1 Příprava transgenních a geneticky modifikovaných rostlin a jejich využití ve výzkumu a v praxi 2 • totipotence (protoplasty, kalusy) • schopnost regenerace (klonování), pěstování ve tkáňových kulturách • velký počet semen • krátká generační doba • asexuální křížení (samosprašnost, homozygotní mutanty) • biochemické dráhy poskytující průmyslové suroviny a farmaka Geneticky modelový systém: Arabidopsis thaliana (botanická drozofila) • snadná kultivace, 6 generací za rok • 10 000 semen • velikost genomu 8 x 107 bp (6x víc než kvasinka) • genetická mapa a sekvence genomu • řada dobře definovaných mutant získaných klasickou genetikou • snadná T-DNA mutageneza – vyhledání genů, studium regulace • heterologní hybridizace – identifikace genů v kulturních rostlinách Výhody rostlin při genetických manipulacích 3 • prostřednictvím vektorů odvozených z Ti- plazmidů Agrobacterium tumefaciens • elektroporace (do protoplastů) • biolistická metoda – nastřelování mikročástic kovů s naadsorbovanou DNA • mikroinjekce DNA do protoplastů (třípipetová metoda) • přenos DNA prostřednictvím lipozomů • přenos pomocí virových vektorů (přímá infekce nebo agroinfekce) Způsoby přenosu genů do rostlin 4 Plant cell DNA-delivery methods Method Comment Ti-plasmid-mediated gene transfer An excellent and highly effective system that is limited to a few kinds of plants Microprojectile bombardment Used with a wide range of plants and tissues; easy and inexpensive Viral vector Not an effective way to deliver DNA to plant cells Direct gene transfer into plant protoplasts Can be used only with plant cell protoplasts that can be regenerated into viable plants Microinjection Has limited usefulness because only one cell can be injected at a time; requires the services of a highly skilled individual Electroporation Generally limited to plant cell protoplasts that can be regenerated into viable plants Liposome fusion Can be used only with plant cell protoplasts that can be regenerated into viable plants Protoplasty lze izolovat z pletiv listů, stonků, kořenů, květů nebo i z pylu. 5 Selektovatelné geny pro rostliny Umožňují, aby na selektivních mediích přežívaly jen buňky obsahující transgen. Používají se následující: 1. NPTII (npt) – rezistence ke kanamycinu (neomycinfosfotransferáza II). Kanamycin lze přidávat do media, nebo jej lze přímo aplikovat na rostliny (v místě kapek vznikají léze). 2. APH IV (hyg) – Chimerický transgen pro rezistenci k hygromycinu (hygromycinfosfotransferáza). Antibiotikum blokuje proteosyntézu (silně toxický i pro člověka). 3. Vzácně – rezistence ke streptomycinu, gentamycinu, bleomycinu a methotrexátu (bakteriální geny). 4. Transgeny bar a pat (fosfinotricinacetyltransferáza) ze Streptomyces pro rezistenci k herbicidu fosfinotricinu. 5. Transgen pro rezistenci k manoze. Nový systém. U mnoha rostlin je manoza fosforylována enzymem hexokinázou na manosa-6-P, který dále není metabolizován a je silně toxický. Buňky odumírají. Vnesením transgenu kódujícího fosfomanoza-izomerázu (z E.coli), se mění manoza-6-P na fruktoza-6-fostát, který metabolizován je. 6 N Signální (reportérové) geny rostlin Expresi těchto genů lze snadno detekovat a kvantitativně stanovovat a mohou tudíž sloužit jako měřítko exprese transgenů různými promotory, s různou strukturou, v různých genotypech, různých pletivech a za různých podmínek. 1. Transgen pro chloramfenikolacetyltransferázu (CAT). Bakteriální enzym nepůsobí rezistenci k Clm, protože rostliny jsou přirozeně rezistentní. Enzym acetyluje 14C-chloramfenikol, po přidání extraktu z rostlin se značený Clm přeměňuje na značený acetylovaný Clm, který lze chromatograficky zjistit. Výsledek je možné hodnotit kvantitativně. 2. Transgen pro β-glukuronidázu. Bakteriální enzym E. coli, který se v rostlinách označuje jako GUS. Zatím nejúspěšnější reportérový transgen. Vhodné substráty mění na modré produkty nebo fluoreskující látky. Existují dvě metody detekce aktivity: A. Fluorescenční – provádí se v homogenátu se substrátem MUG. Po ozáření rozloženého MUG dlouhovlnným UV 365 nm dává modrou fluorescenci 570 nm. B. Histochemický – používá se chromogenní substrát X-gluc (glukuronid), který po rozštěpení dává modrou barvu, která je nerozpustná a zůstává v buňkách (používají se segmenty listů, kalusy apod.) Používá se konstrukt genu obsahující intron, který zaručuje, že je detekována jen aktivita v buňkách rostliny, ne v agrobakteriích (kontaminace). MUG = 4-metyl umbelliferyl glukuronid >> 4-metylumbelliferon 7 MUG = 4-metyl umbelliferyl glukuronid >> 4-metylumbelliferon N Signální (reportérové) geny rostlin 1. Transgen pro luciferázu. Využívají se cDNA ze světlušky Photinus pyralis nebo kódující sekvence Vibrio harvei. Po dodání substrátu (luciferin, ATP) k rostlinnému extraktu nebo do kultivačního media dochází k emisi záření měřitelného luminimetrem, scintilačním počítačem, CCD kamerou. Luciferin špatně proniká do pletiv, substrát je drahý. 