Konfokální mikroskopie
a nové trendy ve fluorescenční
mikroskopii
RNDr. Jan Škoda, Ph.D. (přednáší Mgr. Blanka Jančeková, Ph.D.)
Ústav experimentální biologie PřF MU
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Program přednášky
 Historie a princip konfokální mikroskopie
 Typy konfokálních mikroskopů
 Multifotonová mikroskopie
 Možnosti zobrazení
 Rozlišení a dekonvoluce
 Superrozlišovací mikroskopie
 Speciální metody ve flouorescenční mikroskopii
2
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Historie konfokální mikroskopie
Marvin Lee Minsky
(9. srpna 1927 – 24. ledna 2016)
 kognitivní vědec; studium umělé
inteligence
 studium nervových sítí v mozku
 snaha zaznamenávat děje v živých
tkáních
Standardní (widefield) fluorescenční mikroskop
Neostrý obraz tkáně
mozku z důvodu
zachycení fluorescence
struktur mimo rovinu
ostrosti
ALE JAK?
3Historie a princip konfokální mikroskopie
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Historie konfokální mikroskopie
 Marvin Minsky sestrojil první konfokální mikroskop (1957 podal patent)
 navrhl konstrukci pro procházející i odražené světlo
a b
b
a
http://www.google.com/patents/US3013467
4Historie a princip konfokální mikroskopie
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Princip konfokálního mikroskopu
 Konstrukce konfokálního mikroskopu umožňuje odfiltrovat fluorescenční signál z oblastí
preparátu mimo rovinu ostrosti a detekovat fluorescenční signál pouze z úzké roviny
ostrosti preparátu = umožňuje zobrazit optické řezy
 základem jsou 2 konfokální bodové clonky v dráze světla (pinhole apertures)
• a) před zdrojem světla → úzký paprsek světla do konkrétního bodu
• b) před detektorem → propustí pouze světlo zaostřené na úzkou rovinu
 konfokální = konjugovaný + fokální (tj. sdružený s ohniskem); do stejného bodu je
zaostřen paprsek osvětlující i paprsek zprostředkující pozorování = obě bodové clonky
jsou v tzv. konjugovaných rovinách ostrosti (současně zaostřené)
5Historie a princip konfokální mikroskopie
a b
b
a
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
DetectorDetectorDetectorDetector
Princip konfokálního mikroskopu
Světlo excituje širokou
oblast vzorku a do detektoru
se dostává i fluorescence
mimo rovinu ostrosti
Bodová clona před
detektorem blokuje průniku
signálů mimo rovinu ostrosti
Konfokální bodová clona zaostřuje světlo do shodné
roviny ostrosti v pozorované oblasti – redukce
nežádoucí fluorescence mimo zaostření
Dichroické zrcátko umožňuje, aby
zdroj světla byl v rámci mikroskopu
umístěn ve stejné rovině jako
detektor
6Historie a princip konfokální mikroskopie
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Princip konfokálního mikroskopu - tloušťka optického řezu
Rozlišení v ose Z = tloušťka optického řezu závisí na:
 vlnové délce excitace/emise (Rx-y=/2NA)
 numerické apertuře objektivu
 indexu lomu komponent v optické dráze
 průměru bodové clonky (pinhole) → ve většině
konfokálních mikroskopů nastavitelná velikost clony
 Rz asi 2x větší než Rx-y
Malý průměr bodové clonky – propouští signály z
tenkého řezu → (+) z jiných rovin jsou signály
odfiltrovány; (-) prochází minimum světla
Velký průměr bodové clonky – (+) vyšší intenzita
signálu; (-) propouští signály v rovině ostrosti
i mimo ni
Detector
Detector
7Historie a princip konfokální mikroskopie
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Princip konfokálního mikroskopu - tvorba výsledného obrazu
 bodová clonka umístěná před zdroj světla určuje velikost bodu, který bude v
jednom momentu osvětlen
 uspořádání mikroskopu tak umožňuje v jednom kroku získat informaci pouze
o jednom bodu (velmi omezené oblasti)
 pro sestavení obrazu celé roviny je nutné postupně nasnímat signál z
dostatečného množství bodů dané roviny.
