Ptačí imunologie

1.      Odběr krve z křídla (vena cutanea ulnaris)  – slepice domácí (Gallus gallus), heparin
50U/ml, krevní roztěr (jaderné červené krvinky, bílé krvinky, obarvení krevních roztěrů – kit
Leukodif, fotodokumentace Olympus BX43 + kamera Infinity 2, Quick Photo Micro software).


2.      Oxidační vzplanutí plné krve luminometricky s použitím dvou luminoforů – luminol (50x
ředěná plná krev), Pholasin (1000x ředěná plná krev).


Oddělení krevní plasmy centrifugací (1500ot./10 min.).


Postup Pholasin (2x vzorek, 2x blank – plasma ředěná stejně jako krev):


       LPS


Luminometr vytemperovaný na 37°C! Aktivátor přidaný těsně před měřením nebo injektorem v pátém
cyklu! Reakce je rychlá, celkové měření jen 5 minut, poté nasadit luminol.

Postup luminol (2x vzorek, 2x blank): Naředění plné krve v HBSS – 780 ml HBSS + 20 ml krve.

                                           Naředěná krev

                                                (ml)

                                  Luminol v borátovém pufru (ml)

Aktivátor - LPS

                                                (ml)

                                                200

                                                25

                                                25








Luminometr vytemperovaný na 37°C! Měření kinetiky 60 minut.

3.      Stanovení activity komplementu (celková/alternativní cesta aktivace komplementu)
luminometricky pomocí bioluminiscenční E. coli K12 (100 tis./jamku):


Postup


A.  Do dvojice se připraví 2 zkumavky s HIS (heat inactivated serum):

pro celkovou aktivitu komplementu: 80 µl HIS + 120 µl PBS (poměr 2 : 3)

pro alternativní cestu: 80 µl HIS + 40 µl PBS + 80 µl zásobního EGTA (poměr 2 : 1 : 2)


2.   Do dvojice si připravíte 2 zkumavky pro vyšetřované sérum:

pro celkovou aktivitu komplementu: 80 µl plasmy + 120 µl PBS (poměr 2 : 3)

pro alternativní cestu: 80 µl plasmy + 40 µl PBS + 80 µl zásobního EGTA (poměr 2 : 1 : 2)


3.   Pipetovat na desku v pořadí dle následujícího schématu (zleva doprava – viz poslední řádek):



                                               [µl]

                                             Paralelky

                                              Vzorek

                                                HIS

                                            HIS s EGTA

                                         Suspenze bakterií

                                              Celková

                                             aktivita

                                              Blank K

                                                 1

                                                 -

                                                50

                                                 -

                                                50

                                                K 1

                                                 1

                                                10

                                                40

                                                 -

                                                50

                                                K 2

                                                 1

                                                20

                                                30

                                                 -

                                                50

                                                K 3

                                                 1

                                                40

                                                10

                                                 -

                                                50

                                           Alternativní

                                               dráha

                                              Blank A

                                                 1

                                                 -

                                                 -

                                                50

                                                50

                                                A 1

                                                 1

                                                10

                                                 -

                                                40

                                                50

                                                A 2

                                                 1

                                                20

                                                 -

                                                30

                                                50

                                                A 3

                                                 1

                                                40

                                                 -

                                                10

                                                50








                                                                     pořadí pipetování na destičku:

                                                1.

                                                2.

                                                3.

                                                4.