í Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii RNDr. Jan Skoda, Ph.D. (přednáší Mg r. Blanka Janče ková, Ph.D.) Ústav experimentální biologie PřF MU é * *s3 ^^^^fc I ministerstvo školství. EVROpSkAuniE v %p I mlAoeíe a iélovychovt INVESTICE 00 ROZVOJE VZDĚLÁVÁNI Tato prezentace je spolu finance v á na Evropským sociálním fondem a slálnim roľpočlem České republiky BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii Program přednášky Historie a princip konfokální mikroskopie Typy konfokálních mikroskopů Multifotonová mikroskopie Možnosti zobrazeni Rozlišení a dekonvoluce Superrozlišovací mikroskopie Speciální metody ve flouorescenční mikroskopii Historie konfokální mikroskopie Marvin Lee Minsky (9. srpna 1927-24. ledna 2016) kognitivní vědec; studium umělé inteligence studium nervových sítí v mozku snaha zaznamenávat děje v živých tkáních ALE JAK? Standardní (widefield) fluorescenční mikroskop 1 DtltClOf Neostrý obraz tkáně mozku z důvodu zachycení fluorescence struktur mimo rovinu ostrosti Fötal pli n* 5torie a princip konfokální mikroskopie Historie konfokální mikroskopie ■ Marvin Minsky sestrojil první konfokální mikroskop (1957 podal patent) ■ navrhl konstrukci pro procházející i odražené světlo http: //www .google, c om/patents/US3013467 5torie a princip konfokální mikroskopie Princip konfokálního mikroskopu ■ Konstrukce konfokálního mikroskopu umožňuje odfiltrovat fluorescenční signál z oblastí preparátu mimo rovinu ostrosti a detekovat fluorescenční signál pouze z úzké roviny ostrosti preparátu = umožňuje zobrazit optické řezy ■ základem jsou 2 konfokální bodové clonky v dráze světla (pinhole apertures) a) před zdrojem světla úzký paprsek světla do konkrétního bodu b) před detektorem —> propustí pouze světlo zaostřené na úzkou rovinu ■ konfokální = konjugovaný + fokální (tj. sdružený s ohniskem); do stejného boduje zaostřen paprsek osvětlující i paprsek zprostředkující pozorování = obě bodové clonky jsou v tzv. konjugovaných rovinách ostrosti (současně zaostřené) Princip konfokálního mikroskopu contocal pinhotes Světlo excituje širokou oblast vzorku a do detektoru se dostává i fluorescence mimo rovinu ostrosti 1 dichroic mirror Bodová clona před detektorem blokuje průniku signálů mimo rovinu ostrosti ■ji :>•.:■ objed rial in focal piane objeci in local plana Konfokální bodová clona zaostřuje světlo do shodné i roviny ostrosti v pozorované oblasti - redukce nežádoucí fluorescence mimo zaostření Dichroické zrcátko umožňuje, aby zdroj svetla byl v rámci mikroskopu umístěn ve stejné rovině jako detektor BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii Princip konfokálního mikroskopu - tloušťka optického řezu ľi n hi ik' — II— U— \l— Tootl Rozlišení v ose Z = tloušťka optického řezu závisí na: ■ vlnové délce excitace/emise (Rx_y=?J2NA) ■ numerické apertuře objektivu ■ indexu lomu komponent v optické dráze ■ průměru bodové clonky (pinhole) —* ve většině konfokálních mikroskopů nastavitelná velikost clony ■ Rz~ asi 2x větší než R Malý průměr bodové clonky - propouští signály z tenkého řezu —» (+) z jiných rovin jsou signály odfiltrovány; (-) prochází minimum světla Velký průměr bodové clonky - (+) vyšší intenzita signálu; (-) propouští signály v