3 možnosti snímání vzorku
a) pohybuje se vzorek (Minsky)
b) pohybuje se objektiv (David Egger a Paul Davidovits; doi:10.1038/223831a0)
c) pohybuje se paprsek světla – (skenování, rastrování)
• multiple-beam scanning – konfokální mikrokop na bázi Nipkowova disku
• single-beam scanning – laserový skenovací konfokální mikroskop
8Historie a princip konfokální mikroskopie
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Konfokální mikroskop dle Marvina Minsky
 omezení neostrého signálu
 zvýšení signálu proti pozadí
 zvýšení rozlišení
 mikroskopie silných a členitých preparátů
s dostatečným rozlišením
× ve své době tento pokrok zůstal bez odezvy,
neboť Minsky nenašel vhodný (dostatečně
výkonný) zdroj světla pro konstrukci funkčního
× celkový obraz (složení jednotlivých bodů) vytvářen
pomocí pohybu stolku s preparátem
× počítače nebyly dostatečně výkonné a dostupné –
obraz byl promítán skrze armádní radar (bez záznamu;
snímek zobrazen 10s, pak nový sken)
Memoár Marvina Minsky: http://web.media.mit.edu/~minsky/papers/ConfocalMemoir.html
9Historie a princip konfokální mikroskopie
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
prof. Mojmír Petráň (28. března 1923) shlédnout dokument ČT
 profesor biofyziky; působil na Lékařské fakultě UK v Plzni
 modifikace Nipkowova disku pro optickou mikroskopii a zároveň zajišťující
konfokální efekt → Tandem Scanning Confocal Microscope
 v roce 1967 patentoval v USA se spolupracovníkem Milanem Hadravským
 1968 – výroba v rámci JZD Komorno u Plzně v jednotkách kusů
Konfokální mikroskop na bázi rotujícího Nipkowova disku
10Typy konfokálních mikroskopů
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
 Paul Nipkow (1860–1940) - německý inženýr polského původu
 mechanické zařízení, které umožnilo přenos obrazu na dálku, (rychle rotující
perforovaná destička, na které je mnoho vzájemně oddělených clonek
(pinhole) a přes kterou je světlo zaměřováno na studovaný objekt)
 obsah obrazu převádí řádkováním na jeden světelný a elektrický průběh
 snímání a rozklad obrazu pomocí rotujícího disku po obvodu opatřeného
otvory umístěnými ve spirále, vyžaduje 1 snímací fotočlánek, 1884 patentoval
 1925 byl Nipkowův disk použit pro první (mechanickou) třicetiřádkovou televizi
(5 snímků/s)
11Typy konfokálních mikroskopů
Nipkowův disk
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
 redukce velikost disku i otvorů; zvýšení
počtu otvorů z desítek na tisíce
 na zorné pole prochází světlo asi
z 1000 otvorů
 při rotaci jsou pokryty prostory původně
neosvícené → vykrytí celého zorného pole
 rychlost až 1000 (2000) snímků/s
12Typy konfokálních mikroskopů
Konfokální mikroskop na bázi rotujícího Nipkowova disku
Spinning Disk Confocal Microscopy (SDCM)
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Laserový skenovací (rastrovací) konfokální mikroskop
 rozvoj od konce 70. let 20. století
 rastrování probíhá rozmítáním (posunem) paprsku pomocí natáčecích zrcadel
– umístěny mezi dichroické zrcadlo a objektiv
 snímání všech bodů roviny (princip jako pohyb po stínítku televize)
 rychlost maximálně 30 snímků/s
Laser Scanning Confocal Microscope (LSCM)
13Typy konfokálních mikroskopů
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Detekce signálu u LSCM
Laserový skenovací konfokální mikroskop snímá vždy
intenzitu signálu jen z jednoho bodu v daném čase,
nikoli z plochy.