2. Transgen pro zeleně fluoreskující protein GFP. Gen z medúzy Aeqorea victoria. Protein GFP přeměňuje modré světlo na zelené. Má schopnost emitovat zelené světlo po ozáření modrým světlem (440-480 nm). Je to jediný protein, který má schopnost fluoreskovat bez dodání substrátu nebo kofaktorů. Zachovává si schopnost fluoreskovat, i když je fúzován s jiným proteinem, a to jak na C-, tak i N-konci. Mutacemi byl změněn chromofor, takže fluoreskované světlo může mít různou vlnovou délku. Původní gen se dobře exprimuje i v živočišných buňkách (lépe jak v rostlinách). V rostlinných buňkách je přítomen v jádře více než v cytoplazmě. Existuje i fúzní protein GFP-GUS, který má obě signální aktivity. U A. thaliana bylo prokázáno, že po ozáření rostlin UV světlem lze fluorescenci pozorovat pouhým okem. Vysoká exprese transgenu však může ovlivňovat životaschopnost rostlin nebo schopnost regenerace (nutno ověřit). 8 Hostitel: Agrobacterum tumefaciens, A. rubi, A. rhizogenes (Ri- plazmidy) Ti – tvorba krčkových nádorů (crown galls) Ri – vláskové kořeny (hairy roots) Velikost 150-200 kb Typy Ti-plazmidů (klasifikace podle typu opinů) • nopalinový • oktopinový • agropinový • sukcinamopinový Typy Ri-plazmidů • manopinový • agropinový Charakteristika Ti-plazmidů 9 1. T-DNA (15-45 kb): syntéza fytohormonů, syntéza opinů 2. Geny pro virulenci 3. Geny pro katabolizmus opinů 4. Počátek replikace 5. Geny pro transkonjugaci Geny a funkční oblasti Ti-plazmidů 10 Struktura Ti-plazmidu virA-virG – aktivace transkripce genů vir virA-virB – aktivace genů tra virB2 – pilin (pilus) virD2 – relaxáza, NLS – cílení T-DNA do jádra virE2 – tvorba kanálu v membráně pro vstup T-DNA 11 Struktura Ti-plazmidu 12 Geny pro katabolismus opinů Struktura Ti-plazmidu A. tumefaciens Část plazmidu přenášená do rostliny Geny pro přenos T-DNA do rostlinných buněk Geny zodpovědné za transformaci rostlinných pletiv Geny zodpovědné za tvorbu opinů v rostlinných buňkách 25 bp LB 25 bp RB = sekvence nezbytná pro začlenění T-DNA do genomu rostliny 13 Transformace rostlin navozená Ti-plazmidem Agr. tumefaciens Poraněná rostlina Infekce rostliny bakterií s Ti-plazmidem Přenos T-DNA do rostlinné buňky Začlenění T-DNA do jádra rostlinné buňky opiny Vytvoření krčkového nádoru fytohormony1. 5. 4. 3. 2. T-DNA 14 PRŮBĚH PŘENOSU Ti-PLAZMIDU DO ROSTLINNÉ BUŇKY Geny virulence na chromozomu Geny virulence na plazmidu 15 Přenos cizích genů do rostlin pomocí Ti-plazmidu Živné medium s růstovými faktory Transgenní rostlina přenášející geny do potomstva Protoplast (disky) Ti-vektor nesoucí cizí gen (modifikovaná T-DNA) T-DNA Helikáza (celuláza, pektináza) 16 Inokulace disků agrobakteriemi nesoucími pTi Regenerace listových disků infikovaných Agrobacterium tumefaciens vyříznutí listového disku přenos disků na filtrační papírpomocné buňky tvořící růstové faktory buňky na krajích disku se začínají množit objevují se stonky objevují se kořeny kultivace 2-4 týdny kultivace 2-3 dny regenerovaná rostlina přenos na medium stimulující růst stonků přenos na medium stimulující růst kořenů přesazení do půdy + kanamycin (selekce pTi) + cefotaxim (likvidace agrobakterií) 17 Omezení Ti-plazmidu pro jeho využití jako standardního vektoru 1. Tvorba fytohormonů transformovanými rostlinnými buňkami rostoucími v kultuře zabraňuje jejich regeneraci – proto je třeba geny pro auxiny a cytokininy z vektoru odstranit (výsledný Tiplazmid (vektor) se označuje jako odzbrojený). 2. Gen pro syntézu opinů může negativně ovlivnit růst rostlin – gen je proto z vektoru odstraněn. 3. Ti-plazmidy jsou velké (150-800 kb) – je třeba odstranit úseky, které nejsou pro fungování vektoru nutné 4. Ti-plazmidy se nereplikují v E. coli – do vektorů je třeba začlenit vhodný ori 18 Kointegrační klonovací vektorový systém rekombinace Odzbrojený Ti-plazmid = pomocný plazmid z Ti Klonovací vektor kointegrát E. coli A. tumefaciens Přenos do rostliny 19 Plazmid obsahující T-DNA replikující se v E. coli Plazmid není schopen se v agrobakteriu replikovat Selekce na KanR Obsahuje konjugativní plazmid E. coli Agrobacterium T-DNA Ti-plasmid T-DNA Cloning site NPTII gene for KanR selection in plants Selectable marker for Agrobacterium pBR322 (Ampr) Gene of interest Ligate into cloning site Transform into E. coli Select (Ampr) colonies Intermediární vektor s klonovanou DNA Mate with Agrobacterium konjugace Začlenění plazmidu neomycinfosfotransferáza agrobakterium obsahuje rekombinantní plazmid T-DNA plasmid integrates into Ti plasmid by homologous recombination Intermediate shuttle vector Agrobacterium Infect plant cells Přenos genů do rostlin intermediárním vektorem Triparentální křížení – před zavedením binárních systémů – intermediární a integrativní vektory Smíchají se tři bakteriální kmeny. • E. coli nesoucí pomocný plazmid schopný konjugace • E. coli nesoucí rekombinantní plazmid – vlastní konstrukt s transgenem • Recipientní Agrobacterium, obsahující odzbrojený Ti plazmid, schopný rekombinace s rekombinantním plazmidem přenášeným z E. coli. Během inkubace se konjugativní plazmid přenese z prvního kmene E. coli do druhého kmene E. coli, kde mobilizuje rekombinantní plazmid do agrobakterie. Ani jeden z plazmidů z kmenů E. coli není schopen se v agrobakterii replikovat. V agrobakterii dojde k homologní rekombinaci, během níž se rekombinantní plazmid vloží (přes sekvence pBR322 nebo T-DNA) do rezidentního nerekombinantního Ti plazmidu. Tento kointegrát je pak schopen přenášet T-DNA do rostlin. 