Akrylamidová elektroforéza (SDS PAGE, Mini-Protean II, Bio-Rad ) proteinů tělních tekutin:

                                           barvení gelů

Gely budou barveny stříbrem podle Kirkebiho (Kirkeby et al. 1993). Výhodou metody je její
citlivost, obarví 2-10 ng proteinu / band oproti 0,1-1µg u Coomassie Brilliant blue (např. podle
návodu Marshak et al. 1996, Bollag et al. 1996) nebo Amido černi (viz Hoefer Scientific Instruments
– Protein electrophoresis applications guide, Bollag et al. 1996).

2 gely obarvit Coomassie Brilliant Blue a dva stříbrem (porovnání citlivosti)

Barvení stříbrem:

1.       40% etanol, 10% kyselina
octová                                                               10 min.

       5 ml kyseliny octové + 20,8 ml 96%etanolu + voda do 50 ml

2.    0,05% glutaraldehyd, 0,01% formaldehyd, 40% etanol                            5 min.

       20,8 ml 96% etanolu + 0,1 ml 25% glutaraldehydu + 12,5 µl 40% formaldehydu,

       doplnit do 50 ml vodou

3.    96% etanol
                 20 min.

4.    destilovaná voda
             20 min.

5.       0,5% Farmerův zeslabovač ( 30% ferrikyanid draselný, 60% thiosíran

       sodný, 10% uhličitan sodný)
      2,5 min.

       75 mg ferrikyanidu draselného + 150 mg thiosíranu sodného + 25 mg uhličitanu

       sodného (bezvodý, stejně jako v dalších krocích)  do 50 ml vody

6.    destilovaná voda
            30 min.

7.     0,1% dusičnan stříbrný v destilované vodě
      20 min.

        50 mg do 50 ml vody

8.     opláchnout gel vodou

9.      2,5% uhličitan sodný v destilované vodě                                                   5
min.

         1,25 g uhličitanu sodného do 49 ml vody

             10.    opláchnout gel vodou

        11.   2,5% uhličitan sodný v 0,02% formalínu                                           3 x
2,5min.

        3,75 g uhličitanu sodného + 75 µl formaldehydu + 147 ml vody

12.   opláchnout gel vodou

13.   1% kys.octová
               5 min.

        500 µl do 49,5 ml vody

14.   destilovaná voda, opláchnout, pak v ní uchovávat

Barvení Coomassie Brilliant Blue:

-          30-60 min. v barvícím roztoku ‑ 0,07 % Coomassie Brilliant Blue R 250; 7,5 % kyselina
octová a 50 % metanol (2,5 g Coomassie Brilliant Blue R, 455 ml methanolu, 455 ml destilované vody,
90 ml ledové kyseliny octové)

-          po obarvení se gel odbarví cca 30 min. ve směsi metanolu, vody a kyseliny octové v
poměru 5:5:1 (455 ml methanolu, 455 ml destilované vody, 90 ml ledové kyseliny octové)