Fotonásobič (photo-multiplier tube, PMT)
 citlivý detektor světla (UV, VIS, near IR)
 zesiluje signál přinášený světelným paprskem
(fluorescence z preparátu)
Princip fotonásobiče
 konverze fotonu na elektron (fotokatoda)
 znásobení elektronů (dynody)
 detekce signálu – proudu (anoda)
 signál z fotonásobiče je registrován
počítačem spolu s informací o x-y
souřadnicích analyzovaných bodů
14Typy konfokálních mikroskopů
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Moderní konfokální mikroskopie
 zdroj světla – laser
 detektor: CCD kamera (SDCM),
fotonásobič (LSCM)
 obraz tvořen v PC
• zaznamená intenzitu signálu a polohu
bodu
• v rastru naskenována jedna rovina
praparátu, posun do jiné roviny
• software umožňuje skládání obrazů
(velké objekty v ose X-Y; tlusté objekty
v ose Z)
• 3D a 4D projekce
Konfokální mikroskop Nikon A1+
Konfokální mikroskop Olympus FluoView FV1200
15Typy konfokálních mikroskopů
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Srovnání LSCM a SDCM
Laser Scanning Confocal Microscopy Spinning Disk Confocal Microscopy
Nutnost snímat obraz bod po bodu → delší
doba rastrování = max. 30 snímků/s
V jednom okamžiku snímáno více bodů →
obraz rastrován 100–1000krát rychleji
Fotonásobič schopný detekovat pouze 15–45
% fluorescence = zvýšení rychlosti skenování
snižuje množství fotonů, které dopadnou na
fotonásobič a tím zvyšuje šum ve výsledném
obrazu → nutno využít vyšší excitační energii
laseru
Obraz rastrován otvory v disku paralelně –
ve stejném čase (v porovnání s LSCM) je
naskenováno více bodů obrazu (i
opakovaně) → lze využít nižší intenzity
osvětlení = nižší vysvícení (photobleaching)
preparátu, nižší fototoxicita
Postupné snímání bodů → lepší axiální
rozlišení (v ose Z)
„Pinhole crosstalk“ – průchod odraženého
světla skrze sousední otvory v disku →
zvýšené pozadí pro tlusté vzorky a snížení
axiálního rozlišení
Snadno lze využít metody FRAP, fotoaktivace
a fotokonverze
Nutno zabudovat přídavný polohovatelný
laser pro lokální vysvícení/aktivaci fluoroforů
→ Výhodné pro kolokalizační studie → Výhodné pro life imaging, zejména
rychlých dynamických procesů
16Typy konfokálních mikroskopů
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Schéma principu skenování u konfokálních mikroskopů
17Typy konfokálních mikroskopů
http://www.olympusamerica.com/seg_section/images/product/detail_full/1009_secondary_lg.jpg
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Standarní fluorescenční mikroskop
 vznik fluorescence i v oblastech
vzorku, který je mimo zaostření –
interferuje s fluorescencí v místě
zájmu
 platí pro preparáty tlustější jak
2µm
 celý vzorek ozářen – celé zorné
pole lze sledovat nebo
zaznamenat (kamera)
 rozlišení v ose Z: 2-3 µm
Srovnání standardního (widefield) a konfokálního mikroskopu
Konfokální fluorescenční mikroskop
 omezení signálu který je mimo
rovinu ostrosti → zvýšení rozlišení
 jeden nebo více světelných paprsků
„skenuje“ plochu zorného pole
 získání optického řezu = 1 obrázek
z dané roviny zaostření
 lze tedy zaostřit do jakékoliv roviny
buňky (objektu) bez fyzického řezání
 automatické získání obrazů z více
rovin - tvorba 3D obrazu
 optické rozlišení v ose Z: 0,5µm
18Typy konfokálních mikroskopů
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Srovnání konfokálního a standardního (widefield) mikroskopu
Standardní
fluorescenční
mikroskop
Konfokální
mikroskop
Standardní
fluorescenční
mikroskop
Konfokální
mikroskop
Výhody konfokální mikroskopie
 vymezená hloubka ostrosti – možnost
snímání optických řezů vzorkem
