ÚVOD DO KVANTITATIVNÍ REAL-TIME PCR i V. Návrh primerů a sond Design primerů a sond Hybridizace • Úspěšný annealing sondy a primerů je kritický předpoklad úspěšné PCR - Sekvence - Koncentrace solí - Tvorba heterodimerických stabilních struktur - Párování bazí - nejen Watson a Crick - Sekundární struktura - Teplota tání DNA Tm Design primerů a sond Melting temperature Tm I • jeden z nejdůležitějších parametrů, determinující annealingovou teplotu • Tm - teplota, při které je 50% daného oligonukleotidu denaturováno • „cooperativní melting" - usnadněná denaturace po disociaci prvního páru bazí • Sekvence: A=T < G=C • Rychlost renaturace (a tedy i Tm) přímo úměrná délce řetězce a jeho koncentraci a nepřímo úměrná komplexitě molekuly (struktura) • Elektrostatické interakce mezi fosfátovýnmi molekulami • kationty maskují + náboje fosfátů - vyšší iontová síla vede k vyšší Tm Oligonukleotidy kratší než 20bp 100 Tm = 2 x (A+T) + 4x (G+C) % ss Iontová síla, %GC a délka řetězce (N) 50 Tm=81,5+16,6 (logl0[Na+]+0,41 (%GC)-(625/N) Web-based kalkulátory http://inSiliCO.ehU.eS/tm.php Tm Temperature Design primerů a sond Melting temperature Tm 100 * 80 £ 60 CO o o ♦ 40 a> c 'c 05 O 20 Trn lower in lower salt concentration Trn higher in higher salt cones n trati on 60 70 80 90 7m. °C 100 110 GCTATTCAACTGAAGAGGGCACAGC CGATAAGTTGACTTCTCCCGTGTCG Tm - 25° >T m GCTATTCAACTG AGAGGGCACAGC CGATAAGTTGACTTCTCCCGTGTCG m 25° >T m GCTATTCAACTGAAGAGGGCACAGC CGATAAGTTGACTTCTCCCGTGTCG GCTATTCAACTG AGAGGGCACAGC CGATAAGTTGACTTCTCCCGTGTCG T note: T * is 4° lower than T in m (In general, there is a 1° drop for every 1% mismatch) Design primem a sond Gibbsova (volná) energie a její změna (AG, AG0) •Schopnost látek jít do reakce •Sekundární struktura DNA • AG závisí na změně vnitřní energie a entropie • Změna volné energie AG° (množství energie uvolněné nebo absorbované během reakce za stejné teploty a tlaku) - spontánní reakce - AG<0 • Znalost termodynamického příspěvku párování bazí, mismatches, volných konců, vlásenkových struktura smyček - predikce parametrů hybridizace • Predice sekundární struktury - nearest neighbor - helix initiation factor (GC/AT) - helix propagation energie nutná pro vytvoření následujícího hybridizačního páru - symetrie sekvence (duplexu) - Loop regions - smyčky, vlásenky, výdutě atd. Faktory ovlivňující stabilitu DNA DNA/RNA duplexu 1. Počet odpovídajících párů bazí - Kombinace vodíkových můstků a hydrofobních interakcí - Pozice a typ neodpovídajícího páru (mismatch) 2. Sekvence - nearest neighbor 3. Sekundární struktura - Charakter cílové sekvence - Kompetice primem nebo sondy s komplementárním řetězcem cílového duplexu 4. Volné konce - Interakce mez 5' a 3' konci hybridizovaného oligonukleotidu a nejbližší sousedící báze Faktory ovlivňující stabilitu DNA DNA/RNA duplexu 5. Iontová síla - Koncentrace iontů, zejména Mgll+ - Kationty kompenzují negativní náboj fosfátových skupin a usnadňují formování duplexu - Stabilita duplexu (Tm) je úměrná koncentraci iontů 6. Teplota - Se stoupající T je udržení duplexu energicky náročnější, po překročení určité T je preferována ssDNA- vyšší entropie celého systému Není tedy nutná shodná Tm, ale shodná účinnost hvbridizace obou primem. Primery se stejnou Tm, ale rozdílnou AG°, mohou vykazovat rozdílnou úspěšnost při tvorbě duplexu než primery s odpovídající AG°. Design primerů • Optimálně: primery jejichž 5'konce tvoří stabilní duplex, AG° <10 kcal/mol/37°C • Plynulý přechod AG° směrem k 3'konci až k cca -6kcal/mol. • Eliminace misprimingu (vzniklého hybridizací pouze 3'konce) • Vyloučení repetitivních oblastí, které mohou tvořit sekundární struktury • Komplementarita primerů - primer dimery • Specifita - hybridizace k jedinečnému místu v genomu (BLASTn) Vliv reakčního prostředí - i ideálně navržené primery mohou měnit své vlastnosti v závislosti na použitém PCR pufru a dalších parametrech PCR -vždy je nutná optimalizace jednotlivých PCR Design sond • Různý design podle toho, zda je cílem kvantifikace DNA, mRNA nebo provedení alelické diskriminace nebo SNP • Použitá chemie • Detekce DNA, RNA nebo obou zároveň? Rozlišení HIV RNA od DNA začleněné do genomu • Kombinace fluoroforu a zhášeče • Modifikace sondy - LNA, PNA, MGB atd. • Multiplex assay Design hydrolyzačních sond • qPCR TaqMan - dvoukrokový proces - denaturace a annealing/extension • Co nejnižší Ct a nejvyšší AR (ARn) • Umístění 5' konce sondy v rámci stanovované sekvence co nejblíže 3' konci jednoho z primem - účinné štěpení sondy • Optimální délka do 30 nukleotidů, obsah GC do 30% • AT bohaté sekvence - začlenění LNA, PNA nebo MGP • G - účinný quencher • Minimum repeticí, zejména GGGG, začlenění inosinu do repetice řeší tento problém Tm proby od 10°C vyšší než Tm primem Design hybridizačních sond (Lightcycler probes) Sondy by měly být umístěny co nejdál od primem 5' - odečet fluorescence v annealingové fázi GC 50% Každá sonda má délku 23-35bp Sondy o stejné Tm - musí se vázat současně ; Tm sond o 5-10°C vyšší než Tm primem 3' konec akceptorové sondy fosforylován Donor FAM, akceptor Cy5 nebo Lightcycler Red 640/705 Vzdálenost mezi sondami 1-5 bazí (zajištění FRET) Template DNA "li mann Excitation for donor FRET Emission by acceptor Detection mining jimmimi TN Temperature Design molekulárních majáků Vazba majáku ideálně uprostřed amplikonu Tm komplementárních ramen o 7-10°C vyšší než Tm primem Délka do 39 bp - omezení sekundárních struktur Design scorpion primers PCR Product-Specific Nucleotides Fluorescent Reporter Dye \l Quencher Dye Sonda připojena k 5' konci primem a je komplementární k nově syntetizovanému řetězci • vlastní hybridizace sondy je intramolekulární událost • 17-27bp; Tm sondy [fcnlm'i Primer Bank PCR Primers for Gene Expression Detection and Quantification n Policy Help/FAQ Primer Search Search for PCR Primers Search where |~GenBank Accession [-] Species [an Species 0 Order Oligos e primers synthesized and PCR r< products sequ5n:-;d s DNA Core Facility • RTPrimerDB http://medqen.uqent.be/rtprimerdb/ • Real Time PCR Primer Set http://www.realtimeprimers.org/ • QPPD http://web.ncifcrf.gov/rtp/qel/primerdb/default.asp f'j:!s-:^:í ;íjusr. • P«mn t SPÍ-UlMíi f L* P«tPt* i.itui«»i)u:i *| . ATCI*.OCCC*TCAT I ltd Oft 30C Mat tow ■■■■ PlHWq I-fl:r':- Gfwril Prlnr Pk/kii; CmHlHinnt IWriiirr Mh IB Of* 3U Mal V l^ihf..... M" Cf* M« FtaffSife Hi 0m Mtt mo Kk»Ofi * HiiTil TT ! FtiiEra Lato ' i-r.rw,, i PlOnnn CmíiF,— E% PREMIER Biosoft International PRODUCTS SERVICES DOWNLOAD ORDERING Software to Accelerate Research in Life Sciences AllelelD® ■ Real Time PCR & Micro arrays Array Designer ■ Micrcarrays 111] Beacon Designer1'" ■ Real Time PCR Oligo Design PrimerPlex ■ Oligo Design for xMAPffi Based Multiplex Systems Primer Premier ■ PCR Primer Design ■ MS/MS Data Analysis ■ Draw Plasmid Macs St Plan Cloning Experiments ■ Tissue Micrcarray Data Analysis SimGlycan™ SimVector TMA Foresight Xpression Primer ■ Tagged Primer Design Design primerů a sond Návrh primerů a TaqMan sond - Primer Express 61 121 181 241 301 3 61 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 / flft XĽel = rrUĽti:jTS:47741^rr 1090. .5-1143 /gene="FQS" / gene_synonyin- " AP-1" /gene_synonym="C-FOS" /3tandard_naiňe=rrBP2 50015A10G9rr /db xref = rrUniSTS:5jL921Brr atgatgttct tccccggccg ggctcgcctg attcccacgg ctcgtctcct ccctccgctg cagagcattg agaatccgaa ct.gact.gata accgagattg cgacctgcct cttgatctga ctgcctctcc agcatggagc agtggctctg gcagactggg gagcccctgt ttcgtcttca ggcagcagca tga cgggcttcaa gggatagcct tcaacgcgca tcactgccat ctgtggcccc gggcttactc