Wilhelm Roentgen 1895 – objev X záření V listopadu 1895, na Universitě ve Wurzburgu, zkoumal Wilhelm Roentgen světélkující fluorescenční stínítko. Fluorescence v něm byla indukovaná katodovými paprsky, jež vznikaly po dopadu elektronů na katodu ve vakuové trubici (obr. 21). Zjistil, že fluorescence nemizí ani při zaclonění trubice černým papírem a usoudil, že se jedná o neviditelné záření nazvané později paprsky X (Roentgenovy paprsky). Když vložil Roentgen mezi lampu a stínítko ruku, uviděl ke svému velkému překvapení kosti prstů. Objev radioaktivního záření Henri Becquerel 1896 – přírodní radioaktivita, vystavoval uranovou rudu slunečnímu světlu a zkouman luminiscenci Marie a Pierre Curie – studovali uranovou rudu a její záření, objevili radium a polonium Roentgenovo záření Vzniká v rentgence při dopadu elektronů na anodu nebo antikatodu. Většinou anoda slouží pro vytvoření elektrického pole a vkládá se další elektroda – antikatoda pro dopad elektronů, kde se tvoří záření. Dole je anoda, nahoře katoda, uprostřed antikatoda odkud vychází záření Druhy záření Elekromagnetické záření – různé druhy dle vlnové délky, patří zde γ-záření Částice – nabité a neutrální, přírodní radioaktivita α a β Elekromagnetické záření 1) radiové vlny – zdrojem jsou elektrické obvody 2) mikrovlny – magnetron v troubě (rezonance v dutině vyvolaná proudem elektronů) 3) infračervené světlo – vzbuzené atomy (zahřátím), žárovky, Slunce 4) viditelné světlo (380-760nm) – buzení atomů na větší energii (teplo, proud elektronů), známé zdroje světla (žárovky, zářivky, výbojky, Slunce apod) 5) ultrafialové záření – A (320-380 nm), zdroje jsou halogenové výbojky, UV zářivky, Slunce 6) ultrafialové záření – B (280-320 nm) jako UV A (na Zemi neprojde přes ozonovou vrstvu) 7) ultrafialové záření – C (<280 nm, do oblasti nm) zdroje – jako UV A, Slunce, může ionizovat 8) záření X (nm - desetiny pm)– Roentgenová trubice (charakteristické a brzdné), elektronový synchrotron 9) gamma záření – atomové jádro, vesmírné záření (od pm do setin pm) Partikulární záření (nabité nebo neutrální částice) 1) Jádra všech prvků a jejich izotopů (protony, deuterony, atd). Částice mohou mít kladný i záporný náboj (podle počtu elektronů) 2) Elementární částice – leptony, mesony a baryony Leptony – elektron a positron, neutrino a antineutrino, miony Mesony – meson pí, meson K Baryony – proton, neutron, hadrony Zdroje záření Přírodní – terestriální záření (rozpadové řady) kosmické záření (sluneční a galaktické) Umělé – reaktory, urychlovače, terapeutické ozařovače, atomové bomby atd Záření vždy bylo a je součástí životního prostředí člověka. Existuje celá řada zdrojů radioaktivního záření a lze je dělit z různých hledisek. Nejčastěji se používá dělení na přírodní a antropogenní zdroje. Mezi přírodní zdroje patří zejména terestriální záření, které vzniká většinou z rozpadových řad a kosmické záření. Člověk vytvořil mnoho zdrojů záření: od Roentgenovy lampy, přes reaktory a urychlovače až po terapeutické ozařovače. V praxi se záření používá v řadě oblastí lidské činnosti jako např. v energetice, výzkumu, medicíně, apod. Popíšeme stručně nejčastější zdroje ionizujícího záření. Co přineslo záření člověku – léčebná terapie Prakticky od objevu radioaktivního záření je toto záření využíváno k léčbě nádorových onemocnění. První úspěšná léčba byla uskutečněna u 49-leté pacientky s basaliomem kůže na nose. Pacientka byla ozařována ve více než 100 frakcích, v průběhu 9 měsíců. Poté žila ještě 30 let. Vespod je pacient, u něhož byl vyléčen spinocelulární karcinom. Mnoho pacientů v té době žaslo nad blahodárným vlivem záření. Nutno zdůraznit, že bez ozařování by většina z nich beznadějně zemřela. Co přineslo záření člověku – léčebná terapie Na začátku 20. století byla terapie zářením prováděná velmi jednoduchým způsobem. Na obrázku je Riederová terapeutická místnost v Mnichově – současně bylo ozařováno několik pacientů. Terapie byla doprovázena jiskrami, praskáním a kouřem, ale byla