapilárních sekvenátorů není problém přiřadit sekvenci k jednotlivým vzorkům na základě pozice na platíčku U sekvenátorů druhé generace se najednou sekvenuje pool desítek až stovek vzorků …JEDEN VZOREK NA RUN JE MÁLO Sekvenační strategie Jednotlivé vzorky pro sekvenátory druhé generace se značí tzv. barcody (midy, tagy) Krátká (obvykle 6-12bp) oligonukleotidová sekvence před primerem (pokud sekvenujeme PCR amplikon), která je specifická pro daný vzorek Přiřazení identity jednotlých sekvencí k vzorkům probíhá bioinformaticky AGCGTAGGTCATTTCGATGCGGTCATGCCTGGATTAAAGCT.................. TTCGTAGGTCATTTCGATGCGGTCATGCCTGGATTAAAGCT.................. TGGGTAGGTCATTTCGATGCGGTCATGCCTGGATTAAAGCT.................. TGCCTAGGTCATTTCGATGCGGTCATGCCTGGATTAAAGCT.................. TGCGCAGGTCATTTCGATGCGGTCATGCCTGGATTAAAGCT.................. TGCGTTGGTCATTTCGATGCGGTCATGCCTGGATTAAAGCT.................. BARCODE PRIMER SEQUENCE AMPLIKONOVÉ SEKVENOVÁNÍ SHOT GUN SEKVENOVÁNÍ Fragmetace celogenomové DNA Ligace sekvenačních adaptorů Následná sekvenace náhodných fragmentů De novo assembly, resekvenování, transkriptomika, funkční složení daného společenstva PCR Amplifikace konkrétního úseku daného genomu pomocí specifických primerů (se sekvenačními adaptory) Následná sekvenace Taxonomické složení daného vzorku („metabarcoding“), variabilita konkrétních genů apod. Sekvenační strategie TO NENÍ VŠECHNO.............. Sequence capture + shot gun Separace úseků genomu které nás zajímají na základě jejich hybridizace Následná sekvenace obohacených knihoven („enrichement“) Nové markery (mikrosatelity apod.), kódující oblasti genomu („exom“), „anchored phylogenomics“ apod. Sekvenační strategie Anchored phylogenomics •hundreds of conserved loci •hybridization enrichement •u velmi příbuzných taxonů bude málo variability TreeOfBirdsResolved Anchored Phylogenomics 198 species 259 nuclear loci (ca 1500 bp each) > 390 000 bp October 2015 Long range PCR + shot gun Dlouhé PCR produkty, které nejdou vcelku osekvenovat Jejich fragmentace Sekvenování fragmetů Zpětná rekonstrukce původní sekvence („assembly“) Použitelné pokud nás zajímá variablita v jednolitém úseku DNA. Např. sekvenace mitochodrální DNA (3 různé PCR produkty). Sekvenační strategie Sekvenování podél restrikčních míst Fragmetace gelogenomové DNA po mocí restrikčních enzymů Ligace sekvenačních adaptorů na výsledné fragmenty Následná sekvenace podél restrikčních míst Celogenomové scany genetické variablility Hledání SNPs, populační genomika (např. RAD-SEQ) apod. Sekvenační strategie Aplikace 1.Celogenomové sekvenování de novo 2. 2.Celogenomové resekvenování 3. 3.Sekvenování amplikonů (PCR produktů) 4. 4.Další aplikace – např. hledání klasických DNA markerů (mikrosatelity, SNPs) 1. Celogenomové sekvenování de novo Problém: KRÁTKÝ READ LENGTH - 400bp 454 FLX Roche (dnes i Illumina), 35-75bp Solid × vs 800-1000bp Sanger - nové technologie (PacBio, Nannopore) už s tím takový problém nemají !!!!! REPETITIVNÍ OBLASTI delší než read length !!!!! GTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAC Zvláště komplexní eukaryotické genomy – úseky souvislých oblastí přerušených mezerami → Uspořádání (assembly) ještě stále může být problém z hlediska výpočetní kapacity •získání kompletní uspořádané sekvence celých velkých eukaryotních genomů pomocí next-generation sequencing de novo je problém (ale to je nakonec i u Sangera) •viry, prokaryota, malá eukaryota, mitochondrie/plastidy/plasmidy 1. Celogenomové sekvenování de novo 2009 2015 2. Celogenomové resekvenování KOMPARATIVNÍ GENOMIKA - viry, prokaryota, malá eukaryota - mitochondrie/plastidy/plasmidy - podobné problémy jako u de novo, ale méně (větší strukturální