Klonování genů v kvasinkách Důvody pro klonování genů v eukaryotech A. Funkce charakteristické pro eukaryotické buňky, které se u baktérií nevyskytují: - lokalizace systému regenerujícího ATP v mitochondriích, - uspořádání DNA v chromatinu - způsob dělení buněk, mitoza a meioza - diferenciace buněk, buněčné komunikace, signální dráhy B. Rozdíly v expresi genů u eukaryot oproti bakteriím: - odlišnost regulačních sekvencí pro transkripci, translaci a export - specifické posttranslacní modifikace i Výhody kvasinek pro Gl • jednoduchá eukaryota s mikrobiálním charakterem (malý genom se známou sekvencí, krátká generační doba a vysoký počet potomstva, kultivace na definovaných půdách, řada mutant získaných a charakterizovaných klasickou i moderní genetikou • řada genů homologních vyšším eukaryotům, podobná buněčná biochemie a regulace genů • možnost stanovit dominanci a recesivitu alel (na haploidním pozadí) • vysoká frekvence homologní rekombinace - záměny genů • tradiční dobře definovaný a bezpečný biotechnologický organismus, možnost přípravy farmak pro humánní medicínu, • eukaryotické proteiny vytváří v aktivní podobě, lze dosáhnout sekrece do prostředí 2 Životní cyklus kvasinek Zygotic diplophase Conjugation (Q a** CQ Meiosis an ľ—^^X sporulatioi «aHaploid gO Oa spores Haplophases © 3 °o tetrádová analýza Dva typy haploidních buněk: a a a Heterotalické kmeny Heterotalické kmeny - stabilní Homotalické kmeny - nestabilní, haploidní buňky spontánně revertují na opačný buněčný typ 3 Molekulární struktura kvasinkového 2\i plazmidu ■■■■fy.*, ■■ i; ■■■■ REP2 Izomerní formy plazmidu 6,3 kb; 50-100 kopií REP - replikace FLP - rekombince STB - rozklad kointegrátu FRT site = FRT recombination target Flp recombinase = flippase Systém Flp/FRT ~ Cre/loxP Chimérické plazmidy vytvořené spojením plazmidu 2|u a pMB9 štěpených EcoRI, (dále pak vložení genu Ieu2 z kvasinkového chromozomu do místa Pstl na plazmidu) Kyvadlové vektory pro klonování genů v kvasinkách Amp bakteriálni počátek replikace kvasinkový Ieu2 kvasinkový počátek replikace Přenos do kvasinek: transformace protoplastů elektroporace Příprava protoplastů: lytikáza, zymolyáza transformace £. coli E. coli plazmidy se mohou přenášet z kvasinek do E. coli a naopak transformace kvasinky leu" kvasinková buňka Základní typy kvasinkových vektorů Integrující se~ pBR322, stabilní po integraci Amp ura3 Replikující se malý počet kopií, nízká stabilita AmpR cirkulární 2^-DNA ura3 Epizomální, malý počet kopií, stabilní nesoucí centromeru (jediná kopie; stabilní) AmpR Amp ARS ARS CEN3 ura3 ura3 Možnost eliminace bakteriálních sekvencí jejich ohraničením FLP 6 Umělý kvasinkový chromozom (YAC) EcoRI CENA ARS2 TRPÍ AMPR EcoRI ARS2 URA3 BamHI BamHI Cut with EcoRI and BamHI AMPR ori TEL BamHI CENA TRPÍ BamHI TEL URA3 EcoRI Genomic DNA EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI Partial digest with EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI DNA CENA TRPÍ l Transform into ade , ura , trp yeast and select for red, URA+, TRP+ colonies Virům podobné částice odvozené z Ty elementů nesoucích kódující oblast HIV1 TAT Ty-element: 30-40 kopií v genomu S. cerevisiae, velikost 5,9 kb LTR - 334 bp, levá funguje jako promotor genů pro RT a integrázu. Pseudovirion (virus like particle, VLP) obsahuje mRNA, dsDNA, RT a integrázu 8 Životní cyklus Tyl PIC - PREINTEGRATION COMPLEX 9 Promotor kvasinkových genů 2jiORI Transkript vloženého ô (klonovaného) genu URA3 Struktura vysokokopiového plazmidu používaná pro začlenění modifikovaného Ty elementu nesoucího klonovaný gen do chromozomu kvasinky. pGAL a P jsou kvasinkové promotory, ô (delta sekvence ) jsou LTR Použití při přípravě vakcín - fúzní plášťový protein obsahující např. antigény