Rybí imunologie



1.      Odběr kožního mukusu – karas obecný (Carassius carassius), důkaz antibakteriální aktivity
lysozymu – zónová difúze v agaróze s Micrococcus luteus.

2.      Odběr krve z kaudální cévy – karas obecný (Carassius carassius), heparin 50U/ml, krevní
roztěr (jaderné červené krvinky, bílé krvinky, fotodokumentace Olympus BX43 + kamera Infinity 2,
Quick Photo Micro software).

3.      Oxidační vzplanutí plné krve luminometricky s použitím dvou luminoforů – luminol (50x
ředěná plná krev), Pholasin (1000x ředěná plná krev).

Postup luminol: (2x vzorek, 2x blank): Naředění plné krve v HBSS – 780 ml HBSS + 20 ml krve.

                                           Naředěná krev

                                                (ml)

                                  Luminol v borátovém pufru (ml)

                                          Aktivátor - OZP

                                                (ml)

                                                200

                                                25

                                                25








Postup Pholasin: (2x vzorek, 2x blank):



OZP

4.      Oddělení krevní plasmy centrifugací (1500ot./10 min.), plasma jako blank pro vzorky plné
krve.


5.      Stanovení activity komplementu (celková/alternativní cesta aktivace komplementu)
luminometricky pomocí bioluminiscenční E. coli K12:


Postup


·        Do dvojice se připraví 2 zkumavky s HIS (heat inactivated serum):

pro celkovou aktivitu komplementu: 80 µl HIS + 120 µl PBS (poměr 2 : 3)

pro alternativní cestu: 80 µl HIS + 40 µl PBS + 80 µl zásobního EGTA (poměr 2 : 1 : 2)


·        Do dvojice si připravíte 2 zkumavky pro vyšetřované sérum:

pro celkovou aktivitu komplementu: 80 µl plasmy + 120 µl PBS (poměr 2 : 3)

pro alternativní cestu: 80 µl plasmy + 40 µl PBS + 80 µl zásobního EGTA (poměr 2 : 1 : 2)


·        Pipetovat na desku v pořadí dle následujícího schématu (zleva doprava – viz poslední
řádek):



                                               [µl]

                                             Paralelky

                                              Vzorek

                                                HIS

                                            HIS s EGTA

                                         Suspenze bakterií

                                              Celková

                                             aktivita

                                              Blank K

                                                 1

                                                 -

                                                50

                                                 -

                                                50

                                                K 1

                                                 1

                                                10

                                                40

                                                 -

                                                50

                                                K 2

                                                 1

                                                20

                                                30

                                                 -

                                                50

                                                K 3

                                                 1

                                                40

                                                10

                                                 -

                                                50

                                           Alternativní

                                               dráha

                                              Blank A

                                                 1

                                                 -

                                                 -

                                                50

                                                50

                                                A 1

                                                 1

                                                10

                                                 -

                                                40

                                                50

                                                A 2

                                                 1

                                                20

                                                 -

                                                30

                                                50

                                                A 3

                                                 1

                                                40

                                                 -

                                                10

                                                50








                                                                     pořadí pipetování na destičku:

                                                1.

                                                2.

                                                3.

                                                4.



6.      Imunoturbidimetrie

Jedná se o tzv. zákalovou metodu. Zákal je tvořen imunokomplexy vzniklými interakcí specifických
protilátek s antigenem. Koncentrace antigenu je přímo úměrná intenzitě zakalení. Měří se úbytek
intenzity světla, které prošlo kyvetou. Zdrojem světla bývá dioda. Detektor je umístěn přímo
naproti zdroji světla.


Princip metody spočívá v reakci C3 složky se specifikou protilátkou proti C3. Vznikající
imunokomplexy způsobují zákal, který je přímo úměrný koncentraci C3 ve vzorku. Reakční schéma
vyjadřuje tab. č. 2.


Schéma reakce:





Vyhodnocení: Získaná data byla vyhodnotit v programu MS Excel z rovnice regrese, získané z
kalibrační křivky sestrojené z řady standardů o známé koncentraci