přestavby..) ANCIENT (mt) DNA - různé směsné, degradované vzorky, např. fosilie •Degraded state of the sample à mitDNA sequencing •Nuclear genomes of ancient remains: cave bear, mommoth, Neanderthal (106 bp ) C:\Documents and Settings\Antonio\Escritorio\mammoth.jpg C:\Documents and Settings\Antonio\Escritorio\neardenthal.jpg C:\Documents and Settings\Antonio\Escritorio\cavebear.jpg Problems: contamination modern humans and coisolation bacterial DNA 3.Sekvenování amplikonů (PCR produktů) SMĚSNÉ VZORKY – paralelní sekvenování nahrazuje klonování Metagenomika (= hlavně prokaryota) •Celé společenstvo půdních, vodních mikroorganismů, střevní mikroflóra - mikrobiom •PCR genu 16S rRNA •lze i kvantifikovat Metabarcoding (= hlavně eukaryota, ale dnes používáno jako obecný termín) •COI gen, příp. jiný barcodingový marker •složení potravy, monitoring společenstev • Metabarcoding: Taxonomické složení společenstva v environmentální DNA na základě taxonomicky informativního úseku DNA (cyt b, COI, ITS, rRNA...) Princip •Směsný vzorek enviromentální DNA •Amplifikace pomoci primerů specifických pro cílovou skupinu, pokrývající taxonomicky informativní úsek (COI, 16s/18s RNA...) •Paralelni sekvenování •Filtrování nekvalitních sekvencí •Klastrování na základě sekvenční podobnosti do OTUs („operational taxonomic units“) •Jejich taxonomické zařazení na základě referenčních databází Využití: Analýza druhového vzorků kde lze makroskopicky jednotlivé druhy obtížně odlišit •Potravní analýza z trusu •Vzorky půdy •Mikrobiální společenstva •Permafrost •Exotická/špatně probádaná společenstva •Druhově bohatá společenstva („insect traps“ v tropech) •Rutinní analýza velkého množství vzorků Metabarcoding Taxonomické složení společenstva na základě taxonomicky informativního úseku DNA Alternativy: Klonování amplikonů a sekvenování klonů Specifické elektroforézy – např. DGGE Výhody paralelního sekvenování •Cenově i časově míň nákladné •Lépe se zachytí vzácné taxony (zlomky promile) Ale: •Riziko umělého navýšení diversity díky chybám při procesování dat •Do jaké míry jsou referenční databáze dostatečné ke klasifikaci vzorků? •Lze použít tato data kvantitativně a nebo vypovídají jen o přítomnosti/nepřítomnosti? Metabarcoding – příklady využití Mark Blaxter, Edinburgh Genomics Společenstvo eukaryot ve vrchní vrstvě půdy Metabarcoding – příklady využití Mark Blaxter, Edinburgh Genomics Společenstvo eukaryot ve vrchní vrstvě půdy Metabarcoding – příklady využití Mark Blaxter, Edinburgh Genomics Metabarcoding – příklady využití Mark Blaxter, Edinburgh Genomics Metabarcoding – příklady využití Monitoring vzácných, nedávno popsaných druhů savců na základě sekvenování krve pijavic Výrazně větši úspěšnost prokázání přítomnosti než za použití klasických technik – fotopasti, terénní pozorování apod. Metabarcoding – příklady využití Detekce ryb pomocí izolace eDNA z mořské vody -taky jedna z nejefektivnějších metod Metabarcoding – příklady využití Analýza potravy Podíl hospodářských zvířat v potravě irbise je minimální Metabarcoding – příklady využití Analýza složení společenstva na základě ancient DNA z koprolitů moa (Nový Zéland) Umožňuje odhadnout typ prostředí které jednotlivé druhy obývaly a separaci ekologických nik 3.Sekvenování amplikonů (PCR produktů) Genové duplikace kachna-divoka-1 A-adaptor MID Target specific Amplifikuje všechny kopie MHC genů Označí jedince Potřeba k emPCR, sekvenování.. 