z plazmodií (malárie) 10 Table 13.1 Properties of different yeast vectors \/ E KT^D R Transformation Copy no./ non-selective Vector frequency cell medium Disadvantages Advantages integrující se Yip epizomální (ori 2 u.) replikující se (ars) YEp YRp centrom e rovy YCp umělý chromozom YAC transpoziční Ty 10' 1 transformants per >ig DNA transformants per ug DNA 10-1 transformants perug DNA 10" transformants per >ig DNA Depends on vector used to introduce Ty into cell 2S-2Q0 I-20 1-2 1-2 -20 Much less than 1% per generation 1 % per generation Much greater than 1 % per generation but can gel chromosomal integration Less l nan 1% per generation Depends on length: [he longer the YAC the more stable it is Stable, since integrated into chromosome 1 Low transformation frequency 2 Can only be recovered from yeast by cutting chromosomal DMA with restriction endo nuclease which does not cleave original vector containing cloned gene Novel recombinants generated in vivo by recombination with endogenous 2-urn plasm id Instability of transiormanrs Low copy number makes recovery from yeast more difficult than that of YEp or YRp vectors Difficult 10 map by standard techniques Needs to be introduced into ceil in another vectot 1 Of all vectors, this kind give most stable maintenance of cloned genes 2 An integrated Yip plasmid behaves as an ordinary genetic marker, e.g. a diploid heterozygous for an integrated plasmid segregates the plasmid in a Mendelian fashion 3 Most useful for surrogate genetics cl yeast, e.g. can be used to introduce deletions, inversions and transpositions (see SotstBin & Davis 1982) 1 Readily recovered from yeast 2 High copy number 3 High transformation frequency 4 Very useful for complementation studies 1 Readily recovered from yeast 2 High copy number. Note that the copy number is usually less than that of YEp vectors but this may be useful if cloning gene whose product is deleterious to the cell it produced in excess 3 High transformation frequency 4 Very useful for complementation studies 5 Can integrate into the chromosome 1 Low copy number is useful if product of cloned gene is deleterious lo cell 2 High transformation frequency 3 Very useful lor complementation sludies 4 Al meiosis generally shows Mendelian segregation 1 High-capacity cloning system permitting DNA molecules greater than 40 kb to be cloned 2 Can amplify large DNA molecules in a simple genetic background Get amplification following chromosomal integration 11 Selektovatelné markery u kvasinek Gen Enzym Selekce HIS3 Imidazole glycerolphosphate dehydratase histidine LEU2 (3-lsopropylmalate dehydrogenase leucine LYS2 a-Aminoadipate reductase lysine TRP1 N-(5'-phosphoribosyl)-anthranilate isomerase tryptophan U R A3 Orotidine-5'-phosphate decarboxylase uracil Pozitivní selekce na mediu bez příslušného faktoru G418 - rezistence k geneticinu (KanR) 12 Využití genu LEI]2 jako selekčního markeru (a) Kvasinka leu2 Chromozomy -bez genu LEU2 (b) Použití LEU2 jako selektivního markeru Kolonie /eu2 / \ _^ft Médium musí obsahovat leucin LEU2 Transformovat kvasinky Přežívají pouze transformované buňky Vektor - nese správný gen LEU2 í=-í-=- Minimální médium - bez leucinu Začleňování epizomálních plazmidů do chromozomu kvasinek YEp13 Slouží současně jako selekční marker LEU2 V leu - --Chromozomální DNA kvasinek Rekombinace LEU2 leu Plazmidová DNA 14 Výhody dostupnosti různých typů kvasinkových vektorů • Všechny kvasinkové vektory mohou být použity k vytváření částečných diploidů nebo částečných polyploidů, přičemž genové sekvence zavedené do buňky mohou být buď začleněny do chromozomu nebo přetrvávat v extrachromozomálním stavu. • Do klonovaných genů mohou být zaváděny in vitro mutace a pozměněné geny lze