gcaggagggg gggaaaggaa cactccaagc ccaacctgct gcaagatccc ctgggggcct tcaatgaccc tgaagaccga agacagcccg agcctctgca gcactccggt cctaccccga gcaatgagcc cgcagactac ctcttactac ggacttctgc ctcgaccagt atcgcagacc cagggctggc caaggtggaa taagatggct ggagacagac gaaggagaag tgatgacctg gccagaggtt tgagcccaag gccctttgat ctccgtgcca cagtggctcc ggtcacctgt ggctgactcc ttcctctgac gaggcgtcat cactcacccg acggacctgg ccggacctgc agagcccctc gttgtgaaga cagttatctc gcagccaaat caactagaag gaaaaactag ggcttcccag gccaccccgg ccctcagtgg gacttcctgt gacatggacc ctggggatgg actcccagct ttccccagct tcgctcagct cctcccgctg cagactcctt ccgtctccag agtggctggt accctttcgg ccatgacagg cagaagaaga gccgcaaccg atgagaagtc agttcatcct aagagatgtc agtctgagga aacctgtcaa tcccagcatc tatctgggtc ggcccatggc gcactgctta gtgcagctgc cacccacgct cagcagcgcg ctccagcatg tgccaacttc gcagcccgcc agtccccgcc aggccgagcg agagaaaagg gaggagggag tgctttgcag ggcagctcac tgtggcttcc ggccttcacc gagcatcagc atccaggccc cttctatgca cacagagctg cacgtcttcc ccaccgcaag gctggccctg Disclaimer | Write to the Help Desk NCBI | NLM | NIH flPjrr—' nO Bi<»y$ terns Primer Express® Software for Real-Time PCR Version 3.0 OCopyright 2004 Applied Biosystems. All nghls reserved Elli Primer Express 3.0 File E dit View T cols Window Help i ► a si -► ^- !ii jj & ^ ^w» iÍTäqMari® MGB Quantificotiori # 1 [T](H|f><] Sequence: Parameters Primers I Probes Order 0) File Nome | g 1144 □ Double Stranded ...............T....... kTGATGTTCT CAGCAGCGCG CAGACTCCTT ľlCGGACCTGG ctcgaccagt ctgtggcccc ccctccgctg aggccgagcg cagaagaaga gcagccaaat ggagacagac ccaacctgct cgacctgcct tgtggcttcc agtctgagga ccctcagtgg gccctttgat Lgacagcccg gcagactggg CGGGCTTCAA TCCCCGGCCG CTCCAGCATG CCGTCTCCAG CCGGACCTGC ATC GC AC-AC C GGGCTTACTC CAGAGCATTG AGAGAAAAGG GCCGCAACCG CAACTAC-AAG GAAGGAGAAG GCAAGATCCC CTTGATCTGA GGCCTTCACC AACCTGTCAA GACTTCCTGT CTCCGTGCCA AGCCTCTGCA CGCAGACTAC GGGATAGCCT GGCTCGCCTG TGCCAACTTC AGTGGCTGGT AGAGCCCCTC CAGGGCTGGC GCAGGAGGGG AGAATCCGAA GAGGAGGGAG ATGAGAAGTC GAAAAACTAG TGATGAC CTG CTGGGGGCCT CTGCCTCTCC GAGCATCAGC TCCCAGCATC GACATGGACC CAGTGGCTCC GAGGCGTCAT CTCTTACTAC TCAACGCGCA ATTCCCACGG GCAGCCCGCC ACCCTTTCGG GTTGTGAAGA CAAGGTGGAA GGGAAAGGAA CTGACTGATA TGCTTTGCAG AGTTCATCCT GGCTTCCCAG GCCAGAGGTT TCAATGACCC AGCATGGAGC ATCCAGGCCC TATCTGGGTC CTGGGGATGG CCTCCCGCTG CACTCACCCG GGACTTCTGC TCACTGCCAT CTCGTCTCCT AGTCCCCGCC CCATGACAGG CAGTTATCTC TAAGATGGCT CACTCCAAGC ACCGAGATTG GGCAGCTCAC AAGAGATGTC GCCACCCCGG TGAGCCCAAG TGAAGACCGA AGTGGCTCTG CTTCTATGCA GGCCCATGGC 11' ii 150 200 250 300 350 400 450 500 550 650 700 750 '.' 900 950 Design primerů a sond JTaqMand) MGB Quantification # 1 | Sequence |i Parameters :| Primers I Probes | Order ( Parameter Value Min Primer Tm 58 Max Primer Tm eo Max Difference in Tm of Two Primers 2 g Primer GC Content Min Primer %GC Content 30 Max Primer %GC Content 80 Max Primer 3' GC's 2 Primer 3' End Length 5 Primer 3' GC Clamp Residues 0 Min Primer Length 9 Max Primer Length 40 Optimal Primer Length 20 0 Primer Composition Max Primer G Repeats 3 Max Nurn Armbig Residues in Primer 0 g Primer Secondary Structure Max Primer Consec Base Pair 4 Max Primer Total Ease Pair 8 0 Primer Site Uniqueness Max % Match in Primer 75 Max Consec Match in Primer 9 Max 3' Consec Match in Primer 7 □ Probe Tm Min Probe Tm 68 Max Probe Tm 70 0 Probe GC Content Min Probe ZGC Content 30 Max Probe ZGC Content 80 g Probe Length Min Probe Length 13 Max Probe Length 25 □ Probe Composition Max Probe G Repeats 3 Max Num Ambig Residues in Probe 0 No G at 5' End in Probe 0 Select Probe with more C's than G's □ □ Probe Secondary Structure Max Probe Consec Ease Pair 4 Max Probe Total Base Pair 8 □ Amplicon Min Amplified Region Tm 0 Max Amplified Region Tm 85 Min Amplified Region Length 50 Max Amplified Region Length 150 [J3 General Max Primers / Probes 50 Design primerů a sond jTaqMan® MGB Quantification U 1 f SequenceJ Parameters] Primers I Probes | Order] Q r Candidate Primers & Probes [tt ][FwdStart )[FwdStop ][TwdLen... jfFwdTm ] [ Fwd ZGC ~] [ Fwd Seq ][RevStart ][RevStop ] [Řev Len... jfRevTm ] [ Rev %GC ~] [ Rev Seq ][Probs CGTCTCCA... 