20 cell of transgenic plant selekce agrobakterií selekce v rostlině Přenos genů do rostlin intermediárním vektorem a kointegrací Obsahuje oblast vir a defektní nebo žádnou T-DNA 1. Příprava odzbrojeného plazmidu 2. Rekombinace plazmidů 3. Plazmidový kointegrát 21 Binární klonovací vektor odvozený z Ti-plazmidu Chimerický gen neo (NPTII z Tn5) pod kontrolou regulačních sekvencí fungujících v rostlině (nos; 35S) Směr přenosu T-DNA 1. 2. promotor 35S - velmi silný konstitutivní promotor viru CaMV (35S RNA) 22 Sekvenční rozdíly mezi levou a pravou hranicí T-DNA DNA je přenášena do rostliny jako lineární jednořetězcová molekula, a to od pravé hranice (RB) ve směru 5´-3´. Přenos je zahájen zlomy v obou hraničních sekvencích. Integrace do rostlinného genomu závisí na specifických sekvencích umístěných v RB. LB se integračního procesu nezúčastňuje – často dochází k delecím sekvencí z nechráněného 3´konce LB o délce až stovek nt. RB LB 23 Binární vektorový systém (binární vektor) a) s T-DNA sekvencemi b) bez T-DNA sekvencí do rostlin se mohou dostávat geny z bakteriálních plazmidů pJp181 can be mobilized into Agrobacterium by helper plasmid Bin 19 can be transformed into Agrobacterium directly or mobilized into Agrobacterium by helper plasmid in triparental mating pTiAch5 derivative pAL4404 vir genes neo Bin 19 vir functions supplied in trans R border of T-DNA L border of T-DNA Polylinker Bin 19 is derivative of the broad host range plasmid vector pRK252 Odzbrojený Ti-plazmid neo CmR pJP181 mob onT pRSF1010 sequences vir functions supplied in trans pTiAch5 derivative pAL4404 vir genes Odzbrojený Ti-plazmid KanR 24 Přenos antisense-genu pro polygalakturonázu binárním vektorem vir Agrobacterium s pomocným Ti-plazmidem (vir+, nemá T-DNA) 25 Mini-binární vektorový systém 3,5 kb (původní vektor 11,5 kb) TerminátorPromotor Sekvence pro cílení proteinu do mitochondrií nebo chloroplastů Selekční marker Klonování genů v E. coli, pak přenos elektroporací do A. tumefaciens a následně do rostliny Možnost klonování do více RE míst Možnost mobilizace vektoru do agrobactera 26 Modifikovaný vektor YAC používaný pro přenos dlouhých úseků DNA do rostlinného genomu npt (KanR) hyg (HygR) YAC s klonovanou DNA je přenesen biolistickou metodou do rostlinných buněk, transformanti jsou selektováni na KanR a přítomnost úplné délky klonované DNA je ověřena rezistencí buněk na hygromycin. Délka přenesené DNA: 80-550 kb: integrace celé délky prokázána hybridizací – přenos většího počtu genů nebo biosyntetických drah 27 • známo přes 600 typů virů rostlin: většina +ssRNA, jen 25 DNA Výhody: 1. Získání transgenních rostlin rezistentních k virovým infekcím 2. Využití regulačních oblastí virů pro expresi klonovaných genů 3. Infikují i druhy, které nenapadá agrobaktérie 4. K expresi genů dochází i v protoplastech 5. Virus je přítomen v mnoha kopiích, dosahuje se tedy vyšší exprese transgenu (ta je stabilní) Viry s DNA: • Geminiviry: ssDNA kružnicová • Kaulimoviry: dsDNA kružnicová Virové vektory pro přenos genů do rostlin 28 Geminiviry: TGMV – tomato golden mosaic virus • Infikují jedno i dvouděložné rostliny • Virová kapsida má jeden typ proteinu • genom tvořen dvěma typy ssDNA o délce 2,5 kb, které mají stejnou velikost, ale různý informační obsah: A = replikace obou jednotek, plášťový protein, B = přenos v rostlině Přenos možný agroinfekcí nebo transfekcí Kaulimoviry CaMV (cauliflower mosaic virus) • 8 kb dsDNA kruhová, replikuje se reverzní transkripcí • Infekce virem je systemická – dostává se do všech orgánů -105 virů/ buňku • Obsahuje silný promotor: 35S, který je aktivní v řadě rostlin • Klonování cizorodých genů do genu II (týká se přenosu virů mšicemi) • Přenos možný transfekcí, nebo části genomu agroinfekcí Virové vektory pro přenos genů do rostlin 29 = vnášení virů, virových vektorů, nebo viroidů do rostlin pomocí Agrobacterium tumefaciens • virová genomová DNA nebo cDNA se začlení in vitro do vektoru obsahujícího T-DNA, vzniklý konstrukt se přenese do Agr. tumefaciens, kterým se infikují rostliny • v rostlinné buňce není další osud virové DNA závislý na začlenění T-DNA do rostlinného genomu • přenášená virová DNA bývá upravena in vitro (např. odstranění nežádoucích funkcí: patogenita apod.) • do virových vektorů lze umístnit selekční nebo signální markery • přenesená virová DNA se v rostlinách šíří systemicky (do všech orgánů), tj. přenesené geny se mohou exprimovat v celé rostlině • vhodný způsob pro přenos virů, které nelze snadno do rostlin inokulovat mechanicky (viry přirozeně přenášené specifickými přenašeči) Agroinfekce 30 Přenos