pak vrátit do kvasinky a nahradit jimi alely standardního typu. 15 Reportérové geny Gene Protein Size (amino acids) Original source Detection Reference cat Chloramfenikol- 219 E. cotiTn9 Acetylation of (Gorman, Moffat and acetyltransferáza transposon chloroamphenicol using 14C Howard, 1982) acetyl-Co A lacX /i-galactosidase 1024 E. coli Conversion of colourless ONPG to a yellow product; XGal blue-white screening (Norton and Coffin, 1985) gush. ^-glucuronidase 603 E. coli Conversion of MUG in a fluorometric assay; XGluc blue-white screening (Jefferson etai, 1986) lue Luciferase 550 Photinus pyralis (firefly) Oxidation of luciferin to produce light (de Wet of a/., 1987) GFP Green fluorescent protein 238 Aequoria victoria (jellyfish) Emits green fluorescence when exposed to blue or UV light (Chalfie etal, 1994) ONPG - o-nitrophenyl-^-D-galactopyranoside. XGal - 5-bromo-4-chioro-3-indolyl-/f-D-galactopyranoside. MUG - 4-methylumbelliferyl jö-D-glucuronide, XGluc - 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-/}-D-glucuronide. 16 Exprese genů v kvasinkách • Pro účinnou expresi je žádoucí, aby klonované sekvence byly pod kontrolou kvasinkových promotorů - ty mají určitá specifika. Vektory proto mají promotory z kvasinek. • Poločas mRNA (1-100 min) je silně ovlivněn netranslatovanými sekvencemi na 5'a 3'konci - jejich odstranění poločas zvýší • Kvasinky mají jiné využívání kodonů než bakterie nebo vyšší eukaryota. Při chemické syntéze genů je třeba volit kodony, které jsou čteny (96% aminokyselin v kvasinkových proteinech je kódováno jen 25-ti z 61 možných kodonů) • Exkrece proteinů: signální sekvence jsou dlouhé 20-90 aa. Přesná pravidla nejsou známa - u některých proteinů se exkrece nedaří. Sekrece zabrání rozkladu proteinu v cytoplazmě - proteolýze lze zabránit též změnou aa na N-konci (zábrana ubiquitace) 17 Exprese genů v kvasinkách - pokrač • Glykozylace - dochází ke glykozylaci cizích proteinů, ale struktura a sekvence oligosacharidů připojovaných na proteiny je odlišná než v přirozených hostitelích - to může mít důsledky pro stabilitu, imunogenitu a výslednou lokalizaci v tkáních (např. při terapeutickém používání) • Stabilita proteinů. Rychlá degradace proteinů po jejich syntéze nebo po rozbití buněk a purifikaci endoproteinázami, karboxypeptidázami a aminopeptidázami přítomnými ve vakuolách. Byla zkonstruována řada mutantních kmenů s pozměněnou aktivitou těchto enzymů. • Sestřih. Introny mají obecné rysy (5' GU - AG 3') a další konsenzuální sekvence. U kvasinek je před 3'místem sestřihu sekvence, která chybí u vyšších eukaryot. 18 Struktura kvasinkového promotoru 4 elementy: 1. TC(G/A)A a PuPuPyPuPu jsou u více než poloviny známých kvasinkových promotorů. Tyto sekvence nejsou u vyšších eukaryot, což ukazuje na rozdílný mechanismus jejich transkripčního aparátu. 2. TATA box, oblast 20-120 nukleotidů před místem iniciace. 3. Sekvence umístěné proti směru transkripce podílející se na regulaci genů: A. sekvence aktivující transkripci (UAS) - vazba pozitivního regulačního proteinu na UAS zvyšuje rychlost transkripce, zatímco delece UAS transkripci potlačí. Důležitým strukturním rysem UAS je přítomnost jedné nebo více oblastí s dvojitou symetrií. B. sekvence reprimující transkripci (URS). Vazba negativního regulačního proteinu na URS snižuje rychlost transkripce genů, které jsou regulovány negativně. 