 eliminace signálu (jasu) z rovin mimo
zaostření
 lze snímat objemnější živé objekty
Online tutoriál 1
Myšímozkovátkáň
19Typy konfokálních mikroskopů
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Multifotonová fluorescenční mikroskopie
 Metoda podobná LSCM (hardware, detektor)
 Pozorování vzorků s velkou optickou hloubkou in vivo (Pozorování nervových sítí,
mikrovaskulatury atp., in vivo studie, excitace jednotlivých organel)
 Infračervený pulsní laser - excitace fotony s nižší energií (větší vlnová délka světla) =
menší poškození vzorku
 Biologický materiál lépe absorbuje světlo o větší vlnové délce – fotony pronikají hlouběji
 dvoufotonová: využívá současné absorbce 2 fotonů k excitaci fluorochromu
 třífotonová: využívá současné absorbce 3 fotonů
Multifotonová fluorescenční mikroskopie 20
https://www.youtube.com/watch?v=MFeS5ZUECDU
Multiphotom microscopy (MPM)
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Dvoufotonová fluorescenční mikroskopie
 energie dodaná fluorochromu současnou absorpcí dvou fotonů o dané vlnové délce
→ excitace 1 elektronu
 současně = v intervalu 10-18 s
 2 excitační fotony mají přibližně dvakrát větší vlnovou délku a poloviční energii
jako jednotlivý foton schopný vyvolat excitaci fluorochromu
21
Základním principem je excitace dvěma fotony o větší vlnové délce a nižší energii
 pravděpodobnost absorbce 2 fotonů
fluoroforem je velmi nízká → nutná vysoká
denzita fotonů (1.000.000x vyšší než
současně = v intervalu 10-18 s
• vyžaduje vysoce účinný pulsní IR laser
(např. titan-safírový) = drahé
Multifotonová fluorescenční mikroskopie
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Emise fluorescence v ose Z v rámci preparátu
a) dvoufotonový mikroskop (v místě zaostření)
b) konfokální mikroskop (v celé hloubce preparátu)
Dvoufotonová fluorescenční mikroskopie
 excitace fluoroforu zejména v místě
zaostření paprsku laseru (je zde vyšší
pravděpodobnost absorbce 2 fotonů než v
místech, kde je paprsek více rozptýlený)
 excitace je lokalizována do velmi malého
bodu (1 femtolitr = 10-15l)
• To snižuje fototoxicitu
• nedochází tak k rychlému vysvícení v
celé hloubce preparátu
 omezení nezaostřeného obrazu = není
potřeba bodová clona
 snímání signálu pomocí fotonásobiče
 jeden snímaný bod = 1pixel (voxel)
a b
22Multifotonová fluorescenční mikroskopie
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Wide-field vs. Confocal vs. Multi-photon
23Multifotonová fluorescenční mikroskopie
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Možnosti zobrazení
 1 optická rovina (řez)
24Možnosti zobrazení
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
apoptotické buňky linie P19,
modrá: DAPI; červená: phalloidin-TRITC
Možnosti zobrazení
Z-Serie a 3D zobrazení
 sekvence optických řezů z různých rovin kolmých na osu Z
 skládání řezů při postupném posouvání preparátu v ose Z
 krok a celkovou hloubku posunu lze navolit
 řezy lze softwarově sečíst nebo spojit v animaci
25Možnosti zobrazení
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Možnosti zobrazení
3D zobrazení
 optické řezy z různých rovin kolmých na osu Z
 tvorba 3D snímku
26Možnosti zobrazení
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
detekce nestinu v buňce glioblastomu svalová vlákna
Možnosti zobrazení
X-Z, Y-Z zobrazení
 Ze souboru horizontálních řezů lze rekonstruovat vertikální optické řezy vzorkem - lze
vidět preparát „z boku“
27Možnosti zobrazení
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Možnosti zobrazení
Maximum intensity projection (MIP) ze souboru horizontálních řezů