rovině ostrosti i mimo ni 5torie a princip konfokální mikroskopie BÍ3920 Fluorescenční mikroskopie - Konfokální mikroskop Princip konfokálního mikroskopu - tvorba výsledného obrazu ■ bodová clonka umístěná před zdroj světla určuje velikost bodu, který bude v jednom momentu osvětlen ■ uspořádání mikroskopu tak umožňuje v jednom kroku získat informaci pouze o jednom bodu (velmi omezené oblasti) ■ pro sestavení obrazu celé roviny je nutné postupně nasnímat signál z dostatečného množství bodu dané roviny. 3 možnosti snímání vzorku a) pohybuje se vzorek (Minsky) b) pohybuje se objektiv (David Egger a Paul Davidovits; doi:io.io3oV22383iao) c) pohybuje se paprsek světla - (skenování, rastrování) • multiple-beam scanning - konfokální mikrokop na bázi Nipkowova disku • single-beam scanning - laserový skenovací konfokální mikroskop 5torie a princip konfokální mikroskopie BÍ3920 Fluorescenční mikroskopie - Konfokální mikroskop Konfokální mikroskop dle Marvina Minsky Me m oá r M a rv i n a M i n sky: h tt p: //we b. m ed i a. m i t. ed uhin i n s ky/pa pe rs/Co nf oc a IM e m o i r. htm I ■ omezeni neostrého signálu ■ zvýšení signálu proti pozadí ■ zvýšení rozlišení ■ mikroskopie silných a členitých preparátů s dostatečným rozlišením x ve své době tento pokrok zůstal bez odezvy, neboť Minsky nenašel vhodný (dostatečně výkonný) zdroj světla pro konstrukci funkčního ■ r celkový obraz (složení jednotlivých bodů) vytvářen pomocí pohybu stolku s preparátem počítače nebyly dostatečně výkonné a dostupné -obraz byl promítán skrze armádní radar (bez záznamu; snímek zobrazen 10s. pak nový sken) 5torie a princip konfokální mikroskopie BÍ3920 Fluorescenční mikroskopie - Konfokální mikroskop Konfokální mikroskop na bázi rotujícího Nipkowova disku prof. Mojmír Petran (28. března 1923) shlédnout dokument ČT ■ profesor biofyziky; působil na Lékařské fakultě UK v Plzni ■ modifikace Nipkowova disku pro optickou mikroskopii a zároveň zajišťující konfokální efekt > Tandem Scanning Confocal Microscope ■ v roce 1967 patentoval v USA se spolupracovníkem Milanem Hadravským ■ 1968 - výroba v rámci JZD Komorno u Plzně v jednotkách kusů BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii Nipkowův disk Paul Nipkow (1860-1940) - německý inženýr polského původu mechanické zařízení, které umožnilo přenos obrazu na dálku, (rychle rotující perforovaná destička, na které je mnoho vzájemně oddělených clonek (pinhole) a přes kterou je světlo zaměřováno na studovaný objekt) obsah obrazu převádí řádkováním na jeden světelný a elektrický průběh snímání a rozklad obrazu pomocí rotujícího disku po obvodu opatřeného otvory umístěnými ve spirále, vyžaduje 1 snímací fotočlánek, 1884 patentoval 1925 byl Nipkowův disk použit pro první (mechanickou) třicetiřádkovou televizi (5 snímků/s) Routing disk tilth spiral of hůl t ä I i I i! 6 * fetoiÉ disk rotating at the same speed Screen IrflAqt konfc kál nich inikroskopi Konfokální mikroskop na bázi rotujícího Nipkowova disku Spinning Disk Confocal Microscopy (SDCM) redukce velikost disku i otvoru; zvýšení počtu otvoru z desítek na tisíce na zorné pole prochází světlo asi z 1000 otvoru při rotaci jsou pokryty prostory původně neosvícené —» vykrytí celého zorného pole rychlost až 