Bi8920 Fluorescenční mikroskopie
doc. RNDr. Jakub Neradil, Ph.D.
Ústav experimentální biologie PřF MU
Fluorescenční zobrazení
živých buněk
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
• GFP a fluorescenční proteiny
• tracking metody
• fluorescence v reálném čase
• mikroskopování živých buněk
Program přednášky:
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
The Nobel Prize in Chemistry 2008
"for the discovery and development
of the green fluorescent protein, GFP".
http://www.youtube.com/watch?v=90wpvSp4l_0
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
O. Shimomura
60. -70. léta: izolace fluoreskujících proteinů z medůzy
Aequorea victoria, kolem klobouku bioluminiscenční orgány
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
Princip luminiscence Aequorea victoria
• za přítomnosti Ca+2, bioluminiscence aequorinu
(apoaequorin = enzym + luciferin = kofaktor) -> modré světlo
-> excitace GFP -> zelené světlo
• přenos energie na principu rezonančního transferu (FRET)
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
struktura GFP: -barel (11 antiparalelních řetězců) , uvnitř α-helix s
chromoforem, 238 AMK, 27kDa,
aktivní místo: Ser65-Tyr66-Gly67 přestavba a vznik fluoroforu
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
imidazolinový
kruh
http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/tutorials/fluorescentproteins/egfpchroma/indexflash.html
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
Excitace: 390-470 nm – wtGFP dva píky, emise cca 509 nm
redukovaná forma – ex. 390 nm
oxidovaná forma – ex. 470 nm
Využití: označení genů, vznik fúzního proteinu,
lokalizace a dynamika proteinu v živých buňkách bez nutnosti fixace,
možnost užití inducibilních promotorů a tedy indukovat tvorbu
fúzních proteinů jen v určitém čase
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
možnost umístění
fluorescenčního proteinu
v plasmidu
Exprese :
• přechodná z plazmidu
(vysoká hladina proteinu)
• stabilně - integrace do
chromozomové DNA
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
Výhody GFP
• relativně malý protein (27kDa) – snadná difuze
• funkční jako monomer
• není třeba kofaktoru
• stabilní, vysoký kvantový výtěžek (0,8)
• v živých organismech / buňkách – dědičná exprese
• neinvazivní vizualizace
• „neinterferuje“ s buněčnými procesy
nevýhody wtGFP
• pomalejší proces fluorescence in vivo
• horší funkčnost při 37°C
• renaturace fluoroforu, redukce (2-4 hodiny)
• méně stabilní při nízkém pH (lysozomy)
• původně dvoukrokový proces
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
mutace GFP
• zesílení signálu
• delší životnost
• posun emisního spektra
deriváty GFP
• EGFP - enhanced green FP
• EBFP – enhaced blue FP
• ECFP – enhanced cyan FP
• EYFP – enhanced yellow FP
Wt: Ser65-Tyr66-Gly67
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
Ds Red fluorescenční protein a jeho deriváty
• snaha o získání FP s delší excitační vlnovou délkou
• izolovány z korálu Discoma striata
• tetramerický protein
• vylepšený derivát, snížená Mr (monomer)
• další mutanty – mFruits proteiny
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
Ds Red fluorescenční protein a jeho deriváty
wt Ds Red: podobná struktura proteinu jako GFP
-barel (11 antiparalelních řetězců) , uvnitř α-helix s chromoforem
excitace: 558 nm
emise: 583 nm
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
Ds Red fluorescenční
protein a jeho deriváty
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
Speciální vlastnosti fluorescenčních proteinů
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
Zavedení fúzního genu do buňky ve formě plazmidu
Mikroinjekce – přímý přenos mikrojehlou do cytoplasmy nebo jádra pomocí
mikromanipulátoru, není vhodný pro velké množství b. linií, ideální pro
protoplasty, lze si vybírat jednotlivé b.