28Možnosti zobrazení
http://microscopy.duke.edu/3D
Gallery view of 3 color Z-stack Maximum intensity projection
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Živé embryo
D. melanogaster po injekci
calcium green – změny
distribuce v čase
Možnosti zobrazení
Časosběrné snímání a zobrazení živých buněk (objektů), 4D
 rozdíly mezi živým a fixovaným objektem
29Možnosti zobrazení
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Rozlišovací schopnost mikroskopu
- minimální vzdálenost dvou bodů objektu, které se ještě
zobrazí jako navzájem oddělené, tzn. nesplynou v jeden bod
Rozlišovací schopnost mikroskopu ovlivňují:
 difrakce světla - ohyb světla na štěrbině nebo překážce
 numerická apertura objektivu
 kondenzor
 vady čoček
Difrakce světla
- jev odchýlení světla od přímočarého
směru šíření, které není způsobeno
odrazem, či lomem
- vzniká při průchodu světla optikou
mikroskopu
- ovlivňuje výsledný obraz (konvoluce)
- optické rozlišení (difrakční limit) závisí
na vlnové délce
30Rozlišení a dekonvoluce
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Konvoluce – praktické dopady
Vliv zaostření na velikost Airyho disku
Částice v rovině ostrosti Nezaostřené částice
Žádný objektiv nemůže zobrazit bodový objekt opět jako bod. Obrazem bodu
jsou Airyho kroužky/disky - difrakční obrazec vznikající ohybem
zobrazujícího se světla na čočkách objektivu.
Airyho kroužky limitují rozlišení jednotlivých bodů v mikroskopu.
31Rozlišení a dekonvoluce
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Rozptylová funkce (point spread function, PSF)
- matematická funkce, která popisuje tvar, do nějž se v
mikroskopu vykreslí bodový zdroj světla
- při zobrazení v ploše ji popisuje Airyho funkce
- Sestává se z nejintenzivnějšího maxima prvního
řádu, okolo nějž jsou výrazně méně intenzivní
maxima vyšších řádů, tzv Airyho disky
- Obraz, který pozorujeme v mikroskopu, je konvolucí
(„kombinací“) signálu pozorovaného objektu a
rozptylové funkce, která je důsledkem difrakce světla
- .
32Rozlišení a dekonvoluce
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Dekonvoluce
 počítačové zpracování obrazu
 SW na základě znalosti PSF odstraní signál vznikající difrakcí světla
 zvýšení kontrastu a rozlišení - odstranění neostrých částí obrazu
 2D dekonvoluce - lze využít pro tvorbu 3D obrazu z jednotlivě upravených nasnímaných
rovin
 3D dekonvoluce – každý pixel 3D obrazu (náročná na čas a výkon počítače)
 https://svi.nl/HuygensDeconvolution
Původní snímek Po dekonvoluci
33Rozlišení a dekonvoluce
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Maximální rozlišení optického mikroskopu - difrakční limit
34Rozlišení a dekonvoluce
http://e-svet.e15.cz/technika/nobelova-cena-za-chemii-patri-vynalezcum-nanoskopie-1125912
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Superrozlišovací mikroskopie
 optická mikroskopie umožňující pozorovat objekty s rozlišením vyšším než
difrakční limit
 2014 – Eric Betzig, Stefan Hell a William Moerner
Nobelova cena za chemii: "for the development of super-resolved
fluorescence microscopy„
 Odůvodnění rozhodnutí Královské švédské akademie věd: "Vyvinutím
fluorescenčního mikroskopu s velmi vysokým rozlišením přeměnili optickou
mikroskopii do nanoskopie
35Superrozlišovací mikroskopie
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Superrozlišovací mikroskopie
 Nevýhody elektronové mikroskopie:
• vzorek je vždy fixovaný
• metoda je náchylná k tvorbě artefaktů
• značení konkrétních molekul je složité
 Výhody superrezoluce:
• vzorek může být živý