do rostliny, která již obsahuje DNA B (makroinjekce) DNA A se může v buňkách replikovat samostatně, pro přenos do dalších buněk je však vyžadována DNA B Systemická infekce rostlin rekombinantním vektorem geminiviru přenos DNA mezi buňkami bez obalových proteinů (ty lze nahradit cizími geny) obal, replikace přenos mezi buňkami A B infekce systemické rozšíření vektorových molekul do celé rostliny – ty pak obsahují vysokou hladinu npt (tisíce kopií) vektor se replikuje jako plazmid (dsDNA) Klonování NPTII do DNA A a začlenění celého konstruktu do binárního vektoru funkce Vektory jsou testovány pro vnesení CRISPR/Cas 31 Příklady virových vektorů, jejich vlastnosti a použití (Petrzik, 2002) virus (rod) genom nevýhody výhody, použití Caulimoviry dscDNA nízký výtěžek, úzký okruh hostitelů, velký genom DNA genom Geminiviry sscDNA malý kompaktní genom, omezené systémové šíření DNA genom Virus mozaiky vigny (Comovirus) sslRNA segmentovaný RNA genom vysoký výtěžek, exprese peptidů v chloroplastech Virus mozaiky okurky (Cucumovirus) sslRNA vysoký výtěžek Virus mozaiky vojtěšky (Alfamovirus) sslRNA málo informací o použití Toleruje velké inzerce v chloroplastech Potyviry sslRNA ekvimolární exprese -široký i úzký okruh hostitelů, exprese peptidů i genů Virus mozaiky tabáku (Tobamovirus) sslRNA velmi vysoký výtěžek, exprese peptidů i genů, existuje modulární systém využívající transgenní rostliny X virus bramboru (Potexvirus) sslRNA patentované použití proteázy 2A v konstrukci vysoký výtěžek, exprese genů Satelitní RNA sslRNA málo informací o použití toleruje velké inzerce, exprese genů l = lineární, c - cirkulární 32 • vlastní ct genom: dsDNA, 35-220 kb, desítky kopií genomu. • operonové uspořádání chloroplastových genů – možnost exprimovat více genů z jednoho transkriptu • vysoce ploidní (více kopií genomu) – tisíce chloroplastů • chloroplasty nejsou v pylu, transgen se nebude přenášet při křížení • inzerce DNA do chloroplastového genomu probíhá homologní rekombinací v přesném místě – nedochází k pozičnímu efektu • chloroplastové geny jsou transkribovány chloroplastově specifickými promotory • selekční marker (aadA) – rezistence k spektinomycinu • selekční marker lze eliminovat pomocí cre-lox rekombinace. • přenos DNA biolistickými metodami • vytváření lidských terapeutických proteinů (lidský somatotropin) • rezistence k hmyzu (toxin B. thuringiensis) – není v pylu! Transformace chloroplastů – přenos cizorodých genů 33 34 Vlastnosti transgenu Chloroplastový genom Jaderný genom Počet kopií transgenu Až 10 000 transgenů/buňku 10-100 kopií plastidových genomů/plastid 10-100 plastidů/buňku Málo kopií transgenů Hladina genové exprese Polyploidie vede k vysokému počtu transkriptů transgenu, vysoká akumulace proteinů (až 47% všech rozpustných) Rychlost transkripce je regulována a akumulace cizích proteinů může být nízká Uspořádání genů a transkriptů Geny často v operonech, transkripty polygenní – možnost vložit více transgenů do jednoho operonu Každý transgen vložen nezávisle, transkripty monocistronní Poziční efekt Místně specifická inzerce prostřednictvím HR – poziční efekt eliminován Náhodná inzerce vede k variabilitě genové exprese Umlčování genů Nepozorováno Snížení nebo ztráta exprese transgenu na úrovni transkripčního nebo posttranskripčního umlčení Kontrola šíření transgenu Maternální dědičnost – přirozená bariera šíření transgenu Paternální dědičnost umožňuje přenos transgenu na plevele Posttranslační úpravy proteinů Vytvářejí se disulfidické můstky a proteiny se správně sbalují – ideální pro jedlé vakcíny disulfidické můstky se vytvářejí v ER Toxicita cizích proteinů Nepříznivé vlivy lze minimalizovat Toxické proteiny se akumulují v cytosolu a mohou mít nepříznivé účinky Transgenní linie Uniformní exprese genů Vysoce variabilní genová exprese Homogenita na úrovni ploidie Transgenní linie jsou homoplasmické – dosaženo selekcí Heterozygotní nebo homozygotní (dosaženo samooplozením nebo křížením) Srovnání přenosu genů do chloroplastového a jaderného genomu 35 Selekce homogenně transgenních chloroplastů Každá buňka obsahuje 50-100 chloroplastů, každý obsahuje 10-20 nukleoidů (nehistonových proteinů s omotanou DNA), z nich každý má 5-10 genomů. Jedna buňka tak může obsahovat více než 10 000 plastidových genomů Homoplasmická buňka DNA 36 Stabilní transformace plastidů tabáku Přenos do potomstva maternálně StrR SpR = zelené SpS = bílé S mutantním genem rRNA Spontánní mutanti (záměna homologní rekombinací) Skríning na přítomnost plazmidu s mutantním genem pro rRNA obsahujícím místo PstI Standardní gen Spontaneous SpR plants 56:3 Mutantní gen Presence of new PstI site indicates integration of plasmid-borne gene Selekční místo PstI Rostliny s wt-genem rRNA jsou na mediu se spektinomycinem bílé Mutantní gen SpRSmR 37 Rezistence k herbicidům Rezistence k hmyzím škůdcům a houbám Odolnost vůči suchu a solím Syntéza aminokyselin Fytoremediace (Hg) Biofarmaka Vakcíny, protilátky Guy´s 13 = mouse monoclonal antibody which recognizes