1000 (2000) snímkú/s Spinning Disk Scan Pattern ■ J NiphoWPetráň Disk Archimedean Spi'tl Figuře 2 Yokogawa Spinning Dish Unit Optical Configuration Shaped and Coll Ima1 eel ■ L j ser Ultimi nation Ho n tm hrome CCD Camera f.....u l* [Nipko*) Wum ŕrr.iy Tub* DlLhřůrflilif; L Hfl* e«f n4pli||«r Orjj«cti» -Emulation and Emission Light Figure 1 Specimen BÍ3920 Fluorescenční mikroskopie - Konfokální mikroskop Laserový skenovací (rastrovací) konfokální mikroskop Laser Scanning Confocal Microscope (LSCM) ■ rozvoj od konce 70. let 20. století ■ rastrování probíhá rozmítáním (posunem) paprsku pomocí natáčecích zrcadel - umístěny mezi dichroické zrcadlo a objektiv ■ snímání všech bodů roviny (princip jako pohyb po stínítku televize) ■ rychlost maximálně 30 snímků/s BÍ3920 Fluorescenční mikroskopie - Konfokální mikroskop Detekce signálu u LSCM Laserový skenovací konfokální mikroskop snímá vždy intenzitu signálu jen z jednoho bodu v daném čase, nikoli z plochy. Fotonásobič (photo-multiplier tube, PMT) ■ citlivý detektor světla (UV, VIS, near IR) ■ zesiluje signál přinášený světelným paprskem (fluorescence z preparátu) Photo-multiplier tube Incoming Photon y „„ . \ Window cathode / '\ PhotomuHiplier Tube Focusing Electrode Figuro 1 : I ľ- ILL .ILL Völlige Dropping ^ Resistors Power Supply Qui put Meier Princip fotonásobiče ■ konverze fotonu na elektron (fotokatoda) ■ znásobení elektronů (dynody) ■ detekce signálu - proudu (anoda) ■ signál z fotonásobiče je registrován počítačem spolu s informací o x-y souřadnicích analyzovaných bodů i/py konfc kál nich inikroskopi BÍ3920 Fluorescenční mikroskopie - Konfokální mikroskop Moderní konfokální mikroskopie ■ zdroj světla - laser ■ detektor: CCD kamera (SDCM), fotonásobič (LSCM) ■ obraz tvořen v PC • zaznamená intenzitu signálu a polohu bodu • v rastru naskenována jedna rovina praparátu, posun do jiné roviny • software umožňuje skládání obrazů (velké objekty v ose X-Y; tlusté objekty v ose Z) • 3D a 4D projekce Konfokální mikroskop Nikon A1 Konfokální mikroskop Olympus FluoView FV1200 konfc kál nich inikroskopi Srovnání LSCM a SDCM Laser Scanning Confocal Microscopy Spinning Disk Confocal Microscopy Nutnost snímat obraz bod po bodu —* delší doba rastrování = max. 30 snímků/s V jednom okamžiku snímáno více bodů —> obraz rastrován 100—10OOkrát rychleji Fotonásobič schopný detekovat pouze 15-45 % fluorescence = zvýšení rychlosti skenování snižuje množství fotonů, které dopadnou na fotonásobič a tím zvyšuje šum ve výsledném obrazu —* nutno využít vyšší excitační energii laseru Obraz rastrován otvory v disku paralelně -ve stejném čase (v porovnání s LSCM) je naskenováno více bodů obrazu (i opakovaně) —» lze využít nižší intenzity osvětlení = nižší vysvícení (photobleaching) preparátu, nižší fototoxicita Postupné snímání bodů —► lepší axiální rozlišení (v ose Z) „Pinhole crosstalk" - průchod odraženého světla skrze sousední otvory v disku —> zvýšené pozadí pro tlusté vzorky a snížení axiálního rozlišení Snadno lze využít metody FRAP, fotoaktivace a fotokonverze Nutno zabudovat přídavný polohovatelný laser pro lokální vysvícení/aktivaci fluoroforů —► Výhodné pro kolokalizačni studie —► Výhodné pro life imaging, zejména rychlých dynamických procesů