• zpracování vzorku je jednoduché
• (ko)lokalizujeme konkrétní molekuly
 Druhy rezoluce:
• Vylepšená geometrie fluorescenčního mikroskopu (konfokální, SIM, 4Pi)
• Stimulovaná deplece emise (STED)
• Lokalizace jednotlivých molekul (PALM, STORM)
36Superrozlišovací mikroskopie
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Přehled superrozlišovacích metod
Metody dalekého pole (Far-field) (zobrazení vnitřních struktur vzorku)
 Konfokální zobrazování
• 4Pi mikroskopie
• STED - Stimulated Emission Depletion
 Celoplošné zobrazování (Wide-field)
Mikroskopie se strukturním osvětlením
• SIM - Structured Illumination Microscopy
Lokalizační mikroskopie (stochastická lokalizace):
• STORM - Stochastic Optical Reconstruction Microscopy
• PALM - Photoactivation Localization Microscopy
• FPALM - Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy
• GSDIM - Groud State Depletion followed by Individual Molecule return (NC
2014, Eric Betzig a William Moerner)
Metody blízkého pole (Near-field) (zobrazení povrchu vzorku)
• NSOM - Near-field Scanning Optical Microscopy
37Superrozlišovací mikroskopie
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
4pi mikroskopie (1991 – vynalezl Stefan Hell)
 využívá druhého objektivu, který snímá opačnou stranu vzorku
 zaostřeny do stejného bodu → výsledný součet 2 signálů (vlnoploch) přináší až
7x lepší rozlišení v ose Z oproti běžnému konfokálnímu mikroskopu
Histon H2AX
(zelená barva)
Bewersdorf et al.,
Proc Natl Acad
Sci U S A, 2006
38Superrozlišovací mikroskopie
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Vyčerpání stimulovanou emisí (STED)
Stimulated Emission Depletion
 1994 – vynalezl Stefan Hell a Jan Winchmann
 spolu s excitačním světlem se oblast ozáří i světlem s delší vlnovou
délkou (tvar mezikruží; depletion donut, STED pattern)
 v oblasti STED dochází k vyzáření fluorescence o vlnové délce shodné s
depletion beam = odfiltrováno
 zůstává fluorescenční záření pouze v nezhášené oblasti uvnitř mezikruží
 Výkonný pulsní laser - drahé
39Superrozlišovací mikroskopie
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
STED
 laterální rozlišení (osy X-Y) obecně asi 20 nm, axiální (osa Z) 40-50 nm
40Superrozlišovací mikroskopie
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
STED
Histon H3 (zelená); mikrotubuly (červená) Proteinové komplexy jaderného póru
41Superrozlišovací mikroskopie
https://www.youtube.com/watch?time_continue=4&v=B4m_Y747gzw
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Mikroskopie se strukturovaným osvětlením (SIM)
 Levná a jednoduchá metoda pro získání optických řezů
 Využívá standartní wide-field mikroskop
 osvětlení vzorku světlem s pruhovaným vzorem vzniklým difrakcí na mřížce
 5-7 snímků přes mřížku pro vytvoření obrazu
 Efekt vyvolaný osvětlením přes mřížku se používá k identifikaci fluoroforů, které
se nachází v rovině zaostření jednotlivých snímků – složení obrazu
Structured Illumination Microscopy
42Superrozlišovací mikroskopie
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Velké množství fluorochromů
(cílových molekul) a příliš blízko
→ nelze rozlišit jednotlivé molekuly
Single-Molecule Superresolution Imaging
 STORM – stochastic optical reconstruction microscopy
 PALM – photoactivated localization microscopy (vynalezl Eric Betzig)
 FPALM – fluorescence photoactivation localization microscopy
 využívají wide-field mikroskopii
 vychází z fluorescence jednotlivých (nepřekrývajících se) molekul
fluorochromů (single-molecule imaging)
43Superrozlišovací mikroskopie