streptococcal antigen I/II (SA I/II), a major cell surface glycoprotein of Streptococcus mutans 38 Inzerční mutageneza pomocí transpozonů nebo T-DNA (tagging) • navození identifikovatelného fenotypu a izolace příslušného genu Transpozon nebo T-DNA Inzerce do genomu W.t.organizmus Mutantní organizmus s označeným genem Plazmid „rescue“ Inverzní PCR Genomová knihovna Označený klonPCR klonPlazmid W.t. genomová knihovna Izolace W.t. genu Testování klonu příprava sondy heterologní hybridizace – identifikace a analýza genů v kulturních rostlinách 39 Vyhledání genu zájmu po mutagenezi pomocí T-DNA a) vnesení T-DNA do rostliny b) selekce rostlin s identifikovatelnou mutací (změna fenotypu) „plasmid rescue“: izolace genů sousedících s T-DNA * Izolace rostlinné DNA, štěpení RE, která neštěpí uvnitř T-DNA, cirkularizace, přenos do E. coli Vyhledání wt-genu v genové knihovně a jeho analýza marker pro selekci transformovaných rostlin HindIII BL BR gen pro selekci v bakteriích bakteriální počátek replikace ampR ori nptII HindIII rostlinná DNA T-DNA 4. Transformace ligační směsi do bakterií a selekce na ampicilin HindIII BL BR ampR ori nptII 5. Díky bakteriálnímu počátku replikace se molekula T-DNA s přilehlými sekvencemi chová jako plasmid a lze ji analyzovat klasickými technikami molekulární genetiky 3. Ligace za podmínek, kdy dochází preferenčne k cirkularizaci molekul DNA 40 1. Past na zesilovače • Zesilovače působí na dálku nehledě na orientaci. Inzerce transgenu do jeho blízkosti vede ke zvýšení transkripce transgenu. • T-DNA obsahuje minimální promotor s nízkou aktivitou (proximální část promotoru 35S CaMV) a reportérový gen, jehož produkt musí být kvantitativně hodnotitelný histochemicky (např. GUS). 2. Past na promotory • Reportérový gen neobsahuje promotor a je lokalizován na 5´konci T-DNA. K aktivaci reportérového genu dochází po začlenění pasti za promotor. Pokud reportér nemá iniciační kodon AUG, dochází k translační fúzi, pokud jej má, dochází k transkripční fúzi (omezení: správná orientace reportérového genu, správný čtecí rámec). • Jako reportérové geny se používají: nptII, GUS, luc, GFP Vektory pro inzerční mutagenezi 41 3. Past na geny • Selektuje se integrace pasti do kódující oblasti genu. Kódující sekvence (původního) genu je přerušena a dochází ke vzniku chimerického genu a fúzního proteinu proteinu, který obsahuje část aminokyselinové sekvence původního genu a celou sekvenci reportérového genu. Gen vykazuje aktivitu reportérového genu. • Jsou zde omezení, takže systém funguje jen u některých inzercí. 4. Aktivační mutageneza • Dochází k aktivaci nativního endogenu vneseným zesilovačem transkripce nebo silným promotorem (T-DNA s tetramerním uspořádáním úseku 35S promotoru CaMV). Jsou navozovány dominantní mutace. Vektory pro inzerční mutagenezi 42 1. Inzerční mutageneze – ztráta funkce genu inzercí T-DNA (inzerční inaktivace) 2. Identifikace promotorů fúzí s bezpromotorovým genem NPTII (T-DNA nese reportér) 3. Aktivace tichých genů zesilovačem transkripce nebo promotorem (T-DNA nese zesilovač) „T-DNA tagging“ – využití T-DNA pro charakterizaci rostlinných genů Analogicky lze využít i rostlinné transpozony P rostlinný gen T-DNA T-DNA T-DNA zesilovač 25 bp 43 Použití bezpromotorových reportérových genů k izolaci rostlinných promotorů A. Pokud se T-DNA začlení do genomu rostliny za promotor funkčního genu, lze expresi npt detekovat přímou selekcí KanR transformantů. Nelze ji však detekovat v případě, kdy je promotor aktivní jen během určité fáze vývoje nebo je indukován specifickým faktorem v prostředí B. Kromě bezpromotorového genu npt je do konstruktu vložen gen pro rezistenci k hygromycinu (Hygr) pod kontrolou konstitutivního promotoru. Selektují se transformanti rezistentní k hygromycinu a mezi nimi se hledají ti, kteří za určitých podmínek exprimují gen npt (kde je tudíž tento gen za indukovatelným promotorem). 44 Klonování rostlinných genů po transpozonovém značení Rostlina Antirrhinum obsahující Tam3wt květ Růst při 15°C, dochází k transpozici Samosprášení, získání potomstvaRůzné další mutanty flo 613 Mutant neschopný tvořit květy Izolace genomové DNA z rostlin Flo+ a Flo-, štěpení HindIII a identifikace fragmentů, hybridizujících s Tam3 WT flo-613 Sekvence použité k přípravě sondy pro vyhledání wt genu flo Řízkování, regenerace rostlin Vzácné revertanty tvoří květy, tj. mutace může být způsobena transpozonem Flo- Flo+ Flo-613 Flo+ fenotyp hybridizace – stanovení charakteru genu flo s použitím Flo cDNA jako sondy Ztráta Tam3 vede k reverzi, tj. mutace byla způsobena transpozicí 45 Klonování rostlinných genů po inzerční mutagenezi pomocí T-DNA EMS Mutant ag-1 (homeotická mutace) LB RB NPTII pBR322 Květ Arabidopsis standardního typu: 6 tyčinek, 2 plodoplisty, 4 sepala, 4 petala Zavedení plazmidu do klíčících semen pomocí agrobaktera Ti-plazmid Vypěstování rostlin KanR, vizuální identifikace „ag-like“ mutant gen Ag přerušený T-DNA Mutace ag-2 vznikla začleněním T-DNA do rostliny Mutant ag-2 (má vzhled ag-1) Izolace celkové DNA, štěpení RE v místech S, ligace, transformace E. coli („plasmid rescue“ – naklonování části genu AG) Úseky genu Ag ohraničující začleněnou T-DNA Příprava sondy a detekce wt-genu AG v genové knihovně wt-rostliny Zjištění funkce: cDNA klon – sekvence genu Ag kódující TF SRF a MCM1 Kosmidový klon Zavedení genu AG (wt) do mutanta ag-2 Vnesený gen AG komplementuje mutaci ag-2, rostlina tvoří květy wt typu T-DNA 10 petal (z pestíků), 10 sepal, plodolisty přeměněny v květní lístky 46 • Do rostlinného genomu je pomocí T-DNA vnesena regulační oblast s aktivační funkcí (zesilovač transkripce nebo silný konstitutivní promotor) • jelikož většina rostlinných genů není exprimována konstitutivně (jsou regulovány pletivově-, orgánově- nebo vývojově specifickými signály nebo podněty z vnějšku), dojde po navození aktivace „tichých“ genů k viditelné změně fenotypu rostliny • Příklad: aktivace genů pro tvorbu auxinu (růst protoplastů na mediu bez auxinu – přežívají jen ty buňky, u nichž došlo k začlenění T-DNA se zesilovačem transkripce do blízkosti auxinového genu) Identifikace a izolace rostlinných genů genovou aktivací 47 • integrace cizích genů a sekvencí do rostlinného genomu je většinou náhodná – dochází i k integraci do heterochromatinu a pozičnímu efektu, kdy se exprese transgenu postupně snižuje a po několika generacích se zcela inaktivuje (i když je v genomu). • geny jsou často umlčovány – silencing (např. metylací) • nastává degradace RNA (transkriptů) – RNázy, interference apod. • dochází k sestřihu i mimo standardní signály sestřihu, např. i v oblastech, kde je hodně uridinu. • odlišné využívání kodonů, chybění tRNA. Problémy spojené s přenosem genů do rostlin a jejich expresí Cílená integrace genů (gene targeting) homologní rekombinací k záměně standardních genů za mutačně pozměněné – nízké frekvence – 10-5 až -4 (Experimentálně se HR sleduje v systému protoplastů, což umožňuje sledovat statisíce buněk najednou.) 48 Procesy RNAi (RNA interference) – obrana proti virům a retroelementům. • transgen je přítomen, ale od počátku není aktivní • postupná ztráta aktivity transgenu • postupná ztráta nejen transgenu, ale i homologického genu rostliny Normálně je v daném pletivu aktivní asi ¼ genů, ostatní jsou spící (silent genes) Ztráta aktivity transgenu 49 Lze rozlišit několik typů ztráty aktivity (umlčování) transgenů: • Polohový (poziční) efekt, známý z klasické genetiky – lokalizace na chromozomu rozhoduje o aktivitě genu. • Kosuprese – epigenetická inaktivace. Zahrnuje vztahy mezi DNA-DNA, DNA-RNA a RNA-RNA. Podstatou je hybridizace homologních oblastí. Uplatňuje se hlavně při větším počtu kopií transgenu. Angl. HDGS: homology dependent gene silencing. Dělí se na dva typy: • transkripční inaktivace (TGS) – k transkripci nedochází. Geny získávají metastabilní stav, se změněným obrazem metylace a změněnou strukturou chromatinu. • posttranskripční inaktivace (PTGS) – RNA interference - k transkripci dochází, ale mRNA se v cytoplazmě neobjevuje. Dochází k degradaci většiny mRNA, která je dostatečně shodná se sekvencí, jež je příčinou PTGS. Předmětem působení nukleáz jsou dsRNA – ty vznikají tak, že se transgen začlení v několika kopiích a některé jsou obráceně orientované, čímž vzniká antisense RNA. U rostlin existuje enzym RNA-dependentní RNA polymeráza (amplifikace dsRNA). Ztráta aktivity transgenu 50 • Zvláštností PTGS u rostlin je její schopnost se šířit po rostlině a působit sekvenčně specificky, takže jsou inaktivovány jen homologické geny s transgenem, který inicioval inaktivaci. Inaktivace (systeme acquired silencing, SAS) je založena na signálních molekulách (asi RNA), které putují z jedné buňky do druhé prostřednictvím plasmodesmat nebo na dlouhé vzdálenosti floemem (pokusy s roubováním – změna barev u květů rostlin). Pravděpodobná příčina: RNAi • Další změny mohou být navozeny metylací, která vede ke změnám transkripce transgenů. Ztráta aktivity transgenu 51 • Analýza genomu: Vytváření mutací inzerční mutagenezí, vyhledávání a izolace genů, promotorů, zesilovačů transkripce • Vnášení nových genů ovlivňujících agronomické a agrotechnické vlastnosti rostlin • Vnášení nových genů pro produkci cizorodých látek • Potlačení exprese genů pomocí GI-konstruktů (epigenetické procesy) Praktické aplikace: Možnosti genových manipulací u rostlin 52 53 A. Potraviny a krmiva • Ovlivňování agronomických vlastností • rezistence k herbicidům, • rezistence k patogenům (hmyzu, virům, plísním apod.) • tolerance ke stresům (vodní stres – sucho, mráz; osmotický stres – zasolení půd) • Modifikace posklizňových vlastností • prodloužení skladovatelnosti • zpomalení zrání a navození rezistence k skládkovým chorobám • vylepšování nutriční hodnoty a chuti • Zvýšení obsahu nedostatkových amk (lysin, metionin) B. Produkce nových látek a sekundárních metabolitů • studium a přenos genů pro klíčové enzymy biosyntetických drah • farmakologické přípravky (vitamíny, vakcíny, protilátky aj). C. Technické plodiny • produkce škrobu a olejů pro průmyslové využití • biodegradovatelné plasty D. Bioremediace • Odstraňování škodlivin z prostředí Využití genového inženýrství u rostlin 54 Some antibodies and antibody fragments that have been produced in plants Host plant Antigen 55 Some of the therapeutic agents produced in transgenic plants Protein Plant(s) Application 56 Srovnání tvorby rekombinantních proteinů v různých organismech Další výhody rostlin: - levné pěstování, které není ovlivněno kapacitou fermentorů - snadná skladovatelnost: v semenech vydrží cizorodé proteiny dlouhou dobu 57 Rostliny rezistentní k hmyzím škůdcům Promotor Ligace Binární vektor Terminátor Bacillus thuringiensis Klonovaný gen pro toxin Štěpení restrikčními enzymy Fragment genu kódující aminokyseliny 454-615 Přenos do Agrobacterium Infekce rostlin Regenerované transgenní rostliny exprimující vysoké hladiny Bt toxinuNapadení larvami hmyzu List z rostliny, usmrcující larvy, zůstává nepoškozen List z kontrolní rostliny je napaden Syntetický gen pro toxin kódující aminokyseliny 1-454 Záměna kodonů 75 kb plazmid CaMV promotor 58 BT-toxiny - delta toxin ~ Cry proteiny – parasporální krystaly Some properties of the insecticidal toxins from various strains of B. thuringiensis B. thuringiensis strain or subspecies Protoxin size (kDa) Target insects Serotype berliner 130-140 Lepidoptera 1 kurstaki KTO, HD-1 130-140 Lepidoptera 3 entomocidus 6.01 130-140 Lepidoptera 6 aizawai 7.29 130-140 Lepidoptera 7 aizawai IC 1 135 Lepidoptera, Diptera 7 kurstaki HD-1 71 Lepidoptera, Diptera 3 tenebrionis (san diego) 66-73 Coleoptera 8 morrisoni PG14 125-145 Diptera 8 israelensis 68 Diptera 14 Smrk ztepilý rezistentní vůči kůrovci 59 Vložení genu pro protoxin Cry2Aa2 do genomu chloroplastu Homologní rekombinace Geny rbcL a accD se vyskytují jen v jedné kopii Geny aadA a Cry2Aa2 jsou pod kontrolou konstitutivního promotoru rrn aadA – rezistence ke spektinomycinu a streptomycinu. Výhody: -Gen pro protoxin nemusí být modifikován, obstará chloroplast (prokaryotický charakter) -Dosahuje se vysoké dávky produktu (mnoho genomů v ch.) -Chloroplasty nejsou v pylu, tudíž se nepřenáší na jiné rostliny -Nevýhoda: chloroplasty nejsou v plodech a stoncích a některý hmyz se tak s BT-toxinem nesetká Začlenění do intergenové oblasti zabraňuje inaktivaci některého z genů 60 Mechanismy navozující rezistenci k herbicidům 1. Inhibice příjmu herbicidu 2. Nadprodukce cílového proteinu, na nějž herbicid působí (jeho množství je pak takové, že zajišťuje svou funkci i za přítomnosti herbicidu 3. Snížení schopnosti cílového proteinu vázat herbicid 4. Vybavit rostliny schopností herbicid metabolicky inaktivovat 61 Some examples of gene-based herbicide resistance Herbicide(s) Mode of development of herbicide resistance Roundup 5-enolpyruvylshikimát-3-fosfát (EPSP) syntáza 62 Some examples of gene-based herbicide resistance Herbicide(s) Mode of development of herbicide resistance 63 Zavedení genu pro plášťový protein viru mozaiky okurky do rostlinné buňky RNA4 kódující plášťový protein Začlenění cDNA pod kontrolu P35S a tRBC (RUBISCO) V rostlinách vzniká plášťový protein, rezistence k vysokým koncentracím virů V rostlinách vzniká antisense RNA – rezistence k nízkým koncentracím virů PR-proteiny (angl. pathogenesisrelated) indukované infekcí virů a viroidů, ale také bakteriálními a houbovými patogeny. Je to skupina většího počtu heterogenních proteinů, které byly studovány především u tabáku, ale také u dalších druhů. 64 Some transgenic plants engineered to have viral coat protein-mediated protection against viral infection Viral source of coat protein Transgenic plant 65 Způsoby odstraňování selekčních markerů z DNA 1. Kotransformace selekčního markeru a genu zájmu, křížení potomstva segregace genů 4. Po začlenění plazmidu do chloroplastové DNA homologní rekombinací je při následné kultivaci bez selekčního tlaku selekční marker odstraněn homologní rekombinací mezi 174 bp-DR 2. Selekční marker je transponován do jiného místa v genomu, pak křížení potomstva 3. Po selekci transformovaných rostlin je selekční marker při další kultivaci vyčleněn Zygosaccharomyces rouxii, cre-lox aj. Selekční marker Gen zájmu 66 induktor Konstitutivní exprese TetR proteinu tetracyklin Protein inaktivuje klíčivost semen Terminátorový systém vedoucí k neklíčivosti semen Vazba proteinu TetR na tetO CRE protein se netvoří Blokující sekvence se nevyštěpí K expresi RIP nedochází Semena klíčí 67 Terminátorová technologie pro přípravu sterilních semen • před prodejem prodejce aplikuje tetracyklin na semena a prodá je farmářům Bez aplikace tetracyklinu lze získávat klíčivá semena a rostliny opakovaně pěstovat Farmář vypěstuje ze semen rostliny, ale semena těchto rostlin jsou sterilní 68 Metoda využívá 3 transkripčních funkčně spjatých jednotek: První obsahuje segment kódující RIP (ribozomový inhibiční protein), jehož exprese vede k pletivově-specifické inhibici translace. Exprese RIP je řízena dvěma mechanismy: a) použitím dočasně aktivního promotoru LEA (late embryogenesis abundant). Tento promotor se stává aktivní jen v pozdním stadiu embryogeneze semen, čímž je exprese RIP omezena nejen na embryonální pletivo, ale je omezena též na určité stadium jeho vývoje. Aby se umožnila germinace (klíčení) rostlin, obsahuje tento gen blokující sekvenci umístěnou mezi promotor a RIP sekvenci. Přítomnost této sekvence zabraňuje expresi letálního fenotypu, což umožňuje distributorům opakovaně pěstovat tyto rostliny před prodejem semen farmářům. b) místně specifický rekombinanční systém CRE/LOX odvozený z fága P1 zprostředkuje odstranění blokující sekvence a tím expresi RIP- proteinu. 