4. Sekvence umístěné uvnitř samotného genu, které se označují jako aktivující sekvence umístěné po směru transkripce (downstream activating sequences, DAS). Nízká množství heterologních proteinů odráží nízké množství mRNA jako důsledek nízkého stupně iniciace transkripce. Např. vložení aktivující sekvence umístěné po směru transkripce genu PGK obnovuje rychlost transkripce mRNA. Struktura typického kvasinkového promotoru TC(GA)A PuPuPyPuPu 1 Initiator Nejsou u vyšších eukaryot UAS URS TATA I Kódující[ ] sekvence U regulovaných genů 40-120 bp 20-400 bp 100-1400 bp Ovlivňuje rychlost iniciace transkripce i Vložení do sekvence cizího genu Příklady konstitutivních ADHI - alkoholdehydrogenáza kvasinkových promotorů _ PGK-fosfoglycerolkináza používaných v expresních * PH05 - kyselá fosfatáza vektorech alfa-faktor (+ signální sekvence pro exkreci) 7X7 Promotorv S. cerevisiae vyuzivane v expresmch vektorech Promotor Podminky pro expresi Tvorba produktu Acid phosphatase (PH05) Phosphate-deficient medium Inducible Alcohol dehydrogenase I (ADHI) 2-5% Glucose Constitutive Alcohol dehydrogenase II (ADMIT) 0.1-0.2% Glucose Inducible Cytochrome cT (CVC1) Glucose Repressible Gal-l-P Glc-l-P uridy transferase Galactose Inducible Galactokinase {GALT} Galactose Inducible Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPD, GAPDH) 2-5% Glucose Constitutive Metallothionein (CUP1) 0.03-0.1 mM copper Inducible Phosphoglycerate kinase (PGK) 2-5% Glucose Constitutive Triose phosphate isomerase (TPf) 2-5% Glucose Constitutive UDP galactose epimerase (GAL10) Galactose Inducible 21 Gal systém S. cerevisiae využitý pro expresi genu GAL1 Gal1 (galaktokináza) přirozený systém Gal4p + galaktóza (induktor) Transkripciu' aktivátor Gal1 Gen zájmu P*Gan = syntetický promotor obsahující více vazebných míst pro Gal4p konstrukt na vektorech + galaktóza (induktor) Gal4p GaM GAL4 22 Exprese genů indukovaná galaktózou A. Gal4p vytvářený z vlastního promotoru B. Gal4p vytvářený z promotoru GaM GAL4 nízká hladina Gal4p, málo cílového produktu GAL1 vysoká hladina Gal4p, hodně cílového produktu Sekrece proteinů v kvasinkách Hlavní rysy sekretovaných proteinů: • jsou syntetizovány na endoplazmatickém retikulu • z ER jsou transportovány do Golgiho aparátu, kde jsou upraveny a zabaleny do sekrečních váčků • Fúze sekrečních váčků s plazmatickou membránou se děje konstitutivně nebo jako odpověď na externí signál • Nakonec jsou lokalizovány na buněčném povrchu nebo exportovány z buňky Proteiny přirozeně sekretované do růstového media a) pérovací feromony (a-faktor, a-faktor) b) killer toxin (proteinový produkt dsRNA n. dsDNA plazmidu n. VLP; molekuly působící toxicky na jiné kmeny kvasinek). • Polypeptidy určené k sekreci mají hydrofobní N-konec, který je odpovědný za translokaci do endoplazmatického retikula. • N-konec je obvykle tvořen 20 aminokyselinami a odštěpen ze zralého proteinu uvnitř endoplazmatického retikula. Bylo dosaženo sekrece řady ne-kvasinkových polypeptidů z rekombinantních plazmidů, ale pravidla pro sekreci nejsou zcela jasná. 24 Problémy při expresi některých proteinů v S. cerevisiae • nízká exprese klonovaných genů, nízký výtěžek proteinu • hyperglykozylace heterologních proteinů • pozměněný transport sekretovaných proteinů (zadržení v periplazmatickém prostoru) • tvorba vysoké koncentrace alkoholu, který usmrcuje buňky a snižuje výtěžek proteinů 25 Cílení proteinů do jádra Jádro kvasinky obsahuje sadu proteinů, které jsou syntetizovány v cytoplazmě. Pro objasnění mechanismu týkajícího se lokalizace proteinů v buňce byly zkonstruovány hybridní geny fúzí kvasinkového Matalfa genu, kódujícího předpokládaný jaderný protein, a genu lacZ z E. coli. Segment genového produktu MATalfa, který byl 13 aminokyselin dlouhý, byl schopen usměrnit p-galaktozidázovou aktivitu do jádra. To bylo potvrzeno imunofluoroscencí. Podobné sekvence byly zjištěny u jiných proteinů a označeny jako nuclear localization signals (sequences) (NLS) Podle současného modelu pro import jaderných proteinů jsou proteiny obsahující NLS rozpoznány specifickými receptory (nuclear transport receptors) v cytoplazmě. Komplex NLS-receptor se pohybuje k jaderným pórům, které otvírá reakcí vyžadující ATP a dovoluje, aby protein vstoupil do jádra. 