Bi8920 Fluorescenční mikroskopie
doc. RNDr. Jakub Neradil, Ph.D.
Ústav experimentální biologie PřF MU
Principy a postupy
imunofluorescenčního značení
buněk
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
• imunocytochemie
• typy protilátek a jejich výroba
• postup imunofluorescenčního barvení
Program přednášky:
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
Nevlastní (vnější) fluorescence
Přímá vazba fluorochromu na molekuly nebo buněčné
struktury - sondy
DNA, buněčná stěna, plazmatická membrána…
mitochondriální aktivita - respirační vzplanutí, pH
indikátory, membránový potenciál.
Nepřímá vazba fluorochromu – značky
navázání na imunoglobulin (protilátku) nebo úsek nukleové
kyseliny, annexin V, phalloidin..
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
Imunocytochemie (ICC)
• soubor metod, které umožňují detekci
antigenu v tkáni nebo buňce (in situ)
• pomocí značených protilátek
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
Albert Hewett Coons, M.D.
(1912 - 1978)
• zakladatel imunofluorescence
• použití fluorochromem značené protilátky
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
Protilátky
• patří do skupiny imunoglobulinů
• třídy: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM (u savců)
• složení: 2x těžký řetězec (H), 2x lehký řetězec (L)
• H řetězce: různé dle antigenních a strukturálních vlastností Ig
-> podtypy (alfa, delta, epsilon, gama, mí)
• L řetězce: lambda nebo kapa – různě, v závislosti na typu Ig
• H a L – spojení disulfidickými vazbami, podíl na terciární
struktuře, udržuje stabilitu Ig
• nejčastěji pro imunofluorescenci IgG a IgM
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
IgG
obecný vzorec:
gama2 lambda2 nebo gama2 kapa2
průměrná Mr = 150kDa, H = 50kDa, L = 25kDa
domény - variabilní (V) a konstantní (C),
velikost 80-120AA
na N-koncích :
L řetězec: 1x VL doména
H řetězec: 1x VH doména
na C-koncích :
L řetězec: 1x CL doména
H řetězec: 3x - CH1, CH2, CH3
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
VL a VH tvoří vazebné místo antigenu, v této části hypervariabilní
oblasti – tyto se během reakce s antigenem dostávají nejblíže
(0,2 - 0,3 nm)
Struktura vazebného místa, která je unikátně charakteristická pro
danou protilátku, se nazývá idiotyp -> každý klon protilátky má
jiný idiotyp
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
Struktura – odvozena od
enzymatického štěpení
• papain- štěpí v pantové
oblasti H řetězce
vznik:
 2x monovaletních Fab
(Fragment antigen binding)
 1x Fc (Fragment crystallizable)
• pepsin – štěpí v C-koncové oblasti H
řetězce
vznik:
 1x bivalentní F(ab´)2
 zbytek Fc fragmentu je
degradován
2 x
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
IgM
• pentamer, Mr=900kDa, 5x podjednotka po 180kDa
• obecný vzorec (mí2 kapa2)5 nebo (mí2 lambda2)5
• struktura spojena řetězcem „J“ (15kDa)
• stejné štěpení proteinázami jako IgG, vznik 10x Fab a Fc; 5x F(ab)2
• Fc - cyklický pentamer (340kDa)
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
Imunitní odpověď
• imunizace antigenem - vyrovnání koncentrace mezi intra a
extravaskulárním prostorem
• zachytávání antigenu v uzlinách
• latentní (indukční) fáze – asi týden
• první tvorba IgM – primární odpověď
• později nebo po další imunizaci (booster)– převážně tvorba IgG –
sekundární odpověď
• různá délka poločasu - IgM = 4-6 dní, IgG = 3 týdny
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
Polyklonální protilátky pro ICC
• produkce různými klony B- lymfocytů
• reakce s různými epitopy daného antigenu
• nejčastější producent – králík (New Zeeland White rabbit) ,
koza, prase, ovce...