69 Druhá transkripční jednotka kóduje CRE protein a je pod kontrolou reprimovatelného promotoru tetO. Kontrola tohoto promotoru je zprostředkována systémem Tn10 (třetí TJ). Navození exprese CRE a tím indukce exprese RIP je dosaženo externím stimulem, jímž je tetracyklin. Tetracyklin se váže na TetR represor, tím jej uvolňuje z promotorového místa tetO, což vede k expresi CRE proteinu. Když se na semena působí tetracyklinem hned po skončení embryogeneze (tj. po časovém období, v němž je RIP exprimován), umožní se klíčení semen a vznik dospělých rostlin, které budou tvořit semena exprimující RIP, v důsledku čehož budou tato semena sterilní. 70 Method 2: Creation of sterile, hybrid plants Involves cross-breeding of 2 fertile transgenic, parental plants containing the following transgenes: • LEA promotor • 34-bp LoxP excision sequences • blocking sequence • RIP coding sequence RIP protein RIP protein RIP protein germination-specific promotor CRE recombinase sequence 5´ 3´ 5´ 3´ Hybrid seeds CRE expressed after embryogenesis, so hybrid seeds survive 71 Dosažení sekrece proteinů kořeny rostlin A, B. Signální peptid proteinázového inhibitoru tabáku C. Signální peptid lidské alkalické fosfatázy „Rhizosekrece“ – Hydroponická kultura transgenní rostliny sekretující cizorodý protein do apoplastu buněk a následně do prostředí Normálně sekretované: nízkomolekulární látky (aa + cukry) – kořenové exudáty (výživa bakterií) Experimentálně dosažená exkrece různých proteinů v kořenech rostlin Listové exudáty (gutace)P mas2´= mannopin-syntáza 72 Cílené změny exprese mRNA mRNA stearoyl-ACP-desaturáza Inhibice exprese mRNA: 1. Dodání přídatné kopie genu (kosuprese) 2. Vložení antisense-verze genu 3. Použití ribozymů se sekvenčně-specifickou endoribonukleázovou aktivitou Inhibice ribozymem oleje na pečení, margarín Modifikace biosyntetické dráhy mastných kyselin u kukuřice Acetyl-CoA + malonyl-CoA Palmitic acid 16:0 Stearic acid 18:0 Oleic acid 18:1 73 1. Nepříznivý vliv genů pro rezistenci k antibiotikům používaných jako selekční markery 2. Vznik nových druhů plevelů, zvýšení plevelného charakteru současných plevelů 3. Vznik nových typů rostlinných virů nebo viroidů jako důsledek rekombinace s viry používanými pro přenos transgenu (transenkapsidace) 4. Produkce látek toxických nebo alergenních pro člověka, zvířata nebo přírodní společenstva Potenciální rizika spojená s pěstováním transgenních rostlin 74 Inhibice RNA-dependentní-RNA polymerázy viru TBS viru scFv protilátkou Rostlina tvoří protilátku, která rozpoznává epitopy na RNA-polymerázách několika různých RNA-virů, čímž brání jejich replikaci. TBS - Tomato bushy stunt virus 75 Využití amiRNA k navození rezistence rostlin vůči virům Prekurzor o délce 273 nt označený Pre-miR159a přirozeně se vyskytující miRNA dlouhé 20-24 nt je naklonován. Následně je pomocí PCR změněna část sekvence Pre-amiRNA. Takto připravená sekvence amiRNA je naklonována do binárního vektoru za promotor S35 a vnesena do rostlin Arabidopsis, které pak vytváření pre-amiRNA – ta je upravena a štěpí virovou RNA. Je možné zařadit dva nebo více genů pro různé amiRNA do tandemu a tím cílit na více druhů virů. Lze cílit jan na genomovou RNA, tak na mRNA virů. amiRNA = artificial miRNA 76 Do jádra rostlinné buňky vstupuje ssDNA, která vytváří dsDNA jako replikativní intermediát, který se dále replikuje mechanismem otáčející se kružnice Uvnitř jádra se z exogenní DNA vložené do rostliného genomu syntetizují sgRNA a protein Cas9. Vytváří se kopmplex CRISPR_Cas9, který štěpí replikativní formu dsDNA před nebo během její replikace, což zabraňuje vytváření genomové ssDNA. Použití systému CRISPR-Cas9 k navození rezistence vůči geminivirům 77 Vložení genu pro protoxin Cry2Aa2 do genomu chloroplastu Homologní rekombinace Geny rbcL a accDse vyskytují jen v jedné kopii Geny aadA a Cry2Aa2jsou pod kontrolou konstitutivního promotoru rrn aadA – rezistence ke spektinomycinu a streptomycinu. Výhody: -Gen pro protoxin nemusí být modifikován, obstará chloroplast (prokaryotický charakter) -Dosahuje se vysoké dávky produktu (mnoho genomů v ch.) -Chloroplasty nejsou v pylu, tudíž se nepřenáší na jiné rostliny -Nevýhoda: chloroplasty nejsou v plodech a stoncích a některý hmyz se tak s BT-toxinem nesetká Začlenění do intergenové oblasti zabraňuje inaktivaci některého z genů 78 79