UVOD DO KVANTITATIVNÍ REAL-TIME PCR VI. Aplikace qRT-PCR Aplikace 1. Detekce DNA - Diagnóza infekčních onemocnění (přítomnost patogenů v krvi, séru, plazmě ...) - Sledování minimální reziduálni nemoci - Detekce patogenů v potravinách a v životním prostředí - Detekce GMO - Autenticita potravin 2. Detekce RNA - Minimální reziduálni onemocnění (Her2 - karcinom prsu, Bcr-Abl - CML, ELAVL-4 - neuroblastom) - Detekce RNA virů - Diagnóza nádorových onemocnění (PSA - karcinom prostaty) - Validace microarray experimentů 3. Detekce SNP 4. Detekce miRNA Aplikace Aplikace v klinické mikrobiologii Diagnóza - rychlá, citlivá a přesná determinace patogenů Klasické kultivační metody - časově náročné (24-48hod), nízká citlivost, omezené spektrum druhů qRT-PCR - např. geny kódující 23S rRNA nebo 16S rRNA Rutinní diagnostika - Helicobacter pylori, Chlamydia pneumoniae, Streptococcus pneumonieae Monitoring zneužitelných druhů - biodefense - Yersinia pestis, Bacillus anthracis Výzkum - testování antibiotik - multidrug resistant strains (analýza bodových mutací v genech zodpovědných za metablismus ATB) - Mycobacterium tuberculosis, Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus Houbová a parazitární onemocnění - Aspergillus fumigatus, Candida sp. - Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum Aplikace Aplikace v klinické mikrobiologii Příklad protokolu: Detekce Prevotella intermedia Stěr z úst Resupendovat stěr v 1xPBS Vortex 30s, cfg. 20min/15 OOOg Izolovat bakteriální DNA ze supernatantu Návrh primerů (Primer Express) - oblast 16S rDNA Např.: Forward: 5'-AATACCCGATGTTGTCCACA-3' Reverse: 5'-TTAGCCGGTCCTTATTCGAA-3' Reakční směs PCR 2x SYBR green Master Mix (Applied Biosystems) 26,0jal 95°C 1min Forward primer (10|aM) 2,0\i\ Reverse primer (10|aM) 2,0\i\ 95°C 15s PCR grade H20 15,0|al 60°C 1min Vzorek DNA nebo standard 5,0|al f 40X ) Disociační křivka - 60-95°C Aplikace Aplikace v klinické virológii Typizace virů (např. chřipka) nepřítomnost signálu - variabilita v sekvencích/falešně negativní výsledky Hydrolyzační (TaqMan) i hybridizační sondy Kvantifikace - virový titr např. hepatitída B/C, HIV, EB, cytomegalovirus atd. Transplantace Detekční limity - genomové ekvivalenty (ge) End-point analýza - detekční limit 5x101 ge; dynamický rozsah 101-104 ge Hybridizační analýzy - detekční limit 2x101 ge; dynamický rozsah 101-104ge Inter- a intra assay variabilita >40% qRT-PCR - detekční limit 1 x101 ge; dynamický rozsah 101-108 ge Inter- a intra assay variabilita <5-10% Interní amplifikační kontrola - Paralelní PCR známého standardu - Tzv. „Spiking" vzorků známými sekvencemi - Paralelní analýza příbuzného viru (např. pro lidský HSV - tulení PhHV) Aplikace Aplikace v klinické virologii Příklad protokolu: Detekce viru chřipky (Influenza A) - 5' nukleázová assay Stěr z nosohltanu Resupendovat stěr v 1xPBS Vortex 30s, Izolovat virovou RNA ze supernatantu Návrh primerů a sondy (Primer Express) - oblast M1 (influeznaA matrix gene) Např.: Forward: 5'-CTTCTAACCGAGGTCGAAACGTA-3' Reverse: 5'-GGTGACAGGATTGGTCTTGTCTTTA-3' Sonda: Fam-TCAGGCCCCCTCAAAGCCGAG-BHQ+ Reakční směs - One Step PCR (Qiagen) PCR Qiagen One Step RT-PCR Enzyme Mix 1,0|al 50°C 20min (Reverzní transkripce) Qiagen One Step RT-PCR Buffer (5x) 5,0jal Qiagen One Step RT-PCR dNTP mix (10mM) 1,0|al 95°C 15min (Aktivace polymerázy) Forward primer (10|aM) 2,0\i\ Reverse primer (10|aM) 2,0jal 95°C15s i 45X j Sonda (20\xM) 0,2jal 60°C1min \___J PCR grade H20 8,8jal Vzorek DNA nebo standard 5,0jal Aplikace http://www.idahotec.com/BioDefense/ Terénní qRT-PCR - Detekce patogenů mimo laboratoř - Komerční specializovaná řešení http://www.rapidcycler.com/GSA/index.html Aplikace Jednonukleotidové polymorfismy SNP DNA sekvence lišící se v jediném nukleotidu Kódující i nekódující oblasti Záměna nukleotidu nemusí nutně vést k záměně AA Variabilita v odpovědi k patogenům, léčivům, atd. Senzitivita k onemocněním http://www.ncbi.nlm.nih.qov/projects/SNP/ Detekce Taqman SNP microarray ■< SNP >■ Aplikace SNP genotypizace pomocí real-time PCR Zejména molekulární majáky a TaqMan sondy End-point analýza • 2 alelově specifické sondy které mají specifické fluorofory a PCR primery, které detekují specifický target • Vysoká specificita • Próby s MGB (minor groove binder, 3') - zlepšují hybridizaci stabilizací vazby MGB s templátem • Proby cca 13bp Aplikace SNP genotypizace pomocí real-time