26 Klonování kvasinkových genů v buňkách E. coli s využitím komplementace Yeast cells Chromosomal DNA 30 % genů kvasinek se exprimuje v E. coli Získávání nových kvasinkových selekčních markerů Saw3A partial Most cell: don't grow Four-base /'"sticky end" W1 \ Bacterial origin of replication Genová knihovna kvasinky Transform Plate onto medium lacking leucine Přenos do mutantnich kmenů £. coli Cells contain plasmid with LEU2 gene LEU2 gene functions in E coli hledaný gen 2i Klonování kvasinkových genů na genetické komplementace Xts recipient: kvasinkový kmen nesoucí ts mutaci v genu X a mutaci v genu Ieu2 -roste jen při 30^C Příp. ztráta nějakého znaku při vyšších teplotách Leu Plasmid library '■Zi-g Yeost transformation Příprava genové knihovny z kvasinkového kmene s genem X(wt) ve vektoru obsahujícím jako selekční marker LEU2 Plate onto medium lacking leucine Incubate at 30°C (permissive temperature) Only cells that contain a plasmid grow Incubate plate at 37°C (nonpermissive temperature) All cells grow Only cells that contain plasmid with wild-type gene X will grow at37°C Isolate plasmid Determine DNA sequence of gene X izolace klonu X+ J Translate to obtain jiratei|i sequence encoded 28 Začleňování genů homologní rekombinací Left half Right half ofW URA3 pUC °f^G / / / One chromosome contains YFG integrated at URA3 locus YFG = gen zájmu, jehož funkci sledujeme One chromosome contains URA3 gene intergrated at YFG Linearizace plazmidu v místě homologie zvyšuje frekvenci začlenění asi 100x 29 Vnášení genů do chromozomu kvasinek pomocí integrativních vektorů Ampr gene Transformation Recombination t 1-i Kyvadlový vektor připravený v E. coli Chromosome Chromosome GOI = gen zájmu Al A2 = nesenciální geny 30 Vyprošťovací replikující se vektor AmpR Ieu2 ARS plazmid obsahujíc! divokou alelu MAT Xho\ j Xho\ AmpR Ieu2 ARS plazmid s mezerou I I MAT" IZZ II Linearizovaný plazmid se nereplikuje Xho\ ! Xho\ I mutovaná chromozóm alela kvasinky Část genu mat je vyštěpena, hraniční sekvence jsou ponechány Amp" ieu2 ARS plazmid nesoucí MAT" \. MAT transformace E. coli a vyhledání plazmldů nesoucích Inzert s MAT' Homologní rekombinace a cirkularizace plazmidů, jejich izolace a přenos do E. coli, studium mutantní alely M A T' 31 Rekonstrukce plazmidu homologní rekombinací v kvasinkové buňce Vložení nového selekčního markeru do plazmidu, překlonování genu zájmu do jiného typu vektoru Plazmid, který se v kvasince nereplikuje společně přeneseny do kvasinky transformací Plazmid, který se v kvasince replikuje i Recombination Eco Selekce klonů na HIS3, případně na UR A3 Vytěsnění a záměna plazmidů piasmid shuffle Studium funkce mutantních a cizích genů Trojnásobný mutant TPK1-, TPK2-, TPK3- ura+, his+, trp+, ade-, leu- Myší cAMP dependentní PK Yeast cell 2u. OTÍ \ Mouse protein ^ kinase gene Medium lacking adenine and leucine Transform info yeast Plate to select For Ade+, Leu+ transFormants All cells on plgie contain both plasmids Culture a colony in complete medium (YPD) M Cells can lose one of the two pi a Plate cel!s onto YPD medium Cells need at least one protein kinase gene to grow Cells in colony contain only the piasmid with mouse protein kinase gene Replica plate Cells in colony contain only the f piasmid with TPKl I Cell contains only the piasmid with IPK' Colony Fails to grow Umožňuje růst na mediu bez adeninu Zajišťuje životaschopnost buňky Selekce buněk obsahujících oba plazmidy - půda bez ade a leu Kultivace buněk za neselektivních podmínek Buňka si musí alespoň jeden z plazmidů s PK podržet Závěr: Gen pro myší proteinkinázu