217 GGTCCGGA... 133 2 161 180 20 59 60 CCGTCTCC... 217 199 19 58 63 GGTCCGGA... 182 3 161 180 20 59 60 CCGTCTCC... 217 199 19 58 63 GGTCCGGA... 183 4 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 809 790 20 59 55 TCAAAGGG... 765 5 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 809 790 20 59 55 TCAAAGGG... 765 6 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... S09 790 20 59 55 TCAAAGGG... 765 7 800 822 23 60 48 AGCCCTTT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 827 8 800 822 23 60 48 AGCCCTTT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 828 9 800 822 23 60 48 AGCCCTTT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 829 10 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 810 791 20 58 50 ATCAAAGG... 765 11 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 810 791 20 58 50 ATCAAAGG... 765 12 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... S10 791 20 58 50 ATCAAAGG... 765 13 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 810 790 21 59 52 ATCAAAGG... 765 14 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 810 790 21 59 52 ATCAAAGG... 765 15 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 810 790 21 59 52 ATCAAAGG... 765 1G 799 821 23 60 48 GAGCCCTT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 827 17 799 821 23 60 48 GAGCCCTT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 828 18 799 S21 23 60 48 GAGCCCTT... S64 S47 18 59 67 GGAGCGGG... 829 19 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 811 792 20 58 55 CATCAAAG... 765 20 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 811 792 20 58 55 CATCAAAG... 765 21 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 811 792 20 58 55 CATCAAAG... 765 22 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 820 23 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 820 24 79S S18 21 59 52 CGAGCCCT... S64 S47 18 59 67 GGAGCGGG... 821 25 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 821 26 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 822 27 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 827 28 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 828 29 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 829 30 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... S12 793 20 58 50 TCATCAAA... 765 31 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 812 793 20 58 50 TCATCAAA... 765 < Nil l > [TjClick to show Locations [F]Click to show Secondary Structures Design primerů a sond Name Value 0 Forward Primers Total primers tested: 35792 GC test passed: 35149 Ambiguity test passed: 963 Clamp test passed: 963 Tm test passed: 963 Avoid Excluded regions test passed: 963 Repeat test passed: 900 Self compare test passed: 741 Limit GC test passed: 214 Sequence compare passed: 84 Reverse sequence compare passed: S3 □ Reverse Primers Total primers tested: 35296 GC test passed: 34657 Ambiguity test passed: 946 Clamp test passed: 946 Tm test passed: 946 Avoid Excluded regions test passed: 946 Repeat test passed: 861 Self compare test passed: 703 Limit GC test passed: 205 Sequence compare passed: 95 Reverse sequence compare passed: 95 □ Primer Pairs Total pairs tested: 7885 Amplicon Length test passed: 691 Avoid Excluded regions test passed: 691 Tm Difference test passed: 691 Amplicon Tm test passed: ■-■ t_LJ_1=1_1_ 630 0 TaqMan Probes Total probes tested: 14450 GC test passed: 14128 Ambiguity test passed: 1178 Tm test passed: 1178 Avoid Excluded regions