ÚVOD DO KVANTITATIVNÍ REAL-TIME PCR Doc. RNDr. Sabina Ševčíková, PhD BMS, UPF LF MU I. Teorie PCR, kvantifikační strategie, instrumentace II. Interkalační barviva a sondy, design primerů, sond III. Aplikace, troubleshooting, design experimentů, MIQE Literatura http://www.gene-quantification.info/ Bustin SA: A-Z of quantitative PCR. IUL Biotechnology Series, Vol. 5, La Jolla, California, 2004-2006 Dorak T: Real Time PCR. BIOS Advanced Methods, Taylor & Francis Group, NY, 2007 Pfaffl MW. Methods (in Enzymology), The ongoing Evolution of qPCR. 50(4), 2010 1952 Elektroforéza 1967 • Rekombinantní DNA • Objev DNA ligázy 1969 FISH 1970 • Restrikční endonukleázy • Reverzní transkriptáza 1972 Klonování 1973 In vitro konstrukce bakteriálního plazmidu 1975 Southern blot 1977 Sekvenování DNA 1980 Koncept RFLP 1981 Western blotting 1982 • Manipulace s genomem Drosophily – P elementy • Whole genome shotgun Molekulární technologie 1984 Pulzní gelová elektroforéza 1985 • PCR • DNA fingertyping 1987 • YACs • Místně cílená mutageneze 1988 Taq Polymeráza ChIP 1990 BLAST 1992 BACs 1995 Microarrays 1998 RNAi 2002 UCSC Genome Browser 2003 DNA assembly programs 2004 Anotace genů – ENSEMBL 2005 • Projekt HapMap • Ligační sekvenování 2006 Celogenomové metylační mapy 2007 miRNA 2009 Next Generation Sequencing What about DNA? • Maurice Wilkins-James Watson-Francis Crick- Rosalind Franklin, 1953 • Dr. Franklin zemřela v roce 1958 • Nobelova cena Wilkins-Watson-Crick,1962 • model dsDNA King’s College London Southern blot, RFLP, … Northern/Western blot, Flowcytometrie, … Kultivace, biochemické analýzy Cytogenetické vyšetření Molekulární technologie 1. zda pacient nese nějakou klinicky významnou bodovou mutaci, která určuje jeho další léčbu? 2. který ze dvou genů je v nějaké tkáni exprimován více než druhý ? 3. druh patogenní bakterie u nemocného? 4. zastoupení leukemických buněk v krvi pacienta před a po léčbě? Jakým způsobem zjistíte: PCR Studies on polynucleotides XCVL. Repair Replication of Short Sythetic DNAs as catalysed by DNA polymerases. Kleppe K., Ohtsuka E., Kleppe R., Molineux I., Khorana H. G. (1971): J.Mol.Biol.56,341-361. Koncept cyklické reparativní replikace 1971 Denaturace Renaturace Replikace DNA polymeráza Replikace Denaturace Extrémně nákladná syntéza oligonukleotidů, nedokonalé sekvenování, termolabilita a nákladná purifikace DNA polymeráz, nedostupná instrumentace... Nová DNA polymeráza Renaturace Kjell Kleppe Har Gobind Khorana Práce popsala některé parametry reparativní replikace – účinnost replikace, minimální délky primerů a templátu, sekundární struktury atd. ... ... Proč se nerozšířila tato metoda už v 70.letech? První možnost diagnostické replikace DNA 1985 Two new methods were used to establish a rapid and highly sensitive prenatal diagnostic test for sickle cell anemia. The first involves the primer-mediated enzymatic amplification of specific beta-globin target sequences in genomic DNA, resulting in the exponential increase (220,000 times) of target DNA copies. In the second technique, the presence of the beta A and beta S alleles is determined by restriction endonuclease digestion of an end-labeled oligonucleotide probe hybridized in solution to the amplified beta-globin sequences. The beta-globin genotype can be determined in less than 1 day on samples containing significantly less than 1 microgram of genomic DNA. . Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. Science. 