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Single-Molecule Superresolution Imaging
1. Snímek fluorescence
jednotlivých molekul
(nepřekrývajících se)
fluochromů = snímek
obsahuje pouze omezený
počet signálů
2. Softwarově určen střed
(pozice) daných molekul
3. Další snímek zaznamená
jiné nepřekrývající se
fluorochromy
4. Softwarově určen střed
(pozice) těchto molekul
5. Výsledný obraz je tvořen
složením (překryvem)
tisíců takových snímků
44Superrozlišovací mikroskopie
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Single-Molecule Superresolution Imaging
 William Moerner: „photoswitchable“ značka - eYFP lze reaktivovat modrým
světlem (405 nm) → lze znovu excitovat světlem 488 nm
 značky (fluorescenční proteiny, fluorochromy) musí umožňovat změnu
spektrálních vlastností za pomoci světla o definované délce
(Chozinski et al., FEBS Lett, 2014)
 fotoaktivace (photoactivation)
 „fotopřepínání“ (photoswitching)
 fotokonverze (photoconversion)
 použití laseru s nízkou intenzitou
 jednotlivé molekuly fluorochromů
– nízká pravděpodobnost zásahu
a změny stavu (off→on)
45Superrozlišovací mikroskopie
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
http://www.microscopyu.com/tutorials/flash/superresolution/storm/index.html
Single-Molecule Superresolution Imaging
Systém dvojice fluorochromů: aktivátor + „photoswitchable“ reportér
46Superrozlišovací mikroskopie
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM)
 laterální rozlišení <10 nm, axiální rozlišení <20 nm
47
Mikrotubuly (zelená), klatrinem potažené jamky (červená; clathrin-coated pits)
Superrozlišovací mikroskopie
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
 modifikace: do objektivu přidána cylindrická čočka – cílená změna PSF
 lze určit pozici v rovině Z a zobrazit v rámci snímku
3D-STORM
48Superrozlišovací mikroskopie
(Huang et al., Science, 2008)
Mikrotubuly – pozice v Z rovině odpovídá barvě
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
3D-STORM
49
Aktin – pozice v Z rovině
odpovídá barvě
Superrozlišovací mikroskopie
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Porovnání rozlišení zobrazovacích technik
50Superrozlišovací mikroskopie
x / y z
• Wide-field fluorescenční MS: 230 1000 nm
• Konfokální a multiphoton MS : 180 500
• Superrezoluční MS: 4Pi 200 90
SIM: 100 250
STED, PALM, STORM: 20 50
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Light Sheet Fluorescence Microscopy (LSFM)
 zdroj světla je umístěn kolmo k optické dráze
 osvětlení vzorku pomocí úzké roviny světla (light sheet)
 nedochází k excitaci fluoroforů mimo rovinu světla = vhodné pro optické řezy
 vzorek uzavřen v agaróze, hydrogelu ve skleněné kapiláře (nedochází k
deformacím objektu); posun objektu a otáčení → skládání 3D obrazu
 výhodná zobrazovací metoda pro 3D zobrazování velkých objektů
51Speciální metody ve flouorescenční mikroskopii
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Light Sheet Fluorescence Microscopy (LSFM)
52
Medaka japonská – acetylovaný tubulin (zelená) Hlava medaky – 20x zvětšeno
Speciální metody ve flouorescenční mikroskopii
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Total internal reflection fluorescence (TIRF)
 velmi vhodná metoda pro studium dějů na membráně
 výborné axiální rozlišení
 „evanescent wave“ proniká
v preparátu pouze do hloubky
cca 100nm
53Speciální metody ve flouorescenční mikroskopii
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Total internal reflection fluorescence (TIRF)
54
F-aktin (zelená) v nádorové buněčné linii
Speciální metody ve flouorescenční mikroskopii