Akrylamidová elektroforéza (SDS PAGE, Mini-Protean II, Bio-Rad ) proteinů tělních tekutin

Roztoky a pufry:

akrylamid + N, N´- methylenbisakrylamid (30:0,822): 0,0822 g bis na 10 ml 30% akrylamidu. Přidat
amberlit (vyváže kyselinu akrylovou).

1,5M Tris-Cl pH 8,8: 18,171 g Tris, 0,298 g EDTANa[2 ]. 2H[2]O, přidat asi 80ml dH[2]O, upravit pH
na 8,8 pomocí HCl, doplnit do 100 ml.

0,5M Tris-Cl pH 6,8: 6,057 g Tris, 0,298 g EDTANa[2 ]. 2H[2]O, přidat asi 60ml dH[2]O, upravit pH
na 6,8 pomocí HCl, doplnit do 100 ml.

running pufr:  14,4 g glycin, 3 g Tris, 1 g SDS, doplní se na 1000 ml dH[2]O, pH se upraví na 8,3.

vzorkový pufr: 3,03 g TRIS, 0,37 EDTA, 24,98 sacharóza, 1,85 g SDS, 0,015 bromfenolová modř, vše do
50 ml dH[2]O

10% APS: 100 mg amonium persulfát, 1 ml dH[2]O

Rozpis na 4 gely

                     7,5% (separační)

                                     2,5% (hřebínkový)

H[2]O

                     11,5 ml

                                     3,2 ml

1,5M Tris-Cl, pH 8,8

                     6 ml

                                     -

0,5M Tris-Cl, pH 6,8

                     -

                                     1,25 ml

akryl+bis (30:0,822)

                     6 ml

                                     420 µl

10% SDS

                     240 µl

                                     50 µl

10% amonium persulfát

                     240 µl

                                     50 µl

TEMED

                     24 µl

                                     5 µl

celkem

                     24 ml

                                     5 ml


1.      Sestavíme nalévací stojánek. Jedno sklo je menší, druhé větší, pozor na jejich správnou
orientaci, při nalévání je menší směrem ven! Připravíme separační gel, amonium persulfát (vždy
čerstvý) a TEMED se přidá jako poslední. Nalejeme separační gel zvolené koncentrace (asi 2 cm pod
horní okraj) a opatrně převrstvíme dH[2]O. Necháme tuhnout při laboratorní teplotě cca 45 min.

2.      Po dané době převrstvení odstraníme filtračním papírem.

3.      Nalejeme 2,5% hřebínkový gel a zasuneme hřebínek. Pod jamkami by mělo být minimálně 0,5 cm
hřebínkového gelu. Dáváme pozor, aby nebyly na dně jamek bubliny. Necháme polymerizovat, možno
skladovat déle jak týden v lednici.





4.      Příprava vzorků:

1. krok: 5 µl vzorku + 245 µl 4x ředěného 0,5M Tris pH 6,8 (ředění 50x)

2. krok: 10 µl 50x ředěného vzorku + 10 µl SAMPLE pufru + 7 µl 2‑merkaptoethanol + 73 µl 4x
ředěného 0,5M Tris pH 6,8

Inkubace vzorků na vodní lázni 5 min /90°C

5.      Umístíme gely do elektroforetické vany. Do spodního anodového prostoru nalejeme Running
pufr (bude potřeba až 700 ml). Do horního katodového prostoru je třeba použít vždy čerstvý running.
Vzorky naneseme do jednotlivých jamek v hřebínkovém gelu - nanáší se 10 µl.

6.      Připojíme elektroforetickou vanu ke stejnosměrnému zdroji proudu. Na aparaturu (Bio-Rad)
přivedeme napětí 100 V asi po dobu dvou hodin (program TV-H, nutné nastavit čas, ale lze kdykoliv
vypnou po vyjetí čela…, zdroj drží V, mA a W nenastavujeme), dokud zóna bromfenolové modři
nedoputuje ke spodnímu okraji gelu.

7.      Po sjetí rozmontujeme držáky gelu, spacery opatrně vytáhneme. Spacerem odřízneme hřebínkový
gel.

8.      Fixace: 300 ml MetOH + 100 ml kys. octová + 600 ml dH[2]O