účinná. Škodlivé účinky záření Experimenty se zářením. Kromě léčebných účinků se brzo přišlo na to, že záření může člověku velmi vážně ublížit. Sama Marie Curie na svou práci se zářením doplatila. Již v roce 1920 pociťovala silnou únavnost a závratě. V roce 1930 onemocněla nevyléčitelnou anémií a 4 roky poté zemřela v horském sanatoriu, kde byla léčená. Vzhledem k neviditelnosti záření však mnozí dlouho nechápali jeho škodlivost nebo ji brali na lehkou váhu. Tak v období studené války došlo k řadě případů zneužití záření a jak v Rusku, tak v USA. Dokumentuje to zpráva D.O.E. „Human Radiation Experiments“. Tak např. byl v průběhu 2 let podávána 829 ženám plutoniový kokteil s komentářem typu – budete se cítit lépe. Fyzici mnohdy pracovali s nadšením bez ohledu na své zdraví i zdraví jiných. Tak např. dr. Slotin zemřel po experimentování se dvěma hemisférámi plutonia, které ručně posunoval k sobě dokud neucítil atomovou reakci. Když mu sjel šroubovák, reakce přešla v intenzívní záři a Slotin oddělil obě hemisféry ručně od sebe. Zemřel po 9 dnech. Vznik bodových mutací po ozáření Přímé a zpětné mutace. U přímých mutací dochází ke ztrátě funkčního proteinu v důsledku změny genetického kódu. Tyto mutace lze detekovat na vhodných půdách, např. mutace lac+ → lac- lze detekovat na půdě s tetrazoliem, mutace v lacI genu (což je represor lac systému) lze detekovat na půdě s X-galem, což je substrát pro βgalaktosidázu. Defekt v lacI genu vede ke vzniku konstitutivní mutace a syntéze galaktosidázy i bez přítomnosti laktózy. X-gal způsobuje modré zbarvení mutovaných buněk. Tato metoda je vhodná pro detekci malého počtu mutací, neboť modré kolonie jsou vidět na pozadí velkého počtu bílých kolonií. Při pozorování pod mikroskopem lze detekovat několik mutovaných kolonií na 105 normálních (bílých) kolonií. U zpětných mutací se používají půdy, na kterých původní buňky nerostou (např. pro bakterie s defektem v syntéze histidinu se použije minimální půda bez histidinu. Protože pro fixaci mutací je potřeba, aby se buňky alespoň několikrát podělily, přidává se nepatrné množství aminokyseliny. Vznik aberací po ozáření Detekce aberací (standardní experiment): 1) izolace lymfocytů (odběr od donora, centrifugace a separace na ficolu, příprava na ozařování 2) resuspendování do média, stimulace k dělení, kultivace 48-72 h, zastavení cyklu colcemidem, hypotonický roztok, fixace kyselinou octovou a metanolem, kapání na vymražené sklíčko, BUdR – lze odlišit první mitózu (světlá a tmavá část chromatidy) 3) barvení (Giemsa nebo FISH) pozorování pod mikroskopem, vyhledání mitóz a jejich vyhodnocení Na obrázku je příklad aberace typické pro záření – dicentrik se dvěma páry fragmentů. Dole – translokace v interfázi. Účinek záření na organismy Rozlišujeme deterministické účinky – existuje práh, velké dávky, rychlý nástup Stochastické účinky – bezprahovost, malé dávky, pozdní efekt Účinek záření na tkáně lze vysvětlit přežitím kmenových buněk tkáně (určité reakci tkáně odpovídá určitá hodnota přežití). Podobně účinek záření na úrovni organismu lze redukovat na poškození určité tkáně, tedy opět na přežití buněk. Akutní nemoc z ozáření – rozlišujeme tři formy podle velikosti dávky a podle příznaků: - dřeňová forma (poškození krvetvorby) - gastrointestinální forma (poškození střevního epitelu) - neurovaskulární forma (poškození cév mozku) Stochastické účinky zahrnují kancerogenní působení záření a genetické účinky (vliv záření na zárodečné buňky a plod). Stochastické účinky záření na organismy Karcinogeneze – zdroje informace jsou experimentální zvířata, transformace buněk, ozářená populace lidí (náhodně, v uranových dolech, v domcích s radonem, po Černobylu, po bombardování Hirošimy a Nagasaki). Zhoubné nádory jsou charakterizovány: - transformaci buněk, které nereagují na kontrolní mechanismy regulující růst - schopností invazivního růstu - tvorbou metastáz Vznik nádorů – uznávaná je tzv. klonální teorie, kdy nádor vzniká z jediné buňky, jež změní