test passed: 1178 Repeat test passed: 1126 Self compare test passed: 1076 Sequence compare passed: 475 Reverse sequence compare passed: 458 Probe start test passed: 351 Design primerů a sond a b F > k M N v w x 1 Fwd Start Fwd Stop Fwd LenEth Fwd Tm Fwd%GC Fwd Seq Rev Start Rev Stop Rev LenEth RevTm Rev%GC RevSeq ProbE Start ProbE Stop Prcbe LenEth Probe Tm ProbE %GC ProbE SEq AmpTm Amp%GC Am p Ta Amp Len Penalty 2 1 ie: 181 2C 58 55 CGTCTCCA^TGCCAACTTCA 217 199 13 58 63 G GTCCG GACTG GTCGAGAT 133 197 15 69 67 TCCCACG GTCACTG C 84 61 £2 56 31 3 2 iei 180 2C 59 &: CCGTCTCCA^TGCCAAÍTTC 217 199 13 58 63 G GTCCG GACTG GTCGAGAT 132 197 16 69 63 TTCCCACGGTCACTG C 85 61 £2 57 36 4 3 lei 180 2-: 59 &: CCGTCTCCA^TGCCAAÍTTC 217 199 13 58 63 G GTCCG GACTG GTCGAGAT 133 197 15 69 67 TCCCACGGTCACTG C 85 61 £2 57 36 5 - 745 ?£2 18 58 ei CCCAAGCCCTCAGTG GAA 309 790 20 53 55 TCAAAG G G CTCG GTCTTCAG 765 730 16 68 50 TGTCAAGAG CATCAGC 33 57 61 65 77 e 5 745 ?£2 18 58 ei CCCAAGCCCTCAGTG GAA 309 790 20 53 55 TCAAAG G G CTCG GTCTTCAG 765 781 17 69 47 TGTCAAGAG CATCAGCA 33 57 61 65 77 7 G 745 ?£2 18 58 ei CCCAAGCCCTCAGTG GAA 309 790 20 53 55 TCAAAG G G CTCG GTCTTCAG 765 782 18 69 50 TGTCAAGAG CATCAGCAG 33 57 61 65 77 300 822 23 &: 48 AGCCCmGATGACTTCCTGTTC 36- 847 18 S9 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 827 844 18 70 61 CATCATCCAGGCCCAGTG 84 60 £2 65 30 9 300 822 23 &: 48 AGCCCmGATGACTTCCTGTTC 36- 847 18 53 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 828 845 18 70 61 ATCATCCAGGCCCAGTGG 84 60 £2 65 30 10 c- ■• - 300 822 23 63 48 ah nnrxTTG atg ArTTr.rTGTTr. PP-PÄ ÄJ^PPPTPÄJ^TJ^J^ Ä Ä m7 i n e.7 ijr-i jinnn rTP-fi nTPTTPÄ n™ FldR " m 65 TCATCCAG g CCCAGTG G 84 60 62 65 30 -ŠT 12 11 745 762 18 E3 Si -L-'.l: i l: l: mm uuuAAijiJUUI UAIJ1 IJIjAA -3TT -TTT -2D" -53" -50- -. 1 ■_ •- ■j-j-.l-.-j-ji-.l 1 ■_ -. ATCAAAG G G CTTGgTCTTCA- -TSÍ -7ZT -IT b9 - 1 u 1 LŕWjrtu Um i Umu L-1U1 UAAlIAlí uA I uAij uA S3 56 60 66 82 13 12 74S ?£2 18 58 ei CCCAAGCCCTCAGTG GAA 810 791 20 58 50 ATCAAAG G G CTCGGTCTTCA 765 782 18 69 50 TGTCAAGAG CATCAGCAG 33 56 60 66 82 14 13 74S ?£2 18 58 ei 810 790 21 53 52 ATCAAAG G G CTCG GTCTTCAG 765 730 16 68 50 TGTCAAGAG CATCAGC 33 56 60 66 33 15 1- 74S ?£2 18 58 ei CCCAAGCCCTCAGTG GAA 810 790 21 53 52 ATCAAAG G G CTCG GTCTTCAG 765 781 17 69 47 TGTCAAGAG CATCAGCA 33 56 60 66 33 16 15 745 7G2 18 58 Gl CCCAAG CCCTCAG TG -G AA 810 790 21 SB 52 ATCAAAG G G CTCG GTCTTCAG 765 782 18 G3 50 TGTCAAGAG CATCAGCAG 33 56 G0 GG 33 17 16 799 321 23 &: 48 GAGCCCmGATGACTTCCTGTT 36- 847 18 53 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 827 844 18 70 61 CATCATCCAGGCCCAGTG 84 61 £2 66 85 13 17 799 321 23 &: 48 GAGCCCmGATGACTTCCTGTT 36- 847 18 53 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 828 845 18 70 61 ATCATCCAGGCCCAGTGG 84 61 £2 66 85 19 13 799 321 23 &: 48 GAGCCCmGATGACTTCCTGTT 36- 847 18 53 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 823 845 17 69 65 TCATCCAGGCCCAGTG G 84 61 £2 66 85 20 13 74S ?£2 18 58 ei CCCAAGCCCTCAGTG GAA 811 792 20 58 55 CATCAAAG G G CTCGGTCTTC 765 730 16 68 50 TGTCAAGAG CATCAGC 33 57 61 67 87 21 20 74S ?£2 18 58 ei CCCAAGCCCTCAGTG GAA 811 792 20 58 55 CATCAAAG G G CTCGGTCTTC 765 781 17 69 47 TGTCAAGAG CATCAGCA 33 57 61 67 87 22 21 74S ?£2 18 58 ei CCCAAGCCCTCAGTG GAA 811 792 20 58 55 CATCAAAG G G CTCGGTCTTC 765 782 18 69 50 TGTCAAGAG CATCAGCAG 33 57 61 67 87 23 22 738 313 21 59 52 CGAGCCCTTTGATGACTTCCT 36- 847 18 53 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 32Z 335 16 69 50 TTCCCAGCATCATCCA 85 61 £2 67 88 24 23 738 313 21 59 52 CGAGCCCTTTGATGACTTCCT 36- 847 18 53 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 32Z 336 17 69 53 TTCCCAG CATCATCCAG 85 61 £2 67 88 25 2- 738 313 21 59 52 CGAGCCCTTTGATGACTTCCT 36- 847 18 53 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 321 335 15 69 53 TCCCAGCATCATCCA 85 61 £2 67 88 26 25 738 313 21 59 52 CGAGCCCTTTGATGACTTCCT 36- 847 18 53 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 321 336 16 69 56 TCCCAG CATCATCCAG 85 61 £2 67 88 27 2£ 738 313 21 59 52 CGAGCCCTTTGATGACTTCCT 36- 847 18 53 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 822 33- 13 69 £2 CCCAGCATCATCC 85 61 £2 67 88 23 2? 