1985 Dec 20;230(4732):1350-4. Kary B. Mullis Praktická aplikace PCR 1987-8 • Použití termostabilní DNA polymerázy • Rozvedení konceptu navrženého K. Kleppem • Obrovský boom PCR díky technologickému pokroku • 471 865 článků (26.4.2019) Nobelova cena za chemii 1993 Rok 1989 • PCR vyhlášena časopisem Science objevem roku a Taq polymerázu molekulou roku PCR Cyklické střídání fází denaturace, annealingu a extenze jednoduchou změnou teploty reakční směsi Polymeráza využívá syntetické primery ohraničující amplifikovaný úsek DNA Amplifikace DNA Základní komponenty reakce • voda • pufr • dNTP (dATP+dTTP+dCTP+dGTP) • Mg ionty • Polymeráza • primery • templát PCR Templát- co jde do reakce Amplikon- co se amplifikuje Amplifikace (y) = N  2n N= počet molekul templátu, n počet cyklů PCR Otázka: Jedna molekula DNA je amplifikována v 25 cyklech. Teoreticky, kolik molekul amplikonu (y) je vytvořeno? 1.Počáteční množství molekul templátu je N=600. Kolik molekul amplikonu je vytvořeno? 2.Reakce je provedena v 100l. Kolik molekul amplikonu bude přítomno v 1 nl (0,001 l)? 1. 225= 33 554 432 2. 600  225= 2  1010 3. 2  1010 ve 100 l  v 0,001 l bude 2  105 (200 000) molekul amplikonu Odpověď: KONTAMINACE JE PROBLÉM Jediná molekula DNA může způsobit velké problémy (forenzní genetika, rutinní screening a diagnostika, GMO…) Kvantifikace pomocí PCR Konvenční kvantitativní PCR -„End point“ stanovení • Kvalitativní odpověď YES/NO • Extenzivní validace, kontroly • Denzitometrie • Minimální rozptyl v parametrech reakce má obrovský vliv na množství amplikonu • Interní heterologní kontrola (housekeeping gene) •Viral load u HIV+ pacientů • Výskyt minimální reziduální choroby u onkologických pacientů Kvantifikace pomocí PCR „End point“ Kvantifikace pomocí PCR „End point“ Zásadní omezení – gelová elektroforéza • Nízká přesnost • Nízká citlivost • Malý dynamický rozsah – pouze 2 log • Nízké rozlišení, pouze na délce amplikonu • Není automatizovaná • Výstup není numerický – subjektivní hodnocení • EtBr – neváže se na DNA pravidelně • Post PCR zpracování - kontaminace Real-time PCR • Metoda detekce amplifikace v reálném čase • Nečekáme do konce reakce • Detekce změn fluorescence Kvantitativní real time PCR PCR vs qPCR qPCR • Přibližně 100krát víc citlivá než PCR • Dynamický rozsah 9 logs qPCR Advantages • Specific • Simple, rapid, relatively inexpensive • Amplifies from low quantities • Works on damaged DNA • Sensitive • Flexible qPCR Limitations • Contamination risk • Primer complexities • Primer-binding site complexities • Amplifies rare species • Detection methods qPCR reakce • Voda • Master mix (Mg, dNTP, polymeráza) • Primery • Fluorescenčně značená sonda • Velikost amplikonu – 70-100 nt Kvantitativní vztah mezi množstvím PCR produktu (amplikonu) a intenzitou fluorescence • Amplifikační práh detekce (Ct) Real – time detekce amplifikace Plateau fáze Exponenciální amplifikace pod úrovní pozadí Exponenciální fáze „end point“ „real-time“ Real-time Fluorescence Based PCR Real – time detekce amplifikace Fluorescence R je zajištěna např. vazbou fluorescenčního interkalačního barviva na DNA, použitím hydrolyzační sondy atd. Fluorescence reportérového fluoroforu je normalizována vůči pasivnímu fluoroforu (Rox) Rn. Změnu fluorescence v čase vůči pozadí udává Rn. (Rn=Rn+-Rn-). Reportérový fluorofor Real – time detekce amplifikace Pasivní fluorofor Intenzita fluorescence závisí na amplifikaci templátu během PCR Intenzita fluorescence je během PCR konstantní. Zahrnutí fluorescence pasivního fluoroforu do výpočtu technicky zpřesňuje analýzu Threshold cycle „Ct“ – určený na základě hodnoty fluorescence pozadí (backround) a aktuální fluorescence vzorku – kvantitativní výstup pro