své genetické vlastnosti tak, že má růstovou výhodů a vytvoří klon. V něm dojde k další mutaci atd. tak , až se odblokují reakce na okolní kontrolní signály a dojde ke nekontrolovanému dělení. Ve prospěch jednobuněčné teorie svědčí – podobnost nádorových buněk co se týče enzymatické a genetické výbavy, přítomnost imunoglobulinů. V průběhu progrese nádoru dochází ke vzniku dalších subklonů s odlišnou genetickou výbavou. Radiolýza DNA – detekce zlomů v DNA Jednou metodou je „unwinding technika“, která využívá řízené denaturace DNA v zásaditém prostředí, kdy při přesně stanoveném pH a změřené době dojde k oddělení určitého úseku dvoušroubovice. Čím více bude zlomů v DNA, tím rychleji dojde k úplné denaturaci všech molekul. Měří se nakonec frakce dvojřetězové DNA použitím vhodné barvičky. Tato metoda je citlivější než sedimentační technika a umožňuje pracovat s dávkami blízkými „fyziologickým“. Metoda vyžaduje pečlivou kalibraci. Další metodou pro měření DSB je pulsní elektroforéza, do které byly vkládány velké naděje. U pulsní elektroforézy se střídá elektrické pole pod určitým tupým úhlem a lze programově řídit jak velikost pole, tak úhel a dobu pulsů napětí. Molekuly DNA se v gelu nejprve orientují a teprve poté se začnou pohybovat. Při změně orientace napětí dochází k re-orientaci, která zabere určitý čas, jenž je větší pro větší molekuly. Typy poškození bazí Ztráta báze Výpočet produkce zlomů DNA po ozáření Závislost pravd. vzniku zlomu na sekvenci DNA – byl ozařován fragment DNA a analýzována produkce zlomů v daném místě. Pravděpodobnosti závisí na typu nuleotidů – v blízkosti TTG, TTC jsou minima. Křivka představuje teoretický výpočet. Poškození DNA působením UV-záření Působením UV záření dochází ke vzniku dimerů a 6-4 fotoproduktů. Kovalentní vazba vzniká mezi sousedními pyrimidiny, nejčastěji jsou to thyminy. Oba typy poškození mohou způsobovat špatné párování při replikace nebo zastavení replikace. Proto se vyvinuly systémy reparace těchto poškození. Protože na Zemi žijeme v přítomnosti UVzáření, vyvinula se řada systémů pro reparaci poškození způsobených tímto zářením. Systémy opravy DNA DNA je na rozdíl od proteinů, lipidů a sacharidů unikátní molekula v buňce. Molekuly, kterých je mnoho se mohou při poškození prostě zaměnit. Udržet DNA v originálním stavu je pro buňku jedna z hlavních úloh. Proto existuje řada opravných mechanismů DNA. DNA je, an rozdíl od RNA, relativně stabilní molekula; je však vystavena mnoha poškozujícím vlivům: 1) Teplota – denaturace DNA, deaminace bází, ztráta bází glykosylickou hydrolýzou 2) UV záření – vznikají pyrimidinové dimery, 6-4 fotoprodukty 3) Ionizující záření – poškození bází, jejich fragmentace, zlomy 4) Chemické modifikace – indukují velký počet různých poškození v genomu Oprava DNA byla první prozkoumána u E. coli. Byly testovány různé mutanty E. coli a bylo studováno působení UV záření a vliv těchto mutací na opravné mechanismy. Nukleotidová excisní oprava Excisní oprava pyrimidinových dimerů se uskutečňuje působením uvrABC systému. Komplex uvrAuvrB skenuje DNA a vyhledává dimery. Při jejich nalezení dochází k odpojení uvrA proteinu) a k připojení uvrC. Je reakce závislá na ATP. Tento kompex (urvBuvrC) štípne páteř DNA v blízkosti dimeru. Část řetězce je odstraněna uvrD proteinem – helikázou II za dodání energie z ATP Další krok opravného mechanismu se uskuteční jako prostá syntéza DNA za pomoci polymerázy a ligázy. Nukleotidová excisní oprava u člověka Experiments: Jana Suchánková and Eva Bártová Bázové excizní opravy (BER) Dochází k odstranění poškozených bazí (nikoliv nukleotidů), kdy se nejprve hydrolyzuje N-glykosylická vazba mezi deoxyrobozou a cukrem a pak se odstraní báze DNA glykosylazou. Vzniká AP místo (apurinové nebo apyrimidinové), které se opraví endonukleázou (štípe páteř DNA v blízkosti AP místa) a dRpázou (deoxyribofosfodiesterazou). Vloží se nukleotid polymerázou a páteř se spojí ligázou. DNA glykosylázy: -Malé 20-30 kD, velmi specifické (např. uracil, hypoxantin, 3metyladenin,hydroxymetyluracil apod), záření vyvolává např. 4,6-diamino-5FAPY (formamidopyrimidin), který odstraňuje enzym genu fpg (30 KD). Hydroxymethyluracil vzniká rovněž působením záření nebo jiných oxidačních činidel AP endonukleázy: - Štípou fosfodiesterickou vazbu 3‘ nebo 5‘ od AP místa (podle toho existují 4 druhy endonukleáz (štípou buď na 3‘ straně nebo 5‘ straně od AP a vzniká 3‘OH + 5‘PO4, 3‘PO4 + 5‘OH). - Dále jsou různé druhy endonukleáz, např. endo IV – mutanti citliví k alkylujícím činidlům (mitomycin C, bleomycin), endo V – degraduje DNA s uracilem, u člověka existují také AP endonukleázy Mismatch reparace Po replikaci se při chybně vloženém nukleotidu oprava děje tzv. „mismatch repair“ s využitím genů mutHLS. mutH se váže na GATC sekvenci s metylovaným A – tím se pozná starý řetězec DNA, mutS se váže na nespárované místo. MutL spojí mutH a mutS a dojde k vyštěpení řetězce za pomocí helikázy (uvrD). NHEJ reparace - DSBs Proteiny, které se účastní: DNA ligáza IV – kooperuje s XRCC4 na spojení konců po jejich patřičném opracováni XRCC4 - analog LIF1 genu u kvasinek – spojení konců XRCC5 – analog HDF2 u kvasinek – označuje se nyní jako Ku80 – spolupracuje s Ku70 nasedá na konce a spojuje je XRCC6 – analog HDF1, označuje se Ku 70, je velmi hojný tvoří heterodimer s Ku80, nasedá na konce a rozplétá částečně konce. XRCC7 – DNA protein kináza – aktivuje Artemis ARTEMIS – nukleáza regulovaná PKcs, připravuje konce pro ligázu. Mechanismus NHEJ: Oba zlomy jsou podrženy pohromadě v tzv. synapsi následujícím způsobem: 1) Ku proteiny nasednou na konce zlomů a interagují mezi sebou (tj. drží konce u sebe) 2) Ku aktivují protein kinázu PKcs, která interaguje s ARTEMIS endonukleázou a aktivuje ji, aby upravila konce DNA 3) Po úpravě se konce spojí – účastní se DNA ligáze IV a XRCC4 protein. NHEJ reparace Oba zlomy jsou podrženy pohromadě v tzv. synapsi následujícím způsobem: Homologní rekombinace u lidských buněk Existují dva dobře dokumentované procesy – SDSA a SSA Homologní rekombinace Rekombinační reparace může nastat tam, kde je k dispozici homologní DNA (MRN protein komplex a RAD50/RAD51) DNA repair Single-strand damage Base excision repair (BER), which repairs damage to a single base caused by oxidation, alkylation, hydrolysis, or deamination. Nucleotide excision repair (NER), which recognizes bulky, helix-distorting lesions such as pyrimidine dimers and 6,4 photoproducts. Mismatch repair (MMR), which corrects errors of DNA replication and recombination that result in mispaired (but undamaged) nucleotides. Double-strand breaks non-homologous end joining (NHEJ) microhomology-mediated end joining (MMEJ) homologous recombination (HR) http://commons.wikimedia.org/wiki/File:DNA_Repair.jpg Misteli and Soutogou (2009) Repair of DSBs G1 S/G2 DNA repair studies GFP-H2A GFP-H2ADNA 53BP1 overlay 53BP1 in various types of DNA lesions Experiments: Soňa Legartová, Jana Suchánková and Eva Bártová UV-induced DSB sites Daley and Sung, MCB (2014) and Cuella-Martin et al. Molecular Cell (2016) Study 1: Functions of the 53BP1 protein: compartmentalization of DNA repair foci Experiments: Veronika Foltánková and Dmitry V. Sorokin 53BP1 PML Experiments: Jana Suchánková Suchánková et al. (2017) Fritetal.(2014) Study 1: Compartmentalization of DNA repair foci Experiments: Soňa Legartová Suchánková et al. HCB (2017) Sophie E. Polo, and Stephen P. Jackson Genes Dev. 2011;25:409-433 Experiments: Soňa Legartová and Dušan Cmarko Campalans et al., JCB (2007): The DNA glycosylase hOGG1 initiates base excision repair (BER) of oxidised purines in cellular DNA. hOGG1 forms foci co-localizing with the nuclear speckles. The recruitment of DNA repair proteins to nuclear speckles after oxidative stress implicates that nuclear speckles take a part in the cellular stress response. Experiments:PetraSehnalová Study 2: A-type lamins and DNA repair Bártová et al., J. Cell. Biochem. (2018) Experiments: Soňa Legartová