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
Příprava polyklonálních protilátek
• navržení a syntéza peptidu (antigen)
• ověření čistoty hmotnostní spektrometrií
a chromatografií
• coupling – vazba s KLH glykoproteinem
• KLH – Keyhole limpet hemocyanin
• měkkýš (Megathura crenulata)
• produkce vysoce imunogenního
glykoproteinu KLH
• dodá imunogenitu i peptidu
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
Příprava polyklonálních protilátek
• imunizace – kontrola specificity vůči antigenu
• získání séra
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
Příprava polyklonálních protilátek
• imunizace
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
Ověřování afinity protilátky k antigenu
metoda: dot-blot
1) na membránu nanesen antigen
2) kapka různě ředěné protilátky
3) detekce anti-králičí protilátkou konjugovanou s chromogenem
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
Monoklonální protilátky pro ICC
• produkovány pouze jedním klonem
B-lymfocytů
• všechny molekuly imunoglobulinu
jsou totožné
• reagují pouze s jedním specifickým
epitopem na antigenu
• nejčastěji myší
• příprava pomocí hybridomů:
fůze B-lymfocytu a myelomové b.
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
Tvorba monoklonalních
protilátek
http://sites.sinauer.com/cooper7e/ani
mation0413.html
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
První monoklonální protilátka (1975)
• myší monoklonální protilátka – klon Sp1 (IgM)
• proti SRBC (sheep red blood cells)
• fůze myších buněk z myelomu a sleziny
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
Konjugace protilátky s fluorochromem
vazba přes aminoskupinu, vznik amidu
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
• vazba přes thiolovou skupinu (-SH)
• nutné v redukujícím prostředí – porušení disulfidických
vazeb
• vyšší senzitivita konjugátu – specifičtější místo značení
Konjugace protilátky s fluorochromem
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
Přímá vs. nepřímá imunofluorescence
• přímá imunofluorescence – původní metoda (1942)
• přímá vazba protilátky s fluorochromem na antigen
• rychlá, méně univerzální, nižší intenzita signálu
• využití pro flow-cytometrii
fluorochrom
imunoglobulin
epitop antigenu
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
Přímá imunofluorescence
a) značená protilátka od dodavatele
b) vlastní označení zvolené protilátky vybraným fluorochromem
Innova Biosciences, Lightning-Link®
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
Nepřímá imunofluorescence
dvoukroková
1) primární protilátka x antigenu
2) sekundární značená protilátka
x primární protilátce
• univerzální, více primárních protilátek z jednoho organismu lze
kombinovat s jednou sekundární protilátkou
• vyšší citlivost - na I. Ab více rozeznatelných epitopů,
více navázaných molekul II. Ab
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
Základní postup imunofluorescenčního
barvení buněčných kultur
1) fixace
2) permeabilizace
3) blokování nespecifických vazeb
4) inkubace s protilátkou / protilátkami
5) counterstaining (detekce DNA)
6) montování
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
Základní postup imunofluorescenčního
barvení tkáňových řezů
1) parafínové řezy (±4 mm) na podložním skle
2) deparafinizace – xylen
3) rehydratace – sestupná alkoholová řada
4) reaktivace antigenů (antigen retrieval) v tlakové komoře
při vyšší teplotě (97°C)
5) blokování nespecifických vazeb
6) inkubace s protilátkou/-ami
(chromogen – platí jen pro IHC)
5) counterstaining
6) montování
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
Fixativa
požadavky
• rychle proniká do buňky/tkáně
• fixuje b. struktury a zabraňuje reakci buňky a tím vzniku
strukturálních artefaktů
• zamezí ztrátě rozpustných proteinů
• nesmí vykazovat autofluorescenci
• rozdíly v závislosti na detekované struktuře
• chemická fixativa
• mrazová substituce
• mikrovlnná fixace
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
Chemická fixativa
koagulační chemická fixativa
• MetOH - nejčastěji/-20°C, bez permeabilizace
• EtOH
• aceton
výhody
• rychlá fixace, díky dehydrataci
• proteiny jsou koagulovány nebo extrahovány
• zachovává rozpoznání antigenu
nevýhody
• výrazné smrštění vzorku (až o 50%)
• zkreslení morfologie a velikosti
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
Crosslinkující chemická fixativa
vytváří metylenové vazby -CH2- (crosslinks) mezi různými skupinami
makromolekul
• formaldehyd
• glutaraldehyd..