každý vzorek Real – time detekce amplifikace - Ct Threshold Threshold cyclesBackground Fluorescence Threshold cycle „Ct“ - počáteční množství kopií templátu - definovaný v exponenciální fázi PCR - stejná účinnost PCR ve všech reakcích - účinnost štěpení fluorogenní sondy nebo vazby fluoroforu na DNA - citlivost detekce - čím menší Ct - tím větší počet kopií templátu na začátku reakce Real – time detekce amplifikace - Ct A CB A CB> > - rozdíl 1 Ct – dvojnásobné množství templátu 21 = 2 - kolika cyklům odpovídá odpovídá 10ti násobný rozdíl v množství templátu? (předpokládáme 100% účinnost PCR) 2n = 10 Threshold cycle „Ct“ Real – time detekce amplifikace - Ct 50 100 150 250 300 0 c [ng/l] Ct 50 28,16 100 27,16 150 26,66 250 26,06 300 25,66 n=3,32 Izolace NK Izolace DNA a RNA • Zisk DNA nebo RNA v dostatečném množství a čistotě • Kvalita rozhoduje o úspěchu dalších metod • Vliv metody na další použití Přístupy k izolaci DNA buňka DNA RNA proteiny Lýza biomembrán Nukleové kyseliny zůstávají v roztoku, bílkoviny se sráží a sedimentují odstředěním na rozhraní, lipidy jsou extrahovány do chloroformu vodný roztok (DNA, RNA) chloroform (lipidy) Rozhraní (bílkoviny) RNA je příp. odstraněna RNázou A. Odstraňujeme lipidy extrakcí chloroformem, bílkoviny srážením fenolem B. Za určitých podmínek absorbujeme DNA na povrch SiO2, ostatní odsajeme SiO2 je obvykle v podobě skleněných částic, které jsou těžké, snadno sedimentují, ostatní lze odsát. Změnou podmínek dojde opět k uvolnění DNA do čistého roztoku Kolonky Qiagen buněčný lyzát centrifugace promytí a uvolnění Izolační kolonky Izolace RNA 28S 18S Kvantifikace NK - nanodrop • Kvantifikace DNA, RNA, proteinů • Bezkyvetový spektrofotometr • Měří 0,5-2ul vzorku • Od 5ng/ul do 3000 ng/ul • 260/280nm • 260/230 nm Templát – Izolace RNA - Volba zdroje (charakter tkáně, biopsie, mikrodisekce…) - Integrita (RNA Integrity Number – RIN) výpočet na základě 28S a 18S rRNA - Čistota (A260/280; A260/230), přítomnost PCR inhibitorů - Přesné určení koncentrace RNA - Celková RNA nebo mRNA? - Vhodnost metody, automatizace, výtěžek… RIN Integrita RNA Založena na poměru dvou ribozomálních RNA – 18S a 28S Tyto RNA přibližně 85% celkové RNA Čistota • 260/280 nm – 1,8 čistá DNA, 2,0 čistá RNA (nižší – proteiny, fenol) • 260/230 nm – 2-2,2 (EDTA, fenol) • Záleží na koncentraci – pokud moc nízká, čistota nebude dobrá Manipulace • RNA velice nestabilní, pracovat na ledu, okamžitě zamrazit • Stabilita v -80C cca 1 rok – lepší skladovat cDNA • DNA poměrně stabilní • Co udělá UV s NK? Faktory ovlivňující qPCR Koncentrace MgII+ (MnII+) - Kritický faktor pro DNA polymerázy - Např. Tth (Thermus thermophilus HB-8) MnII+ (3-6mM) Taq (Thermus aquaticus) MgII+ (3-4mM) - Některé polymerázy preferují určitou formu MgII+, MgCl2,MgSO4 Faktory ovlivňující qPCR Koncentrace primerů -obvykle 100-900nM - ne vždy poskytuje ekvimolární koncentrace nejlepší výsledek Koncentrace sondy - obvykle 100-400nM - volba sondy podle typu analýzy a žádaného výstupu (genová exprese, SNP, absolutní kvantifikace…) Faktory ovlivňující qPCR DNA polymerázy - Fidelity, maximální amplifikovatelná délka amplikonu - bakteriální Taq Thermus aquaticus - nízká fidelity - absence 3' > 5' exonukleázové aktivity (proofreading) - Archeální enzymy - Thermococcus sp. (T. gorgonarius, litolaris, kodakaraensis) • Tgo, Vent, Pfx - Pyrococcus sp. (P. furiosus) • Pfu http://www.biologie.uni-regensburg.de/Mikrobio/Thomm/Buttons/bilder/thermococcus-ch-Pt.jpg – Vyžadují 3’OH primer – Teplotní stabilita - nejvyšší katalytická účinnost mezi 70-80°C – Výrazná