738 313 21 59 52 CGAGCCCTTTGATGACTTCCT 36- 847 18 53 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 827 844 18 70 61 CATCATCCAGGCCCAGTG 85 61 £2 67 88 29 23 738 313 21 59 52 CGAGCCCTTTGATGACTTCCT 36- 847 18 53 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 828 845 18 70 61 ATCATCCAGGCCCAGTGG 85 61 £2 67 88 30 23 738 313 21 59 52 CGAGCCCTTTGATGACTTCCT 36- 847 18 53 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 823 845 17 69 65 TCATCCAGGCCCAGTG G 85 61 £2 67 88 31 30 74S ?£2 18 58 ei CCCAAGCCCTCAGTG GAA 812 793 20 58 50 T CATCAAAG G G CTCGGTCTT 765 730 16 68 50 TGTCAAGAG CATCAGC 82 56 60 68 92 32 31 74S ?£2 18 58 ei CCCAAGCCCTCAGTG GAA 812 793 20 58 50 T CATCAAAG G G CTCGGTCTT 765 781 17 69 47 TGTCAAGAG CATCAGCA 82 56 60 68 92 33 32 74S ?£2 18 58 ei CCCAAGCCCTCAGTG GAA 812 793 20 58 50 T CATCAAAG G G CTCGGTCTT 765 782 18 69 50 TGTCAAGAG CATCAGCAG 82 56 60 68 92 34 33 797 316 2-: 58 55 CCGAG CCCTTTGATG ACTTC 36- 847 18 53 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 32Z 335 16 69 50 TTCCCAGCATCATCCA 85 £2 £2 68 92 35 3- 797 316 2-: 58 55 CCGAG CCCTTTGATG ACTTC 36- 847 18 53 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 32Z 336 17 69 53 TTCCCAG CATCATCCAG 85 £2 £2 68 92 36 35 797 316 2-: 58 55 CCGAG CCCTTTGATG ACTTC 36- 847 18 53 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 321 335 15 69 53 TCCCAGCATCATCCA 85 £2 £2 68 92 37 36 797 3ie 2-: 58 55 CCGAG CCCTTTGATG ACTTC 36- 847 18 53 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 321 336 16 69 56 TCCCAG CATCATCCAG 85 £2 £2 68 92 33 3? 797 3ie 2-: 58 55 CCGAG CCCTTTGATG ACTTC 36- 847 18 53 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 822 33- 13 69 £2 CCCAGCATCATCC 85 £2 £2 68 92 39 33 797 3ie 2-: 58 55 CCGAG CCCTTTGATG ACTTC 36- 847 18 53 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 822 336 15 68 60 CCCAGCATCATCCAG 85 £2 £2 68 92 40 33 797 3ie 2-: 58 55 CCGAG CCCTTTGATG ACTTC 36- 847 18 53 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 323 337 15 68 60 CCAG CATCATCCAGG 85 £2 £2 68 92 41 40 797 3ie 2-: 58 55 CCGAG CCCTTTGATG ACTTC 36- 847 18 53 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 827 3-0 14 68 64 CATCATCCAGGCCC 85 £2 £2 68 92 42 -1 797 3ie 2-: 58 55 CCGAG CCCTTTGATG ACTTC 36- 847 18 53 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 827 842 16 68 63 CATCATCCAGGCCCAG 85 £2 £2 68 92 43 -2 797 3ie 2-: 58 55 CCGAG CCCTTTGATG ACTTC 36- 847 18 53 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 827 844 18 70 61 CATCATCCAGGCCCAGTG 85 £2 £2 68 92 44 -3 797 3ie 2-: 58 55 CCGAG CCCTTTGATG ACTTC 36- 847 18 53 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 828 845 18 70 61 ATCATCCAGGCCCAGTGG 85 £2 £2 68 92 45 -- 797 3ie 2-: 58 55 CCGAG CCCTTTGATG ACTTC 36- 847 18 53 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 823 845 17 69 65 TCATCCAGGCCCAGTG G 85 £2 £2 68 92 46 -5 797 3ie 2-: 58 55 CCGAG CCCTTTGATG ACTTC 36- 847 18 53 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 830 845 16 68 69 CATCCAGGCCCAGTG G 85 £2 £2 68 92 47 -6 300 822 23 &: 48 AGCCCTTTGATGACTTCCTGTTC 867 851 17 53 71 CACG GAG CG G G CTGTCT 827 844 18 70 61 CATCATCCAGGCCCAGTG 84 60 £2 68 36 43 -7 300 822 23 &: 48 AGCCCTTTGATGACTTCCTGTTC 867 851 17 53 71 CACG GAG CG G G CTGTCT 828 845 18 70 61 ATCATCCAGGCCCAGTGG 84 60 £2 68 96 49 -3 300 522 23 60 48 AG CCCTTTGATGACTTCCTGTTC 