ÚLOHA 1: Interfázní FISH na buněčné suspenzi
1. Sklízení buněk
CHEMIKÁLIE
Fixativ - Methylalkohol p.a. a čistou kyselinu octovou ředit v poměru 3:1. Fixativ musí být připraven vždy čerstvý před sklízením buněk! Pro jiné účely lze krátkodobě uchovávat při 4 °C. 75mM KCI - 2,8 g chloridu draselného rozpustit v 500 ml sterilní destilované vody. Uchovávat při 4 °C. Před sklízením předehřát na 37 °C.
SKLÍZENÍ
1) Všechny centrifugace probíhají po dobu 10 minut při 1500 RPM a laboratorní teplotě.
2) Odstranit médium a dvakrát důkladně opláchnout buňky sterilním PBS (37 °C).
3) Převést buňky do suspenze a centrifugovat.
4) Odsát supernatant, pelet důkladně resuspendovat Pasteurovou pipetou a přidat 10 ml 75mM KCI předehřátého na 37 °C. Hypotonizace při 37 °C po dobu cca 30 minut.
5) Přidat 10 kapek fixativu, lehkým obrácením zkumavky promíchat a centrifugovat.
6) Odsát supernatant. Resuspendovat pouze lehkým zatřesením zkumavkou (buňky jsou v této chvíli náchylné k protržení!). Po kapkách přidat 10 ml fixativu. Promíchávat kroužením.
7) Fixace 20 minut při pokojové teplotě. Poté centrifugovat.
8) Odsát supernatant a důkladně resuspendovat Pasteurovou pipetou. Po kapkách přidat 5 ml fixativu.
9) Fixace 10 minut při pokojové teplotě, centrifugovat.
10) Maximálně odsát supernatant. Doplnit fixativem na cca 1 ml (mléčné zakalení suspenze) a uskladnit při teplotě 4 °C.
2. Příprava preparátu
Příprava podložních skel
- Oplach v 70% etanolu, mechanické očištění kartáčkem.
- Oplach v destilované vodě.
- Naložit do skleněné kyvety s 70% etanolem a skladovat při 4 °C.
- Optimální je ponechat skla před použitím takto alespoň přes noc.
Před nakapáním suspenze sklo důkladně utřít do sucha utěrkou na optiku (Micro Optic-Cleaner, Hama).
Příprava krycích skel
- Oplach v 70% etanolu, mechanické očištění, oplach v destilované vodě.
- Utřít do sucha utěrkou na optiku.
Příprava preparátu
Na vychlazené a nadýchnuté podložní sklo kápnout z výšky 1-3 kapky suspenze (dle hustoty suspenze) pod úhlem cca 40 °. Nechat volně schnout - ideálně alespoň do druhého dne.
3. FISH
CHEMIKÁLIE
Ethanolová řada-70%, 80% a 96% ethanol
0,5xSSC (pH 7,2) - zásobní roztok 20xSSC ředit v dH20, upravit na pH 7,2
2xSSC (pH 7) - zásobní roztok 20xSSC ředit v dh^O, přidat Tween-20 do finální koncentrace 0,05%, upravit na pH 7
FISH - optimalizovaný protokol
1) Zestaršení preparátu pomocí 2xSSC (Saline-sodium citráte, solný roztok citrátu sodného) při 37°C po dobu 30 minut. Rychlý oplach v destilované vodě.
2) Dehydratace v etanolové řadě (70 %, 80 % a 96 %) při laboratorní teplotě (RT), 2 minuty pro každou koncentraci.
3) Nechat volně schnout - ideálně do druhého dne. Poté aplikace sondy. Od bodu 4 dále chránit preparát před světlem.
4) Na krycí sklo aplikovat sondu - pozor na vzduchové bubliny (typ sondy a aplikovaný objem bude upřesněn během cvičení). Preparát přiložit ve spodní polovině ke krycímu sklu se sondou a vyčkat až se sonda rozprostře po celé ploše krycího skla. Poté krycí sklo oblepit rámovací hmotou Fixogum.
5) Kodenaturace (sondy a DNA preparátu) na kovové plotýnce při teplotě 75°C po dobu 3 minut.
6) Hybridizace ve vlhké komůrce při 37 °C přes noc.
Lze nahradit cca 4h hybridizací. Lepší výsledky jsou ale dosaženy hybridizací přes noc.
7) Odstranit rámovací hmotu a opatrně sejmout krycí sklo.
8) Odmytí nenavázané sondy - 0,5xSSC při 73°C po dobu 2 minut, opláchnutí v 2xSSC při RT po dobu 30 sekund. Rychlý oplach v destilované vodě.
9) Nechat oschnout ve tmě.
10) Aplikovat 10 u.1 DAPI a hotový preparát uzavřít krycím sklem. Orámovat.
ÚLOHA 2: Fluorescenční detekce cytoskeletálních proteinů
CHEMIKÁLIE
Fixativum - 3% paraformaldehyd v PBS
Permeabilizace - 0,2% triton TX-100 v PBS
Blokovací roztok - 3% BSA (bovinní sérový albumin) v PBS
A. Nepřímá imunocytochemická detekce ct-tubulinu (mikrotubuly, MT)
Značení buněk
1) OplachvPBS-2xlmin
2) Fixace 3% PFA-20 min
3) Permeabilizace 0,2% triton TX-100 - 1 min
4) Oplach v PBS - 1 x rychlý, + 2x3 min
5) Blokování 3% BSA -10 min (na parafilmu)
6) Inkubace s 12 u.1 primárni Ab (anti-a tubulin) - 60 min / 37°C (na parafilmu)
7) Oplach v PBS-3x3 min
8) Inkubace s 12 u.1 sekundárni Ab (anti-myší IgG-Alexa Fluor 488 nebo Alexa Fluor 568) - 45 min / 37°C (na parafilmu) - lze kombinovat s detekcí F-aktinu viz. krok 5 následující úlohy
9) Oplach v PBS-3x3 min
10) Detekce DNA-Hoechst33342-3 min
11) Oplach v PBS - 1 x rychlý, + 1 x 3 min
12) Montovat v montovacím médiu DAKO
B. přímá detekce F-aktinu (mikrofilamenta, MF)
Značení buněk
1) Oplach vPBS-2xlmin
2) Fixace 3% PFA-20 min
3) Permeabilizace 0,2% triton TX-100 - 1 min
4) Oplach v PBS -1 x rychlý, + 2x3 min
5) Inkubace s 12 u.1 phalloidin-FITC/TRITC - 45min / 37°C (na parafilmu)
6) Oplach v PBS-3x3 min
7) Detekce DNA - Hoechst33342 - 3 min
8) Oplach v PBS - 1 x rychlý, + 1 x 3 min
9) Montovat v montovacím médiu DAKO
ÚLOHA 3: Pozorování autofluorescence rostlinného a živočišného původu
MATERIÁL
pylová zrna, listy rostlin, řasy, šupiny z motýlího křídla.
ÚLOHA 4: Fluorescenční odlišení živých a mrtvých buněk
CHEMIKÁLIE
Akridinová oranž (AO) -5 mg/ml Propidium jodid (Pl) - 3mg/ml AO : Pl : voda -1:1: 1000
Značení buněk
D
2)
3)
Oplach v PBS
Kapka barvícího roztoku na podložní sklo Přiklopit krycí sklo s buňkami / inkubace 5 min