může nahradit gen TPK1- 33 Dvouhybridní systém ke studiu interakce proteinů Hybridní protein Gal4p-X se váže na promotor, ale není schopen aktivovat transkripci reportérového genu Hybridní protein Gal4p-Y se není schopen vázat na promotor a tudíž není schopen aktivovat transkripci Interakce hybridních proteinů Gal4p-X::Gal4p-Y aktivuje transkripci UASG 34 Plazmidy určené k vytváření fúzních proteinů s doménami Gal4p (DBD a AD) Selekce plazmidů Vyhledání genů, jejichž produkty interagují Ge"e segment encoding GAL4 ONA-binding domain 5NF4-CAU /hybrid gene LEU2 Colransform into Leu', His" yeast Select leuti Híi+ ce"s SNF1 a SNF4 asociují za vzniku produktu s protein-kinázovou aktivitou Replica plate onlo medium containing X-ga' Colonies stain blue GFP / UASG ß-Galactosidase SNF1 and SNF4 Produced tightly associate funkčně aktivní TF se vytvořil spojením proteinů SNF1 a SNF4 - tj. tyto proteiny vzájemně interagují 36 Genetický důkaz funkce U2 snRNA l/i- i U2-snRNA jsou komponenty částic U1- a Ul-snRNP. Jsou tedy v komple* xu s proteiny, které se uplatňuji katalyticky při sestřihu a plní též strukturální m7G místo_„Y ftyrl nevětvení-"A línovy Všechny uvedené >_— ■■ ■ - intron-_____ sekvence nukleotidů i jsou vysoce konzervativní u S. cerevislae a vyskytuji se též u jiných organizmů s výjimkou trypanozom, které nemají sekvenci GUGUA v U2-snRNA. S. cerevisiae nemá pyrimidinový úsek. (g) Wild-type strain (strain A) U2 snRNA Wild-type U2 gene Inlrcn ItACUAliCA Wild-type intron I I I i I Medium lacking histidine Wild-type U2 snRNA Cells make their own histidine and grow his4 mRNA spliced Pokus prokazuje, že U2 RNA se při sestřihu páruje přímo s intronem. (b) Mutant strain (strain B) Wild-lype U2 gene (c) Mutant strain (strain B} Wild-type U2 gene Mutation Mu,<5ni his4 gene i UACl[A][C» ... ill I II / Mismatch destabilizes RNA hybrid Mutant intron Wild-lype U2 snRNA lacking Cells fail to grow histidine hh4 mRNA not spliced Mutant hh4 gene Introduce plosmid into cells by transformation . m uacaaIica II 111 I I Plasmid wild mutant U2 gene Mutant intron Mutant U2 snRNA Selection for cells containing plosmid Medium lacking histidine \ Replica plate Mutant strain can now make histidine Uii4 mRNA spliced Studium funkce genu po jeho inaktivovaci selekčním markerem pUCl18 URA3 gene YFG = your favourable gene Disrupted gene replaces wild-type gene in one chromosome \ Plate onto medium lacking uracil YFG = gen zájmu, jehož funkci sledujeme, inaktivovaný genem URA3 YFG Other chromosome normal Sporulate Buňky obsahují jednu funkční a jednu nefunkční alelu YFG Dissect tetrads Characterize haploid cells 38 Tetrádová analýza: sporulací dochází k separaci mutantní a standardní alely Spory se nechají klíčit a růst, aby se vytvořily kolonie. Ze čtyř spor dvě ponesou alely standardního typu (YFG) a dvě budou mít alelu YFG přerušenou integrovaným genem URA3. Pokud je knokautovaný gen esenciální pro růst, vyrostou ze čtyř spor z každé tetrády do kolonií jen dvě, a žádná z nich nebude schopna růst na plotnách 39 bez uracilu (protože gen URA3 je pouze v knokautované alele). Rekombinantní proteiny vytvářené v expresních systémech S. cereviasiae VACCINES Hepatitis B virus surface antigen Malaria circumsporozoite protein HIV-1 envelope protein DIAGNOSTICS Hepatitis C virus protein HIV-1 antigens HUMAN THERAPEUTIC AGENTS Epidermal growth factor Insulin Insulin-like growth factor Platelet-derived growth factor Proinsulin Fibroblast growth factor Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor ot! antitrypsin Blood coagulation factor XHIa Hirudin Human growth factor Human serum albumin 40 Kvasinka Pichla pastori s Má schopnost metabolizovat metanol jako jediný zdroj uhlíku a energie Metabolismus metylotrofů umožňuje vytvářet „single-cell" proteiny - krmivo pro dobytek i člověka bohaté na proteiny Heterologní exprese proteinů v metylotrofní kvasince - Píchla pastoris Další druhy: Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha 1. Jednoduché techniky pro genetickou manipulaci u Pichia, podobné jako u S. cerevisiae. 