Lipofectaminová transfekce – jednoduchá a nejčastější metoda u živočišných
buněk, není toxický, komplex lipidů a DNA fúzuje s plasmatickou membránou,
lze i do jádra
Precipitace fosforečnanem vápenatým – fosforečnan vápenatý společně s DNA
precipituje, poté je fagocytován do buněk, jednoduchá metoda, část DNA i do
jádra
Elektroporace – elektrický puls vyvolá tvorbu pórů v plasmatické membráně,
přechod do buňky
Gene Gun – mechanický přenos DNA vázané na kovové mikroprojektily do
buněk pomocí tlaku plynů nebo mikroexploze (např. u rostlinných buněk)
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
Zavedení fúzního genu do buňky
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
Mikroinjekce
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
Lipofectaminová transfekce
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
Elektroporace
Cíle:
• b. kultura
• tkáně
• orgány
• embryo
• embryo in utero
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
GFP exprese v rybím embryu
zebřička (Danio rerio)
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
GFP transfekce „in utero“
např. hlodavci - mozek
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
• Fluorescenční indikátory
změna fluorescence (spektra nebo intenzity) v závislosti na
určité látce – prvek, pH, ROS...
Iontové indikátory:
kationty:
H+, Ca2+, Li+, K+, Mg2+, Zn2+, Pb2+, ...
anionty:
Cl-, PO4
2-, citrát, ATP...
měření:
změna intenzity v závislosti na koncentraci nebo posun
emisního spektra
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
Indikátory Ca2+
FURA-2
excitace při dvou vl. délkách
měření poměru 340/380nm
při konstantní emisní
vlnové délce 510nm
CalciumGreen-5N
měření intenzity fluorescence
při konstantní excitační
vlnové délce 488nm
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
kombinace indikátorů Ca2+
• dva indikátory s neměnící se vl. délkou emise
• jeden snižuje fluorescenci (Fura Red)
• druhý zvyšuje fluorescenci (Fluo-3) v závislosti na Ca2+
• měření poměru fluorescence v jednotlivých emisních maximech
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
Organelové sondy - próby
označení specifické membránové organely:
• mitochondrie
• Golgiho aparát
• endoplasmatické retikulum
• lysosomy
složení: fluorochrom + vazebná doména (zajišťuje specificitu vazby)
• schopnost průniku přes pl. membránu bez poškození
• navázání na cílovou organelu
studium: transport, buněčná respirace, mitóza, apoptóza, degradace
proteinů, sekreční dráhy
rozdělení: na stálé a nestálé
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
Mitochondrie
• studium buněčné respirace dříve Rhodamin 123 (po fixáži slábne)
• nyní MitoTracker, Mito Fluor (lze fixovat)
• JC-1 indikátor membránového potenciálu - v aktivních mitochondriích mění
emisi ze zelené na červenou
Neonatální kardiomyocyty : rhodamin123, (A) kontrola, (B) ovlivněno
mitochondriálním uncouplerem
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
mitochondrie – bovinní endotel :
MitoTracker® Deep Red FM dye
mitochondrie/DNA - býčí spermie:
MitoTracker® Green FM
Hoechst 33342
mitochondrie – fibroblasty norka :
JC-1 / JC-1
vysoký membránový potenciál – červená
nízký membránový potenciál - zelená
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
Golgiho aparát
• CellLight™ Golgi-GFP , enzym specifický pro GA, fúzovaný s GFP ve vektoru
• konjugované lektiny – vazba na glykosylované proteiny GA
GA a mitochondrie / DNA – linie lidské hladké svaloviny:
CellLight Golgi-GFP, CellLight Mitochondria-RFP, DAPI
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
Endoplasmatické retikulum
• prostupují přes membránu, selektivní pro ER, dříve DiOC6,- není tak specifický,
vykazuje fotodynamickou toxicitu
• nyní ER-Tracker + Blue-White, Red , Green - menší toxicita, lze i fixovat
ER - bovinní endotel : ER-Tracker Blue-White DPX
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
Lysozómy
• LysoTracker, LysoSensor obsahují ve struktuře heterocyklické dusíkaté skupiny,
které napomáhají transportu do lysozomů živých buněk, vysoká senzitivita pro
organely s nízkým pH, možnost fixace (LysoTracker)
• pouze živé b. (LysoSensor) – vzrůstá intenzita fluorescence v nízkém pH
funkce jako pH indikátor
lysozómy a mitochondrie / DNA – bovinní endotel :
LysoTracker® Red
dihydrorhodamine 123
Hoechst 33258
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
BacMam Reagents
• připravené virové konstrukty
• baculovirus – hmyzí, aktivně neinfikují savčí buňky, nereplikují se
konstrukt:
1) savčí promotor: zaručuje expresi v savčích buňkách
2) funkční část: protein nebo peptid cílený na strukturu (cytoskelet,
organely aj.) nebo funkci (buněčný cyklus, autofagie, tok Ca2+)
3) fluorescenční protein: CFP, GFP, RFP; na C- nebo N- konci peptidu
• jednoduchá aplikace
• lze sledovat v reálném čase
• lze koexprimovat více prób
• lze fixovat
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
Princip metody
• vstup do b. endocytózou
• přechod DNA do jádra
• exprese genů jen se savčím
promotorem
• virové geny se nereplikují a
nepůsobí buněčnou smrt
• reálná exprese po 4-6 h
• maximum signálu 24-48 h
• vyhasnutí 4 dny až 2 týdny v
závislosti na proliferační
aktivitě
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
Sledování fází buněčného cyklu
• FUCCI- fluorescence ubiquitination cell cycle indicator
• Geminin-GFP -> S/G2/M
• Cdt1-RFP -> G1
• regulace ubiquitin-ligázami, exprimovanými v určitých fázích cyklu
• lze spojit s BacMam systémem transfekce (LifeTechnologies)
Sakaue-Sawano et al . Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 2008 Feb 8;132(3):487-98.
