&AC/PAC knihovny a jejich využití pro FISH techniku Metody používané v Laboratoři molekulární cytologie a cytometrie BFU, Brno Co to jsou BAC/PAC klony? BAC (Bacterial Artificial Chromosome) PAC (P1 Artificial Chromosome) YAC (Yeast Artificial Chromosome) uměle syntetizovaná plazmidová DNA, kterou lze vložit do „organizmu" vektor x klonovací vektor podílely se na mapování lidského genomu klonovací kapacita až 500 Kb, mohou nést celé lidské geny v kvasince se udržují relativně stabilně v 1 nebo více kopiích ale při manipulaci problémy (nestabilita, přeskupování DNA, tvorba chimér s cizorodou DNA, malé výtěžky), nižší účinnost transformace BAC systémy - 1 • struktura odvozena od F-plazmidů bakterie Eschericha coli • klonovací kapacita 50-350 Kb • v buňce v nízkém počtu kopií (1-2) • vysoká strukturální stabilita v buňce E. coli, schopnost udržet vloženou DNA, snadná manipulace s DNA • snadná izolace díky kruhové plazmidové struktuře (alkalická lyže, sloupcová chromatografie) • tvorba chimér méně častá než u YAC BAC systémy - 2 dobrá izolace díky selekčním znakům (př. gen pro rezistenci na antibiotika, přítomnost lacZ) vektory dále obsahují: místa pro reštrikční enzymy, geny pro regulaci parA a parB, klonovací místa (H/ncflII, BamH\) Bacterial F' plasrrid iscu: within facľ gene with restrictior enzymes Gene of interest is cut out using restriction enzyme P plasmid and gene of interest ligate BAL 1 Cells are plated on X-gal/ PTG medium I White colonics arc composed o" trans'ormed hcZ "cells Nevhodný vektor odvozen od bakteriofága A (nebyl vhodný pro mapování savčího genomu) proto vyvinuty P1 vektory a PAC systémy (odvozeny od temperovaného fága P1) P1 vektor se skládá ze 2 domén: adenovirový fragment (plní fágové kapsidy DNA) a P1 lytický replikon (spouští amplifikaci plazmidové DNA) PAC systém má místo adenovirového fragmentu plazmid pUC povahy (zvyšuje výtěžek DNA) je to kombinace P1 vektoru a bakteriálního vektoru klonovací kapacita 130 - 150 Kb menší stupeň chimérizmu (jako u BAC), vyšší účinnost transformace, ale složitější příprava vektorů Využití klonovacích vektoru fyzikální mapování, analýza a sekvenace nejen savčího genomu příprava DNA sond pro FISH techniku detekce různých poruch genetické informace (delece, inzerce, ...) detekce nádorových buněk studium struktury chromatinu v buňkách tvorba genomických knihoven klinické využiti Genomické knihovny zásobárny klonů s různými vloženými úseky sekvenované genomické DNA konstrukce knihoven: různý postup v závislosti na typu vektoru hledání v knihovnách: pomocí sond a) pro vyhledávání sekvencí DNA b) pro vyhledávání produktů hledaných genů Konstrukce BAC knihoven linearizace vektoru restrikčními enzymy a ligace s naštěpenou genomickou DNA produkt elektroporací vnesen do E. coli a transformanty selektovány na plotnách s antibiotikem nebo IPTG a X-gal vybrané transformanty jsou řazeny do mikrotitračních destiček vektory pomnožovány v kmenech E. coli s poruchou rekombinace (DH5a, DH10B) Klonování do BAC vektoru asi nejpoužívanější je vektor pBeloBACH postup: linearizace vektoru, ligace s fragmenty genomické DNA, elektroporace nebo chemická transformace do E. coli selekce a uchování (LB médium s antibiotikem a 30% glycerolem na -70°C nebo vpich do média při RT) izolace DNA z transformantů její analýza (PFGE, PCR) Vektor pBeloBAC 11 (klastr globinových genů) 5'HS: 5 4 3 2 1 -IS -10,9 214 -14,7 -6,1 5 HS: 1 +21,3 PAC 4396 (ISO Kb) I I 1 G Y AY VP 5 Eco RV Differentiation of human hemopoietic cells into erythroid pathway Hostitelská buňka • Escherichia coli (G-, Enterobacteriaceae) • vhodný modelový organismus protože: - je dobře znám jeho genom - nenáročně se kultivuje, rychle roste, produkuje početné potomstvo - obsahuje F-faktor (konjugativní plazmid o velikosti 100 Kb, který odpovídá za přenos genetické informace z F+ do F- buňky), v buňce je ve 2 formách (plazmid a Hfr) Příprava DNA sondy nejprve izolace DNA z příslušného BAC nebo PAC vektoru pomnoženého v E. coli izolace klasickou metodou s vlastními r roztoky nebo izolačním kitem izolace kitem je výhodnější (větší výtěžek, odstranění bakteriální DNA) Schéma izolace DNA pomocí QIAGEN Large Construct Kit lyzační pufry rozruší buňky isopropanol vysráží DNA etanol přesráží DNA kolonky odstraní bateriální DNA a RNA následuje měření velikosti a čistoty DNA pomocí gelové elektroforézy a spektrofotometrie QIAGEN Large-Construct Kit Proceduře Pelleted bacteria 1 Alkaline lysáte I Clear lysáte Isopropanol precipitate fi^í Collect DNA by centrifuga Hon ^ Exo nuclease digestion I Bind DNA Wash Elute T 1 Isopropanol precipitate Collect DNA by centrifugal i on Genomic DNA-free ultrapure plasmid DNA Nick-translace vlastní příprava sondy inkorporací např. digoxigeninu do DNA nick-translační kit obsahuje 2 enzymy: - DNáza I 200-500 bp - E. coli polymeráza I každý 20.-25. nukleotid je modifikován DIG-dUTP vznik fragmentů o velikosti 200-500 bp NICK TRANSLATION Nick translation Fig 1 : n.jne nicks I tie double stranded D-WA E.CoM Pel t has 5'-3" exonuclcase activity has 5-3' polymerizing Activity tnd labeling o! IfagrPtenlS 5' 3' 3" 1 5- ▼ 3" PCR Fig 2 Taq pol Incorporate nut: leo tldeg along the entire length of the DMA. Hlfrtii*r IfliH-'lltio