2. Kultivace za definovaných podmínek včetně velkokapacitní kultivace 3. Schopnost tvořit proteiny ve velkém množství, buď intra- nebo extracelulárně (samy tvoří jen málo vlastních exkretovaných proteinů) 4. Schopnost provádět eukaryotické posttranslační modifikace (glykozylace, tvorba disulfidických můstků a proteolytický procesing). 5. Dostupnost tohoto systému pro komerční účely. 42 Vektory pro expresi v Pichia a) jsou kyvadlové (+ E. coli) b) mají markery pro E. coli a pro kvasinky (ura, his, ade atd) c) mají expresní kazetu odvozenou z genu AOX 5'-promotorové sekvence terminátor transkripce mezi promotorem a terminátorem je MCS d) u sekrečních vektorů jsou signály z kyselé fosfatázy (PHO) nebo alfa-MAT (pro transport jsou někdy využívány chaperony) Hostitelské kmeny: nesou auxotrofní mutace pro selekci vektorů jsou proteáza deficientní Expresní vektory jsou často inzertovány do chromozomu Vektory s vícenásobnou kopií cizorodého genu a) kopie genu uspořádány „hlava k patě" b) vektor obsahující gen kanR - amplifikace pomocí G418 43 Metabolizmus metanolu Metanol induktor Alkoholoxidáza AOX1 a AOX2 Buněčné komponenty Formaldehyd + peroxid H dehydrogenázy Formiát + CO, energie Po indukci metanolem je 5 % transkriptů tvořeno genem pro alkoholoxidázu, která dosahuje až 30 % všech proteinů v buňce. Exprese klonovaných genů se zvýší až 1000x. V přítomnosti jiných substrátů (glukóza, glycerol, etanol) je hladina AOX nízká - promotor je přísně regulován (nepropouští) 44 Expresní vektor P. pastoris gen Geny jsou klonovány za silný metanolem indukovatelný promotor genu alkoholoxidázy (AOX1) vložený do expresních vektoru. Syntéza proteinu je spouštěna přidáním metanolu do média, které neobsahuje jiný zdroj uhlíku - metanol tak tvoří jediný zdroj uhlíku 4c Konstrukce vektorů s kopiemi expresní kazety Inserce fragmentu BglII-BamHI do místa BamHI vektoru pA0816 ĚiSI Ewfll ■J-.i Ji Další selekční marker: rezistence ke kanamycinu (geneticinu) - selekce buněk se zvýšenou rezistencí = spontánní amplifikace kazety, vyšší výtěžky produktu 46 Začlenění genu klonovaného v integračním vektoru do specifického místa chromozomu P. pastoris 1 xCO Integrační vektor 5' AOX1 GOI TT H1S4 GOI = gene of interest his4 mutace bis4 -1 5' AOX1 COI TT H_I ■- Chromosome HIS4 2xCO RE [ 5' AOX1 GOI TT HIS4 ■-1 W8r y aoxi Reštrikční fragment vyčleněný z vektoru Chromosome 5' AOX1 aoxi 3' AOX1 5' aoxi GOI TT HIS4 3' AOX1 Chromosome 47 Heterologní exprese genů v P. pastoris Selection of host strain: i wild types * protease-defjcient strains * auxotrophic strains * glyco-engineered strains Genomic integration: ■ single-Zmulticopy * homologous recombination ■ ectopic integration r Promoter: * constitutive ■ inducible Selectable marker: ■ drug resistance ■ auxotrophy 3tf Intracellular protein expression m m * Secretory pathway: * secretion signals: S.c. o-MF, Rp, PH01 « proteolytic processing, e.g.: Kex2p, Ste13p * glycosylation: N- or O-linked * membrane-associated proteins * surface display anchors 5'HR, 3'HR - úseky homologie s chromozomem pro začlenění kazety 48 59 Table 3: Heterologous proteins expressed in P. pastoris Protein Bacteria Bacillus, licheniformis a-amylast Bacillus sietirotkermophilus o-alanine carboxy peptidase Bordetella pertussis pertussis pertactin (P69) Clostridium botulinum neurotoxin (BoNT) serotype A and B Clostridium botulinum neurotoxin heavy chain