Schéma principu skenování u konfokálních mikroskopů Laser scanning Nipkow disk confocal confocal http://www.olympusamericaxom/seg_se(;tion/irnages/produot,'detail_full/1009_secon dary_lg.jpg konfokálních inikroskcpi Srovnání standardního (widefield) a konfokálního mikroskopu Widefield Versus Point Scanning of Specimens Cover Glasig — Sp*tím*ri^ Microscope"" Slide II uminaliííii Beam Widefield Scanning Point Scanning Standarní fluorescenční mikroskop ■ vznik fluorescence i v oblastech vzorku, který je mimo zaostření -interferuje s fluorescencí v místě zájmu ■ platí pro preparáty tlustější jak 2um ■ celý vzorek ozářen - celé zorné pole lze sledovat nebo zaznamenat (kamera) ■ rozlišení v ose Z: 2-3 um L Non-confocal í Confocal Konfokální fluorescenční mikroskop omezení signálu který je mimo rovinu ostrosti > zvýšení rozlišení jeden nebo více světelných paprsků ,:skenuje" plochu zorného pole získání optického řezu = 1 obrázek z dané roviny zaostření lze tedy zaostřit do jakékoliv roviny buňky (objektu) bez fyzického řezání automatické získání obrazů z více rovin - tvorba 3D obrazu optické rozlišení v ose Z: 0,5um Srovnání konfokálního a standardního (widefield) mikroskopu OsTítlnr :iflr-nr Standardní Konfokální fluorescenční mikroskop mikroskop Standardní Konfokální fluorescenční mikroskop mikroskop Výhody konfokální mikroskopie ■ vymezená hloubka ostrosti - možnost snímání optických řezů vzorkem ■ eliminace signálu (jasu) z rovin mimo zaostření ■ lze snímat objemnější živé objekty Online tutoriál 1 Multifotonová fluorescenční mikroskopie Multiphotom microscopy (MPM) ■ Metoda podobná LSCM (hardware, detektor) ■ Pozorování vzorků s velkou optickou hloubkou in vivo (Pozorování nervových sítí, mikrovaskulatury atp., in vivo studie, excitace jednotlivých organel) ■ Infračervený pulsní laser - excitace fotony s nižší energií (větší vlnová délka světla) = menší poškození vzorku ■ Biologický materiál lépe absorbuje světlo o větší vlnové délce - fotony pronikají hlouběji dvoufotonová: využívá současné absorbce 2 fotonů k excitaci fluorochromu třífotonová: využívá současné absorbce 3 fotonů B^____ Dvoufotonová fluorescenční mikroskopie Základním principem je excitace dvěma fotony o větší vlnové délce a nižší energii ■ energie dodaná fluorochromu současnou absorpcí dvou fotonů o dané vlnové délce —► excitace 1 elektronu ■ současně = v intervalu 10~1S s ■ 2 excitační fotony mají přibližně dvakrát větší vlnovou délku a poloviční energii jako jednotlivý foton schopný vyvolat excitaci fluorochromu Two-Photon Jablcmski Energy Diagram pravděpodobnost absorbce 2 fotonů fluoroforem je velmi nízká nutná vysoká denzita fotonů (1.000.000x vyšší než současně = v intervalu 1015 s Single Photon Two-Photo n Excitation Excitation vyžaduje vysoce účinný pulsní IR laser (např. titan-safírový) = drahé Dvoufotonová fluorescenční mikroskopie excitace fluoroforu zejména v místě zaostření paprsku laseru (je zde vyšší pravděpodobnost absorbce 2 fotonů než v místech, kde je paprsek více rozptýlený) excitace je lokalizována do velmi malého bodu (1 femtolitr = 10 15l) • To snižuje fototoxicitu • nedochází tak k rychlému vysvícení v celé hloubce preparátu omezení nezaostřeného obrazu = není potřeba bodová