ztráta aktivity při nižších teplotách • např. Taq při 37°C má pouze 10% své normální aktivity Jméno 3’>5’ Exoaktivita Zdroj Poznámka Taq - Thermus aquaticus Poločas rozpadu v 95°C - 1,6 hod. Pfu + Pyrococcus furiosus Nejmenší error-rate Vent (Tli) + Thermococcus litoralis Poločas rozpadu v 95°C - 7 hod. Faktory ovlivňující qPCR DNA polymerázy a PCR – Zajištění 3' > 5' exonukleázové aktivity zvyšuje specifitu reakce – Některé aplikace (TaqMan) vyžadují 5' > 3' exonukleázovou aktivitu polymerázy (odbourání sondy, in vivo RNA primerů při syntéze Okazakiho fragmentů), jiné aplikace (molekulární majáky, scorpions) naopak vyžadují polymerázy bez nukleázové aktivity Genová exprese, RT-PCR RT PCR Reverse Transcription PCR - dvě na sebe navazující enzymatické reakce PCRReverzní transkripce http://8e.devbio.com/printer.php?ch=1&id=32 http://www.obgynacademy.com/basicsciences/fetology/genetics/images/pcr.png - mnohonásobně citlivější než např. northern/dot blot, RNAse /S1 protection assays, nebo ISH - exprese mRNA, detekce a kvantifikace virů atd. Kvantitativní RT PCR RNA Reverzní transkripce cDNA PCR RNA Reverzní transkripce cDNA & PCR „one step“ RT-PCR„two step“ RT-PCR One step or two step PCR? One or two step PCR One tube/two enzymes Two tubes/two enzymes Feature Advantages Disadvantages Feature Advantages Disadvantages Reduced handson time Fewer errors More rapid Higher throughput Dedicated enzymes Separate optimisation enhanced sensitivity More pipetting errors Less pipetting Fewer errors Multiple priming options Separate cDNA pool Multiple targets Reagents added at start Less contamination No separate optimization cDNA synthesis Safer long term storage Higher temperature Higher specifity Target specific priming only Reverzní transkripce Reverse transcription - templát polyribonukleotidy i polydeoxyribonukleotidy - syntéza DNA na základě RNA templátu - tzv. RDDP nebo DDDP aktivita (RNA/DNA directed DNA polymerase) - replikace retrovirů (HIV) Průběh RT 1. RDDP syntéza DNA řetězce podle RNA templátu 2. odbourání RNA, RNAse H 3. DDDP syntéza druhého DNA řetězce RT Primery - endogenní náhodný priming – nežádoucí variabilita v PCR - náhodné primery (hexamery, oktamery, dekamery) - převažující frakce cDNA – rRNA, problematická determinace low copy targets - nadhodnocuje množství mRNA vůči specifickým primerům - oligo dT - poly A mRNA - histony nebo virové geny postrádají poly A - nutná RNA o vysoké kvalitě (nefragmentovaná) - specifické primery - nejvhodnější pro kvantifikaci - separátní reakce pro jednotlivé stanovované sekvence TTTTTTTTTTTTTTTTTTT NNNNNNNNNAAAAAAAAAAAAAAAAAA Primery pro RT https://www.thermofisher.com/cz/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology- resource-library/basic-principles-rt-qpcr.html RT Reverzní transkriptázy • vysoké procento chyb (nemají proofreading) • citlivost k sekundárním strukturám - způsobí terminaci polymerace nebo vynechání úseku sekundární struktury • vysoká procesivita v případě malých amplikonů - krátké molekuly cDNA • optimální reakční teplota 50-55°C • dvojmocné ionty, MnII+, MgII+ Aditiva • optimalizace účinnosti RT • mechanismus nejasný, pravděpodobně ovlivňují termostabilitu enzymu nebo tvorbu sekundárních struktur templátu • různé výsledky s různými enzymy a reakčními podmínkami RT Trehalóza 0,6M/15% glycerol - brání tepelné inaktivaci enzymu Zvyšuje enzymatickou aktivitu MMLV-RT při 60°C Úspěšná syntéza řetězců o délce 10kb Zvýšení specifity odT primerů (Superscript II) Betain (trimethylglycerin) Osmoprotektant Stabilizace AT párů Snížení termostability