fragment, serotype B Clostridium botulinum neurotoxin serotype A binding domain Clostridium tetani tetanus toxin fragment C Escherichia coli acid phosphatase/phytase (appAJ) Escherichia coli ß-galactosidase Escherichia coli (3-Iaclamase Leishmania major cathepsin B-!ike protease Staphylococcus aureus staphylokinase Streptococcus equishnilis streptokinase Streptomyces subtilisin inhibitor Streptomyces riridosporus T7A peroxidase, endoglucanase Toxoplasma gondii SAG1 antigen Vibrio cholerae accessory cholera enterotoxin (Acc) Fungi Ahentaria Aft 1 allergen Aspergillus awamori glucoamylase Aspergillus awamori glucoamylase catalytic domain Aspergillus fionigatus catalase L Aspergillus fumigatus dipeptidyl peptidase IV (DPP IV) Aspergillus fumigatus dipeptidyl peptidase V (DPP V) Aspergillus giganteus a-sarcin ribotoxin Aspergillus niger phytase (phyA) Candida guiltiermondii xylose reductase gene (xyll) Candida rugosa lipase 1' (CRL) Fusarium solum pectate lyase (peIC) Fusarium soltini pectate lyase (pelD) '■ Geotrichum candidum lipase isoenzymes < ■ Phytopluhora cryptogea |3-cryptogein Rhizopus ory:ae lipase Saccharomyces cemislae invertase Saccharomyces cererisiae Ktrlp Saccharomyces cergvisiae (a-1,2-mannosyltransferase) Schizophyitum commune vitamin B2-aldehyde-forming enzyme Trametes versicolor [white rot fungus) laccase (led) Trichoderma harzianum 0-(l-6)-gIucanase Comments: mode, amount, signal sequence 2.5 gl"', SUC2 100 mg I-1, native 78 mg r> 390 fig g-1 2.4 mg total 12 gl"' 28.9 U mg"1 2.0xlOJ U mg"1 a-MF 50 mg I-1, a-MF 77 mg r\ . 2.47 g 1 1 total protein, a-MF 12 mg I-1', a-MF 7 mg r1, a-MF .S..O-MF. S, 400 mg I"1, native S, 400 mg I"1, PHOl S, 2.3 g r', PHOl S, PHOl S, 0.15 mg r1. PHOl S, 1 irig-l-1, synthetic native, PHOl S, 65 0" ml"1, a-MF I, 0.65 U mg"1; S, 0.1S U mg"', a-MF S, 150 U ml-1. a-MF ■S, 1 mg rl, PHOl S, native . a-MF PHOl a-MF native Reference [51,60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] m [20] [68] [69] [70] [71] [73] [73] [74] I = intracelulärnf, S = sekretovany S, 60 mg I"', S, 45 mg I.-1. S, 60 mg I"1 S, 2.5 gl"1 S, 400 mg I"1; PHOl S, 40 mg I"1, PHOl S, 120 mg I"1, a-MF S, native and a-MF S, 9.3 mg r1 [751 [76] [47] [77] (78] [79] [431 [801 [81] [42] [82] [83] [84] [85] [86] [30] [87] [87] [S8] [89] [90] 49 Table 3: Heterologous proteins expressed in P. pastoris Protein Protists Chondrus crfspus red alga hexosc oxidase Gracilariopsis lemaneiformis red alga a-l,4-glucan lyase (GLql) Plasmodium falciparum merozoite surface proiein 1 (MSP-1) Plasmodium max apical membrane antigen I (AMA-1) Reticulomyxa filosa (giant freshwater ameba) rx2, [32 tubulin isoforms Trypanosoma cruzi acid a-mannosidase Plants Allium sativum (garlic) alliin lyase Arabidopsis thaliana NADH:nitrale reductase Barley (Hordeum vulgare) sucrose fructan 6-fructosyl transferase Barky a-amylasc 1 Barley a-amylase 2 Barley aleuronc tissue a-^lucosidase Coffee bean a-gakictosidasc Cynara cardwiculus (cardoon) cyprosin Cynodon daciylon (Bermuda crass) Cyn d 1 Galaiuhus nitidis agglutinin Heveti brasitiensis hydroxynitrile lyase Hevea brasitiensis Hev b 7 pataiin-like allergen Maize cytokinin oxidase Oat photochrome A, phA Oat phytochrome A, phyA65 apoprotein Comments: mode, amount, Reference signal sequence I [91] I (92) S..24 mg r', a-MF [93] S, 30 mg r\ PHOl [941 I, 400 Jig's"' [95] S, 11.5 ug l-1, native ' [96] I, 2.167 U g_1 [97] I, JS MS g"1 [98.99] S, a-MF [100] S, 50 mg rl, native [48] S, 1 mg I-1, native [4SI S, a-MF [101] S, 400 mg r!, a-MF [102] S, 1 mg I-1, native [103] S, 1.5 g r1, PHOl [104,105] S, PHA-E [45] I, 22 g 1"' [106] S, 10 mg 1"', a-MF [107.108] S, native [109] I, 30 ug g_l [110.111] I, 20 ug g_l [112] I = intracelulärni, S = sekretovany 51