192 jedinců u 454 pyrosekvenování Amplikonové sekvenování MHC u hýla rudého - NGS má větší rozlišovací schopnost než SSCP + klonování 4. Další aplikace – hledání nových genetických markerů Mikrosatelity •sekvenování obohacených knihoven SNPs •kompletní genomické sekvence pro hledání diagnostických SNPs •např. RAD-sequencing • Hledání nových genetických markerů - mikrosatelity Obvyklý postup: -Obohacení genomické knihovy o mikrosatelitové motivy – sequence capture -Sekvenování obohacených knihoven -Detekce mikrosatelitů a navržení vhodných primerů mys2 musculus domesticus mys2 mys2 mys2 mys2 mys2 mys2 mys2 mys2 mys2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 smíchat a osekvenovat G G T G G T T G 10 jedinců 10 jedinců G G G G G G G G T T T T T T T T Hledání diagnostických SNP (např. pro studium hybridizace) Sekvenování podél restrikčních míst Fragmetace gelogenomové DNA po mocí restrikčních enzymů Ligace sekvenačních adaptorů na výsledné fragmenty Následná sekvenace podél restrikčních míst Celogenomové scany genetické variablility Hledání SNPs, populační genomika (např. RAD-SEQ) apod. Hledání nových SNPs – RAD-sequencing RAD vs. ddRAD Sekvenování podél restrikčních míst Phylogenomics of Lophuromys •ancestral lineage „trapped“ in Ethiopian highlands, where diversified and sourced the colonization of other mountains (mostly in Pleistocene) • •Lophuromys flavopunctatus complex (9 Ethiopian species) • • • 9 endemic species in Ethiopia Lophuromys - questions •Are there really 9 well delimited species? •Are they easily (genetically) recognizable? (e.g. mtDNA-barcoding) •What is their distribution and ecological requirements? -> IUCN assessment, etc. Material and Methods •cca 500 specimens from all major mountain ranges • mtDNA marker (CYTB) •4 nuclear markers (2 introny + 2 exony) •genomic approach – ddRAD sequencing Retaining well-covered & informative loci •All loci •HQ loci •No. of individuals: 213 •No. of loci: 15164 •No. of informative loci: 15164 •No. of SNPs / PISs per informative locus: • Min: 1 / 1 • 25%: 17 / 14 • 50%: 25 / 21 • 75%: 32 / 28 • Max: 57 / 54 •Loci per individual: • Min: 3393 • 25%: 6912 • 50%: 8074 • 75%: 9297 • Max: 11912 •Individuals per locus: • Min: 54 • 25%: 74 • 50%: 103 • 75%: 149 • Max: 208 •Proportion of missing data: 0.47 •No. of individuals: 213 •No. of loci: 80570 •No. of informative loci: 69724 •No. of SNPs / PISs per informative locus: • Min: 1 / 1 • 25%: 5 / 4 • 50%: 10 / 9 • 75%: 20 / 17 • Max: 60 / 57 •Loci per individual: • Min: 5178 • 25%: 9719 • 50%: 12000 • 75%: 14607 • Max: 23205 •Individuals per locus: • Min: 4 • 25%: 6 • 50%: 13 • 75%: 37 • Max: 208 •Proportion of missing data: 0.85 ✔ ✔ 80 570 loci → filtering → 15 164 loci ddRADseq: co-ancestry matrix lophuromys_eth-SimpleCoancestry.png 209 individuals 15 623 informative loci 9 „gene pools“ Maximum likelihood analysis of concatenated nuclear dataset 4 nuclear markers (V. Komarova et al.) (2 604 bp concatenated dataset) Sanger sequencing ddRADseq 15 623 informative loci 100 100 100 100 100 100 99 100 100 100 100 100 100 100 100 100 97 44 88 100 100 94 95 100 98 92 83 91 94 77 86 77 brevicaudus flavopunctatus brunneus 2n = 68 melanonyx chrysopus menangeshae pseudosikapusi chercherensis 2n = 70 simensis 2n = 60 2n = 54 And what about mtDNA? ddRADseq 15 623 informative loci 100 100 100 100 100 100 99 100 100 100 100 100 100 100 100 100 brevicaudus flavopunctatus brunneus melanonyx chrysopus menangeshae pseudosikapusi chercherensis simensis 100 100 96 93 96 97 96 100 82 89 88 100 100 100 100 100 100 97 mtDNA cytochrome b (1140 bp) 2n = 68 2n = 70 2n = 60 2n = 54 ddRADseq 15 623 informative loci 100 100 100 100 100 100 99 100 100 100 100 100 100 100 100 100 brevicaudus flavopunctatus brunneus melanonyx chrysopus menangeshae pseudosikapusi chercherensis simensis 100 100 96 93 96 97 96 100 82 89 88 100 100 100 100 100 100 97 mtDNA cytochrome b (1140 bp) And what about mtDNA? „reticulate evolution“