nejčastěji paraformaldehyd (4% PFA)
• reaktivní skupiny: amidová, guanidinová, thiolová, fenolová,
imidazolová a indolylová
• crosslinky i v nukleových kyselinách (ne však v lipidech)
• pomalejší vytváření crosslinků, ale rychlejší průnik do buňky (než
glutaraldehyd)
• toxický, potenciální karcinogen
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
Permeabilizace
• použití v závislosti na umístění detekované molekuly
• na externí straně pl. membrány – netřeba
• po fixaci aldehydy, nutnost permeabilizovat membránu,
aby mohly být detekovány intracelulární molekuly
• použití organických rozpouštědel nebo detergentů
nejčastěji:
• TRITON X-100 (0,1-1%),
• Tween 20
• NP-40 (= Igepal)
• Brij…
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
Blokování nespecifických vazeb
nutnost vyvázání:
• nespecifických vazebných míst, na která by mohla
nasednout protilátka
• nevymytého fixativa
• polárních nebo velmi hydrofobních struktur
• zvyšuje specificitu protilátky
• snižuje signál z pozadí
nejčastěji používané:
• bovinní sérový albumin (BSA): 1-10%,
• sérum (ze stejného zvířete jako II. Ab,
nebo jiné než I. a II. Ab)
• želatina
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
Přímá a nepřímá
imunofluorescence
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
http://www.youtube.com/watch?v=OH2GFeaGV6w
Dvojité značení
nepřímá imunofluorescence
http://www.youtube.com/watch?v=pteO6FRWo3g
Celkový postup
nepřímá imunofluorescence
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
Negativní kontrola
• nutné pro vyloučení falešných výsledků
• vícenásobné značení – kontroly pro jednotlivé fluorochromy
• použití isotypové kontroly – stejný typ protilátky s fluorochromem bez
specificity
• použití neznačených buněk – vyloučení autofluorescence
isotypová kontrola pozitivní značení
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
Pozitivní kontrola
• detekce „ověřeného“ proteinu (tubulin, aktin)
• linie s ověřenou expresí daného proteinu
• transfekovaná linie s over-expresí daného proteinu
HeLa: a-tubulin A431: EGFR
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
Montování = uzavírání
• uchování preparátu na delší dobu
• bez přístupu vzduchu
• v prostředí bránícím vyhasínání fluorescence
• mohou současně označovat nukleové kyseliny (+DAPI, aj.)
tuhnoucí vs. netuhnoucí montovací média
• na bázi polyvinyl alkoholu (např. Mowiol) – tuhne
• na bázi glycerolu (např. Vectashield) – potřeba zarámovat sklo –
gel, parafín, lak na nehty..
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
Celkový postup nepřímého
imunofluorescenčního značení – 1. část
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
Celkový postup nepřímého
imunofluorescenčního značení – 2. část
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
Nepřímá vazba fluorochromu – značky
navázání na imunoglobulin (protilátku) nebo úsek nukleové kyseliny, phalloidin..
Phalloidin
• mykotoxin - obsažen v některých jedovatých druzích muchomůrek
• Amanita phalloides - muchomůrka zelená (obsah přibližně 0,01 %)
• inhibice depolymerizace aktinových filament
• vazba na F-aktin
• konjugace s fluorochromy
Alexa Fluor 488 phalloidin
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
Annexin V + fluorochrom
detekce fosfatidylserinu („eat me“ signal) v apoptóze
Annexin V - TRITC
kaspáza-3 (FITC)
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 03 / 20.3.
Interaktivní materiály
•http://www.proteinatlas.org/
•http://www.sigmaaldrich.com/czech-republic.html
•http://www.abcam.com/
•https://www.scbt.com/scbt/home/
•http://www.cellsignal.com/index.jsp
•http://www.agilent.com/en/dako-products
•http://www.thermofisher.com/cz/en/home/brands/molecular-probes.html
•http://www.protilatky.cz/