867 851 17 59 71 CACG GAG CG G G CTGTCT 829 845 17 69 65 TCATCCAG G CCCAG TG G 84 63 62 68 96 50 -3 796 316 21 59 52 ACCGAGCCCTTTGATGACTTC 36- 847 18 53 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 32Z 335 16 69 50 TTCCCAGCATCATCCA 85 61 £2 69 98 51 50 796 3ie 21 59 52 ACCGAGCCCTTTGATGACTTC 36- 847 18 53 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 32Z 336 17 69 53 TTCCCAG CATCATCCAG 85 61 £2 69 98 52 Design primerů a sond Home Products Applications & Technologies Services Support Learning & Events [?] store Help Log In or Register to see your product prices & to place orders. I Enter search term | | All Categories 13 Products > Real-Time PCF. > Gene Expression Assays, Plates & Arrays > Assays > TaqMamg Gene Expression Assays TaqMan® Gene Expression Assays Click a tab below tc learn more about TaqMan Gene Expression Assays. To find and order assays,, click the Search tab Ordering Information Product Description Specifications Literátu re/ Support Related Products Assay Search To begin, selects search method below - Keyword: Search by gene symbol, gene name, public accession number, biological process, or molecular function, - Batch ID: Search by uploading a file containing multiple assay IDs, RefSeq accession numbers, GenBank GI #s, LocusLink IDs, gene symbalsr IMAGE Clone IDsr or species. Keyword Search | Batch ID Search Search for I All Text" HI |P| Disable wildcard search + Advanced Keyword Search www.appliedbiosystems.com Choose Species Filter by Am pi icon Lengths □ H sapiens □ A. thaliana □ Amplicc n length less than 70 □ R norvegicus □ D. melanogaster □ ftmplii n length between 71 and 85 □ M musculus □ C. elegans □ Amplicc n length between 06 and LOO □ M. mulatta (Rhesus j □ C familiaris (Canine] □ ftmplta n length greater than or equal to 101 □ D. nerio (Zebrafish) □ B. taurus (Cow) □ G. gallus (Chicken) O. cunículus (Rabbit) □ S. scrota (Pig) Choose Set Membership e ) Search All Assays [excludes Gene Copy Number Assays) ) Search Gene Copy Number Assays 3 Limit Assay Sets to: TARGET CLASS ASSAY ATTRIBUTE £\ Apoptosis r] Ambion siRNA □ Fusion Transcripts □ Endogenous Controls M ICRDARRAY VALIDATION n 1700 IT] 3' Most CDLLABDRATDR SETS r] Immune Tolerance I.et-.-cr-i n] Mammalian Gene Collection Orden.'ii Information Assay Search Product Description Specif cations Literature/Support Related Products irch FtfWc-Fos in í to reFir^^our se y other crweria, si your search Fo^e-Fos in All Text ' returned 2.7 results. ( Species: Homo sapiens Arnplieon Length: ALL Set Membership: ALL ) If you wish to reFir^^our search results by product availability, click a radio button below, and then click Filter Results. To filter your results by other cr^eria, select From the categories list to the lePt of your results. Search Help Previous | 1 | 2 | Ne*± View Results by Category Panther Classification: ■ Panther Function [26) ■ Panther Process (26) Filter Results by availability Inventoried Assays Made to order Assays ° Inventoried and Made to order Assays Please Log In to add products to your Shopping Basket/Favorites, configure a product, or to view products available For purchase in your country. 25 items/page | T I Feedback □ 1. Assayjp^^ta i Is : ^^^■#170 03 0_m 1 Alignment Hap siRNAs B Related Products Inventori-ed FDS v-fos FBJ AP-L NM_005252.2 5 GenBank Homo 77 murine C-FOS mRNAs sapiens osteosarcoma homology □ 2. Assay ID Details: Hs99999L40_mL Inventoried FQS v-fos FBJ AP-1 NM_005252.2 5 GenBank Homo 77 murine C-FOS mRNAs sapiens m b o I Alias ► RefSeq □ Assay ID Details: H500170S30_ml Alignment Map siRNAs 6 Related Products inventoried FOS v-fos FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog AP-1 C-FOS NM 005252.2 5 GenBank mRNAs Homo sapiens 77 Homo sapiens Design primerů