clona snímání signálu pomocí fotonásobiče jeden snímaný bod = 1 pixel (voxel) Emise fluorescence v ose Z v rámci preparátu a) dvoufotonový mikroskop (v místě zaostření) b) konfokální mikroskop {v celé hloubce preparátu) Fluorophore Excitation in Muttiphoton Microscopy Cover Glass Fluorophore» ft I y , Excited * ■ — Fluorophores < at Focal Point Laser Pulses Figure 2 Glass Microscope Slide Wide-field vs. Confocal vs. Multi-photon BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii Možnosti zobrazení ■ 1 optická rovina (fez) Pollen Grain Serial Optical Sections by Confocal Microscopy 1 w 2 3 t ft' 6 S 7 '-ŕ 9 10 * 11 12 ■ * • • • * jžnosti zob raze BÍ3920 Fluorescenční mikroskopie - Konfokální mikroskop Možnosti zobrazení Z-Serie a 3D zobrazení ■ sekvence optických řezů z různých rovin kolmých na osu Z ■ skládání řezů při postupném posouvání preparátu v ose Z ■ krok a celkovou hloubku posunu lze navolit ■ řezy lze softwarově sečíst nebo spojit v animaci apoptotické buňky linie P19, modrá: DAPI; červená: phalloidin-TRITC ;>žnost.i zob raze BÍ3920 Fluorescenční mikroskopie - Konfokální mikroskop Možnosti zobrazení 3D zobrazení ■ optické rezy z různých rovin kolmých na osu Z ■ tvorba 3D snímku jžnosti zob raze Možnosti zobrazení X-Z, Y-Z zobrazení ■ Ze souboru horizontálních řezů lze rekonstruovat vertikální optické řezy vzorke vidět preparát „z boku:: detekce nestinu v buňce glioblastomu svalová vlákna BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii imunními Možnosti zobrazení Maximum intensity projection (MIP) ze souboru horizontálních řezů Gallery view of 3 color Z-stack 1 c t c 0 0 o 0 o o o o o o 49 Maximum intensity projection http:.''/microscopy. duke.edu/3D jžnosti zob raze BÍ3920 Fluorescenční mikroskopie - Konfokální mikroskop Možnosti zobrazení Časosběrné snímání a zobrazení živých buněk (objektů), 4D ■ rozdíly mezi živým a fixovaným objektem Criteria Fixed Cells Living Cells Fading of fluorophore Phototoxicity and fading of dye Antifade reagent Phenylenedlamine, etc. NOME! Mountant Glycerol {n = 1.51} Water (n= 1.33) Highest NA lens 1.4 1.2 Time per image Unlimited Limited by speed of phenomenon; light sensitivity of specimen Time-Lapse Imaging Živé embryo D. melanogaster po injekci calciurn green - změny distribuce v čase jžnosti zob raze lrt»iimt*»3H5FP Rozlišovací schopnost mikroskopu minimální vzdálenost dvou bodů objektu, které se ještě zobrazí jako navzájem oddělené, tzn. nesplynou v jeden bod Rozlišovací schopnost mikroskopu ovlivňují: ■ difrakce světla - ohyb světla na štěrbině nebo překážce ■ numerická apertura objektivu ■ kondenzor ■ vady čoček Difrakce světla jev odchýlení světla od přímočarého směru šíření, které není způsobeno odrazem, či lomem vzniká při průchodu světla optikou mikroskopu ovlivňuje výsledný obraz (konvoluce) optické rozlišení (difrakční limit) závisí na vlnové délce □ i'fMciKin of Coherent Laser LigM Intently Di*utlen Figure 3 377939^^4319 Konvoluce - praktické dopady Žádný objektiv nemůže zobrazit bodový objekt opět jako bod. Obrazem bodu jsou Airyho kroužky/disky - difrakční obrazec vznikající ohybem zobrazujícího se světla na čočkách objektivu. Airyho kroužky limitují rozlišení jednotlivých bodů v mikroskopu. Airy