GC párů – snížení Tm Kombinace 2M betainu a 0,6M trehalózy Závislost na templázu a amplikonu Optimalizace RNáza H degradace duplexu cDNA/RNA Kompetuje se syntetickou aktivitou RT (Degradace duplexu DNA primer/RNA proběhne s větší pravděpodobností než extenze řetězce) = snížený výtěžek cDNA Ale: – neodbouraná RNA může omezovat hybridizaci primerů a snižuje citlivost PCR – PCR primery mohou být zbytkovou RNA vyvázány RNáza H http://www.ambion.com/techlib/tn/101/1.html AMV RT AMV RT (Avian myeloblastosis virus) • Syntéza DNA z DNA nebo RNA templátu • DNA primery, oktamery a delší jsou efektivnější než hexamery • Nekompetetivně inhibovaná tRNA • Optimální reakční teplota 42°C • Modulární enzym • Thermoscript (Invitrogen) – vyšší teplotní stabilita (65°C), redukovaná aktivita RNázy H (tvorba cDNA knihoven) • Četnost chyb 4,9  10-4 Perbal B., Retrovirology 2008, 5:49 MMLV RT (Moloney murine leukemia virus) • Nižší aktivita RNázy H než v případě AMV-RT • Termolabilní, optimum 37°C • DNA i RNA primery, DNA primery 9-15bp vhodnější • Modulární enzym • Modifikované MMLV RT (redukce aktivity Rnázy H, termostabilita) – Superscript II (Invitrogen), Powerscript (Clontech) • MgII+ - syntéza dlouhých cDNA MMLV RT DNA pol RT DNA polymerázy s RT aktivitou Tth (Thermus thermophilus), Tfl (T. flavus), BcaBEST (Bacillus caldotenax) -Takara RDDP i DDDP aktivita Vyšší termostabilita než RT Vysoká četnost chyb (nemají 3’ - 5’ exonukleázovou aktivitu) C. therm polymerase (Roche) Klenowův fragment z Carboxydothermus hydrogenoformus Vysoká teplotní stabilita a přesnost syntézy (četnost chyb poloviční ve srovnání s Tth) Kontaminace PCR Cross contamination Carry-over contamination PCR 1 PCR 2 PCR 2PCR 1 Vzorek 1 Vzorek 2 Přenos amplikonu do dalších PCR Vzájemná kontaminace vzorků Jak předejít kontaminaci Kontaminace • Správná laboratorní praxe • Plastik v RNA kvalitě • Automatizace  www.millipore.com; www.appliedbiosystems.com Application note: Contamination-pipetting: relative efficiency of filter tips compared to Microman® positive displacement pipette. Nature Methods 3 June 2006 HotStart Taq Hot Start • Modifikace polymerázy (Chemická modifikace, MoAb) • Upravená, teplotně senzitivní polymeráza www.qiagen.com HotStart dNTPs Hot Start • Modifikace termolabilní tetrahydrofuranovou (THF) skupinou (cyklický ether) • Brání extenzi a dimerizaci primerů • Zvýšením teploty dojde k uvolnění THF a vzniku standardních dNTPs • Fyzické oddělení jednotlivých reakčních složek • Vyvázání nebo chemická modifikace primerů Alternativní HotStart přístupy Hot Start Uracil-DNA-glykosidáza (UNG) UNG • odstraňuje uracil z DNA • zahajuje bazovou excizní reparaci – dochází k odštěpení poškozené báze (deaminovaný cytosin) a vzniku AP místa (apurinové, apyrimidinové místo) • Pokud reakční PCR master mix obsahuje dUTP místo dTTP, výsledný amplikon bude obsahovat „U“ místo „T“ • UNG rozpozná místa v DNA,která obsahují „U“ a štěpí je za vzniku AP místa • DNA obsahující AP místa je termolabilní • Lze tak zabránit „carry over“ kontaminaci – PCR produkt nemůže být reamplifikovaný • Na začátku qPCR reakce – odstranění produktů předchozích reakcí Uracil-DNA-glykosidáza (UNG) UNG Uracil-DNA-glykosidáza (UNG) UNG • Použitím UNG a vhodné směsi dNTP, lze zabránit „carry over“ kontaminacím v laboratoři – PCR produkt nemůže být reamplifikovaný • Vlastnosti DNA obsahující „U“ místo „T“: - dU mají stejnou schopnost hybridizace jako dT - lze ji použít i pro dideoxy-NTP sekvenování - PCR fragment lze přímo klonovat do UNG- kmenů www.appliedbiosystems.com; www.invitrogen.com