a sond Roche Applied Science Czech Republic Home Products Special Interest Sites Support & Resources News Special Interest Sites > Genomic Systems > Real-Time PCR Systems > Universal ProbeLibrary System Universal ProbeLibrary Real-Time PCR Systems ► LightCyclerS Carousel-Based System ► LigntCycler' 480 System * Universal ProbeLibrary System ► System Description ► Technology ► Assay Design Center ► User Statements and Application ► Assay List ► Performance ► Product List ► Support ► Literature and References ► Multimedia Presentations ► Product Information and Pack Inserts Gene Expression Quantification with Real-Time PCR - Simple and Fast ♦ Design real-time qPCR assays online in seconds. ♦ Rely on just 165 prevalidated proses for over five million qPCR assays for a large variety of organisms. ♦ Reduce the cost of gene expression analysis by performing multiplex qPCR assays with Universal ProbeLibrary Reference Gene Assays. www.universalprobelibrary.com Universal ProbeLibrary for Human Specity your target(s): By sequence ID, gene name or keyword — e.g. ENST00000331789, NM_0Q1101 orX00351 or beta-actin Roche Applied Science Advanced primer3 settings -By sequence— e.g. >part cf XÜU351 Human mEMä fcr beta-actin GAGCTGCGIGTGCCICCCGfiG€AGCfiCCCCGIGCTGCIGACCGfiGffl;CCCCCIGfia^^C"C iaCGIIGCIAICCÄGGClGIGCEMCCCIGIfiCGCCTCTGGCCGIACCaCT.GGCfiICGIG MGGACTCCGGIGfiCGGGGICACCraCAClGIGCCCÄICIfiCGfiGGGGIfilGCCCTCCCC 0 Automatically select an intron spanning assay. G Design multiplex PCR with reference gene. Design primerů a sond Real-Time PCR Systems ► LightCycler* Carousel-Based System ► LightCycler* 4S0 System *■ Universal ProbeLibrary System ► System Description ► Technclcgy - Assay Design Center ► Pack Inserts ► Assay Design Guide ► Quick Reference ► Probe No. Conversion ► Need Help? ► User Statements and Application ► Assay List ► Performance ► Product List ► Support ► Literature and References ► Multimedia Presentations ► Product Information and Pack Inserts Please choose the sequence^) you would like to continue with. You can select up to 10 sequences. Name Length Description O ENST00000400991.1 2669 □ EN STO 00 00 30 356 2.2 2103 □ ENST00000297904.2 2110 □ NM_003367.2 1732 O NM_207291.1 1531 □ NM_003131.2 4343 O N M_0 04469.2 2128 □ ABO22275.1 300 □ ABO 22276.1 700 AB20912S.1 5672 □ AF126533.1 238 AL139130.28-201 Clone_based_ensembl_transcri Transcriptional activator of the c-fos promoter CROC 4 (CRQC-4). [Source :UniprotfSPTREMBL;Acc:Q8N964] FOS-201 HG Proto-cncog fos)[G0/G1 [Source:Uni FIGF-001 H( endothelial (c-fcs-induci [Source:Uni Homo sapie c-fos interac Homo sapie c-fos interac Homo sapie response el (SRF), mRN Homo sapie (vascular en mRN A. Homo sapie partial cds Homo sapie partial cds Homo sapie [c-fos serun transcription Homo sapie ProfoeFinder has designed the optimal real-time PGR assay for: NM_0033S7.2 Homo sapiens upstream transcription factor 2, c-fos interacting (USF2J, transcript variant 1, mRNA. Assay details: Use Universal ProbeLibrary probe: #26, cat.no. 04687574001 Primer Length Position Tm %GC Sequence Left Primer 18 449 -466 60 67 gtgacccaggtgggtgtg Right Primer 21 540-560 59 43 tgaagggattttggatcacag Amplicon (112 nt] gtgacccaggtgggtgtggacggggcagcccagcgcccgggccccgccgctgcctctgtg cccccaggtcctgcagcgcccttcccgctggctgtgatccaaaatcccttca | Download pack insert | | PDF report | | Text report j [ Order probes or set Transcript overview: 26 . TTT T Á Al Á i 1732 Detailed view: 26 43i Design primerů a sond Universal ProbeLibrary 1**'*sal Pro) Po dnešní přednášce: - Rozumíte vlastnostem primerů i základních typů sond a znáte faktory, které ovlivňují jejich hybridizaci a účinnost - Umíte navrhnout optimální sekvenci primerů i hydrolyzační sondy pomocí dostupných programů a rozumíte parametrům designu