Patterns and the Limit of Resolution Restitution Limit Resolved Unresolved •••• ^ Alfy / Patterns — 1 Airy Disks 7 3-Dimensi ona I Point Spread Function Figure 1 Vliv zaostření na velikost Airyho disku Částice v rovině ostrosti Nezaostřené částice O BÍ3920 Fluorescenční mikroskopie - Konfokální mikroskop Rozptylová funkce (point spread function, PSF) matematická funkce, která popisuje tvar, do nějž se v mikroskopu vykreslí bodový zdroj světla při zobrazení v plose ji popisuje Airyho funkce Sestává se z nejintenzivnějšího maxima prvního řádu, okolo nějž jsou výrazně méně intenzivní maxima vyšších řádů, tzv Airyho disky Obraz, který pozorujeme v mikroskopu, je konvolucí („kombinací') signálu pozorovaného objektu a rozptylové funkce, která je důsledkem difrakce světla HŕíolMt.cn L ".I Imposed Uŕ Wjvř Nitur* oř Lio.ru >M lw«* Pakli buit IHinn n*i U U™*» IrnjQtd 5poí Rur HLow NA] Airy Disk Patterns and PSF* from Diffraction Airy Disk Pattern* # <§> - (a) A (W i W f l Palm SfHHd Functions *** ■---- t Airy Patterns and the Limit o T Resolution Unresolved Resolution Umlt^ Resolved \9/ ^ Airy / Patterns- Airv Disks 7 3-OimenttQfiil Poim Sprt*d F id u re 1 I í *f ■ ■ z I i § e n i a dekonvoluce BÍ3920 Fluorescenční mikroskopie - Konfokální mikroskop Dekonvoluce ■ počítačové zpracování obrazu ■ SW na základě znalosti PSF odstraní signál vznikající difrakcí světla ■ zvýšení kontrastu a rozlišení - odstranění neostrých částí obrazu ■ 2D dekonvoluce - lze využít pro tvorbu 3D obrazu z jednotlivě upravených nasnímaných rovin ■ 3D dekonvoluce - každý pixel 3D obrazu (náročná na čas a výkon počítače) ■ https:y'/svi.nl:fHuygensDeconvolution WĚĚP Acquisition of Optical Sections for Deconvolution Maximální rozlišení optického mikroskopu - difrakční limit Abbého difrakční limit (0,2 pm) Superrozlišovací mikroskopie ■ optická mikroskopie umožňující pozorovat objekty s rozlišením vyšším než difrakční limit ■ 2014 - Eric Betzig, Stefan Hell a William Moerner Nobelova cena za chemii: "for the development of super-resolved fluorescence microscopy,, ■ Odůvodnění rozhodnutí Královské švédské akademie věd: "Vyvinutím fluorescenčního mikroskopu s velmi vysokým rozlišením přeměnili optickou mikroskopii do nanoskopie BÍ3920 Fluorescenční mikroskopie - Konfokální mikroskop Superrozlišovací mikroskopie ■ Nevýhody elektronové mikroskopie: ♦ vzorek je vždy fixovaný * metoda je náchylná k tvorbě artefaktů • značení konkrétních molekul je složité ■ Výhody superrezoluce: ♦ vzorek může být živý • zpracování vzorku je jednoduché * (ko)lokalizujeme konkrétní molekuly ■ Druhy rezoluce: * Vylepšená geometrie fluorescenčního mikroskopu (konfokální, SIM, 4Pi) * Stimulovaná deplece emise (STED) * Lokalizace jednotlivých molekul (PALM, STORM) perrazlišovací mikroskopie Přehled superrozlišovacích metod Metody dalekého pole (Far-field) (zobrazeni vnitrních struktur vzorku) ■ Konfokální zobrazování • 4Pi mikroskopie • STED - Stimulated Emission Depletion ■ Celoplošné zobrazování (Wide-field) Mikroskopie se strukturním osvětlením • SIM - Structured Illumination Microscopy Lokalizační mikroskopie (stochastická lokalizace): • STORM - Stochastic Optical Reconstruction Microscopy • PALM - Photoactivation Localization Microscopy • FPALM - Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy • GSDIM - Groud State Depletion followed by Individual Molecule return (NC 2014, Eric Betzig a William Moerner) Metody blízkého pole (Near-field) (zobrazení povrchu vzorku) • NSOM - Near-field Scanning Optical Microscopy 4pi mikroskopie (1991 - vynalezl Stefan Hell) využívá druhého objektivu, který snímá opačnou stranu vzorku zaostřeny do stejného bodu > výsledný součet 2 signálů (vlnoploch) přináší až 7x lepší rozlišení v ose Z oproti běžnému konfokálnímu mikroskopu Sample DM BS A li Histon H2AX (zelená barva) Bewersdorf et al., Proc Natl Acad Sei USA, 2006 Vyčerpání stimulovanou emisí (STED) Stimulated Emission Depletion ■ 1994 - vynalezl Stefan Hell a Jan Winchmann ■ spolu s excitačním světlem se oblast ozáří i světlem s delší vlnovou délkou (tvar rnezikruží; depletion donut, STED pattern) ■ v oblasti STED dochází k vyzáření fluorescence o vlnové délce shodné s depletion beam = odfiltrováno ■ zůstává fluorescenční záření pouze v nezhašené oblasti uvnitř rnezikruží ■ Výkonný pulsní laser - drahé s, Phase ^5 11 STED laser Excitation Id se r Excitation L STED Saturated pattern depletion o e Zeio pom I Effective PSF STED ■ laterální rozlišení (osy X-Y) obecně asi 20 nm, axiální (osa Z) 40-50 n Phase Plate Depletion Laser The Concept of Superresolutton with STED Microscopy Wjdefield Image —Tube Lens Emission to Detector Dichromatic Mirrors — Objective Specimen STED Microscope Point-Spread Functions Excitation STED Pattern J 0 v Zero Point Saturated Effective OCplCtM.nl PSF (b) STEO 3D PSF Pattern STED Image Figure 1 STED Histon H3 (zelená); mikrotubuly (červená) Proteinové komplexy jaderného póru BÍ3920 Fluorescenční mikroskopie - Konfokální mikroskop Mikroskopie se strukturovaným osvětlením (SIM) Structured Illumination Microscopy ■ Levná a jednoduchá metoda pro získáni optických řezů ■ Využívá štandartní wide-field mikroskop ■ osvětlení vzorku světlem s pruhovaným vzorem vzniklým difrakcí na mřížce ■ 5-7 snímků přes mřížku pro vytvoření obrazu ■ Efekt vyvolaný osvětlením přes mřížku se používá k identifikaci fluoroforu, které se nachází v rovině zaostření jednotlivých snímků - složení obrazu Single-Molecule Superresolution Imaging ■ STORM - stochastic optical reconstruction microscopy ■ PALM - photoactivated localization microscopy (vynalezl Eric Betzig) ■ FPALM - fluorescence photoactivation localization microscopy ■ využívají wide-field mikroskopii ■ vychází z fluorescence jednotlivých (nepřekrývajících se) molekul fluorochromů (single-molecule imaging) zu Pnifit Sprcjd Function CCD Single-Molecule Localization Procedure Contour Map Velké množství fluorochromů (cílových molekul) a příliš blízko Single-Molecule Superresolution Imaging Target structure Locahz\ng debated subset ol probes STORM image 1. Snímek fluorescence jednotlivých molekul (nepřekrývajících se) fluochromú = snímek obsahuje pouze omezený počet signálů 2. Softwarově určen střed (pozice) daných molekul 3. Další snímek zaznamená jiné nepřekrývající se fluorochromy 4. Softwarově určen střed (pozice) těchto molekul 5. Výsledný obraz je tvořen složením (překryvem) tisíců takových snímků Single-Molecule Superresolution Imaging ■ William Moerner: „photoswitchable" značka - eYFP lze reaktivovat modrým světlem (405 nm) > lze znovu excitovat světlem 488 nm ■ značky (fluorescenční proteiny, fluorochromy) musí umožňovat změnu spektrálních vlastností za pomoci světla o definované délce (Chozinski etaĽ FEBS Lett 2014) ■ fotoaktivace (photoactivation) ■ „fotopřepínání': (photoswitching) ■ fotokonverze (photoconversion) ■ použití laseru s nízkou intenzitou ■ jednotlivé molekuly fluorochromú - nízká pravděpodobnost zásahu a změny stavu (off >on) Photoactivation Photoswitching Photoconversion (reversible) Single-Molecule Superresolution Imaging Systém dvojice fluorochromů: aktivátor + „photoswitchable" reportér $TEP 1 lmiri*,iif i j n in.5ln.ulf i A A A Oy* Im HtivJiien Dy» lor imj^ř i Iprurflfl; ^^^^^ ^^^^^^ O Tarier můtřtute STEPÍ Ali-L.it« li rjrxfanil} Jrlnir*l»dh)f ImdÜTir^Cii wlili lcn*iiininnrj T.nptfPl mnlpruJn iTEP J t (dir AJenaM f with strong ľ n hi jnd t í p1 .ľp rniMim cl luril ijilwi infoiiniiwi T-irrj-.'l i-iľ lutjlu http . m ic rose o pyu. c om .'tijto ^ Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) laterální rozlišení <10 nm, axiální rozlišení <20 nm Mikrotubuly (zelená), klatrinem potažené jamky (červená; clathrin-coated pits) perrazlišovací mikroskopie BÍ3920 Fluorescenční mikroskopie - Konfokální mikroskop 3D-STORM (Huang etal., Science, 2008) ■ modifikace: do objektivu přidána cylindrická čočka - cílená změna PSF ■ lze určit pozici v rovině Z a zobrazit v rámci snímku Cylindrical Lens Imaging Len?, EMCCD Mikrotubuly - pozice v Z rovině odpovídá barvě perrozlišovací mikroskopie BÍ3920 Fluorescenční mikroskopie - Konfokální mikroskop 3D-STORM Aktin - pozice v Z rovině odpovídá barvě perrozlišovací mikroskopie? BÍ3920 Fluorescenční mikroskopie - Konfokální mikroskop Porovnání rozlišení zobrazovacích technik x/y z • Wide-field fluorescenční MS: 230 1000 nm ♦ Konfokální a multiphoton MS : 180 500 Superrezoluční MS: 4Pi 200 90 SIM: 100 250 STED, PALM, STORM: 20 50 Spatial Resolution of Biological Imaging Techniques Bacteria Cell Hair Ant Small Protein Virus Molecule > % * % f 1 nm 10 nm 100 nm 1 j_i_i_i_ j;m 10 ujíi 100 ujn 1 mm TZZT - Fluorescence Microscopy Superre solution Mouse Mouse Brain 1 cm 10 cm MR1 and Ultrasound Optical Coherence TomůCYaphy [ Wldefleid and T1RF Microsc Confocal Mierosco SEI. j p, gnu ILL Hi ah Resolution Structured Illumination Ground State Depletion skládání 3D obrazu ■ výhodná zobrazovací metoda pro 3D zobrazování velkých objektů Speciální metody ve flouoresceříční mikroskopii Light Sheet Fluorescence Microscopy (LSFM) Total internal reflection fluorescence (TIRF) ■ velmi vhodná metoda pro studium dějů na membráně výborné axiální rozlišení ,;evanescent wave" proniká v preparátu pouze do hloubky cca 100nm Low refractive index (specimen) Evanescent wave at the coverglass-sped men interface I typically Jess than 100 nm High refraction index (coverglass) Incident tight Reflected light Range of incident angles greater than the critical angle $ Specimen Coverglass Laser A illumination Speciální metody ve flouorescenční mikroskopii Total internal reflection fluorescence (TIRF) EP1 TIRF F-aktin (zelená) v nádorové bunečné linii Speciální metody ve flouorescenční mikroskopii