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
Testování viability/cytotoxicity
měření podílu živých a mrtvých buněk na základě rozdílných vlastností
1. fluorogenní substráty esteráz
• pronikají do buněk, zde metabolizovány - vznik aktivního
fluoroforu
• ověření soudržnosti membrány – fluorofor zadržován v
cytoplasmě
• fluoresceindiacetát (FDA), calcein AM (CAM)
2. sondy pro nukleové kyseliny
• neprostupují přes membránu živých buněk
• EtBr, PI, ethidium homodimer, SYTOX Green...
lze společně kombinovat
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
linie krysích buněk:
živé: substrát esterázy calcein AM zelené
mrtvé: ethidium homodimer-1 červené
býčí spermie :
živé : SYBR® 14  zelené
mrtvé: propidium iodide  červené
Micrococcus luteus
a Bacillus cereus:
živé: zelené
mrtvé: červené
Princip obarvení mrtvých buněk
membránu neprostupující DNA sondou
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
Annexin V + PI: detekce buněčné smrti
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
TUNEL: Detekce štěpení DNA v apoptóze
TUNEL: Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick
end labeling
TUNEL
DAPI
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
FRAP – Fluorescence Recovery after Photobleaching
• studium mobility a molekulární dynamiky proteinů v živých b.
• narušení rovnoměrné fluorescence preparátu vysvícením
(photobleaching) daného regionu
• použití excitačního laseru o vyšší intenzitě –trvalé poškození
fluoroforu
• v místě postupné zvyšování intenzity fluorescence – přesun
fluorescenčních a odbarvených molekul
• různé metody v závislosti na velikosti odbarveného regionu,
počtu odbarvovacích procesů a způsobu analýzy fluorescence
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
Princip FRAP
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
FRAP- malý region 1x odbarvení
obnovení signálu, informace o
mobilitě molekul
FLIP – fluorescence loss in
photobleaching – opakované
odbarvení stejného regionu,
informace o propojení mezi
různými kompartmenty, studium
migrace molekul
iFRAP (inverzní) – celý preparát
kromě 1 regionu odbarven –
postupné vymizení fluorescence
fotoaktivace – analýza rychlých
difúzních procesů
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
FRET: Förster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer
• studium interakce fluorescenčně značených molekul
• měření nanometrových vzdáleností a jejich změn mezi molekulami (1-
10nm)
• 2 fluorofory: donorový + akceptorový
• podmínky: a) překryv emisní spektra donoru s excitačním spektrem
akceptoru, b) vzdálenost do 10nm, c) orientace
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
Princip přenosu energie mezi fluorofory
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
Princip FRET
interakce receptor-ligand
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
Další aplikace FRET
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
aplikace FRET
biosenzory- měření koncentrace vápníku
http://www.microscopyu.com/tutorials/flash/spectralimaging/fretbiosensors/index.html
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
Podmínky pro mikroskopii živých buněk
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
Mikroskopie živých buněk
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
Mikroskopie živých buněk
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
Inkubační (perfúzní) komůrka
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2019 - 04 / 3.4.
Live imaging
http://www.youtube.com/watch?f
eature=endscreen&NR=1&v=Nrw
u0YhGx5o