PCR Zejména molekulární majáky a TaqMan sondy End-point analýza '. Assayconrpcnents and DNAtemplate ■ Iii i Forward primer E Ir Probe 111 tBfttt i i i r rrr^ŕ DUA :etid jot :3 v iiiiiiiiiii iiiiiiiiii iiiiiiiiii iiiiiiiiir 2. Denatwed template and -annealing assay QomponEnte 5' ľ rcnvsTi prrrír ^j.' i i i i j jiiu J i J.....i-L Rrverae-primer ' ■.......11 j.i i.i i 3. Polymerization and s era. generatiDn ^chetm- pr -er >........ffi 111 Jllllllllll................1 rVTTTinfllll^rrrrrrr : V '.'IC" üfc Minor Groove Ampinaq GokP C =cy-era=e _ Frcbe i Primer — Icmnare EHenaed n1mer Unilptrrminnd • Allele X • Allele Y • Both ■ NTC 4 ■Jl ■ . * 4 4 1 ■ L* ■ K Allele X [SNP Allele 1) Figure 1. Allelic discrimination is achieved by the selective annealing ofTaqMan* MGB probes. Aplikace SNP genotypizace pomocí real-time PCR Zejména molekulární majáky a TaqMan sondy End-point analýza • Detekce pomocí dvou majáků - 1 se váže na wt alelu, druhý na mutantní alelu • Různé fluorofory Molecular Probe Target Sequence Emission of Fluorescence Aplikace SNP genotypizace APEX (Arrayed primer extension) - 2D matice, oligonukleotidy imobilizované 5'koncem - PCR produkt je hybridizován a prodloužen DNA polymerázou - Fluorescenčně značené terminátorové nukleotidy Aplikace SNP genotypizace SNP array Array pomocí použití tisíce prob B. SNP array Patient DNA Amplification Digestion Probe labeling SNP array ^ Allele A Allele B I Hybridizatii ^ $<$><§> A ^ Normal eo o ooo • • • ooo o Deletion • • • « • o o • • • • Oft £ Duplication • Aplikace Analýza křivek teplot tání = High resolution melting analysis Analýza komplexních sekvencí PostPCR analýza Snadná analýza neznámých sekvencí Sledování disociace řetězců DNA v závislosti na teplotě B. Normalized Melting Curves 100 ™ 75 50- j 25 o W' \ DouĎle-stranded DNA Single-etranded DNA DNA) ^ (random coils) V «f 76 79 82 Tm 38 91 Temperature [X] ■ oo 80 I BO 20 25 20 15 10 i, a -Q -5 ® c< /ild typ: ;allel« )es Mutc ]nts „ i „ \ (l all 9le) Hí steroz1 /gote; fi? S7Í ST R3 ^ Si Ri 'i R jf ■ Hete rozyg otes 81 5 82 82.5 83 33. i 34 84Í Tempera lim; (°C) 85.5 80 B0.5 37 Aplikace mi RNA detekce MikroRNA (miRNAs) -Malé molekuly RNA - rostliny i živočichové - konzervativní sekvence - 21mery - regulují expresi genů vazbou na 3' nepřekládaný region mRNA (3'UTR) a I Pre-miRNA miRNA genes Nucleus Cytoplasm i., i ^Dicer m íl n miRNA duplex lil lnliiľiľ JkúĽĽT I -1_L Oncogene One strand incorporated into Rlz C Tumor suppressor gene Rlz C Target mRNA mRNA cleavage Translation inhibition iTumor suppressor gene expression tOncogene expression Aplikace í>oo- 150- '00- 50 Lower Marker miRNA Region tRNAs Small rRNAs ZU U 80 100 75 ng/ul Thymus Total RNA 20 40 60 150 [ntj Fig. 1A. Image of a typical electropherogram for small RNA analysis performed with the Small RNA Assay on the 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) (http:// www.chem.agilent.com/Library/technicaloverviews/Public/5989-7002EN.pdf). Becker C. et al. 2010. Methods 50(4):237-243 Aplikace miRNA detekce • Specifický primer pro RT • 5' nuclease assay (TaqMan) PCR Endogenní kontrola: malá jaderná RNA(snRNA) —B— RNU58B RNU58A -*- RPL21 -sfc- U54 HY3 —1- U75 - U47 snoRNA135 snoRNA142 snoRNA202 snoRNA234 snoRNA251 J g. I «33 C C 0) C © q fláJIilmšiijiiJj > •- -fi. -0 CC ™ 'S CC u. (D _ O TO TB E ? -5 « S F °?2 □mach A3 C "D > "D TJ «J U T m. Gl ľ: c/5 m s S 2 5 > - E HumanTissues Mouse Tissue 43728250 Aplikace Analýza DNA metylací • Více než 70% C lidského genomu v sekvenci CpG je metylováno • Významná modifikace, regulující např. architekturu chromozomu i řadu dějů na buněčné úrovni • regulační úseky genů - promotory C + bisulfit = U mC intaktní STEP 1 nu, Sulphonation nh, HS03. »HN/ > OH N H Cytosine o ~\ ^-"so, N H Cytosine sulphonate Endonukleázy citlivé metylovaným sekvencím BsoFI, Hpall, Mspl and Hhal Hydrolytic Deamination HS03 OH I STEP3| Alkali Uracil Desulphonation Uracil Historie (ails The two main components of the epigenetic code DNA methylation Methyl marks added to certain DNA bases repress gene activity. Histone modification A combination of different molecules can attach to the 'tails' of proteins called histones. These alter the activity of the DNA wrapped around them. Aplikace Kvantitativní analýza DNA metylací pomocí real-time PCR Nemetylováné cytosiny jsou konvertovány na U bisulfitovou metodou 1. Pro každou sekvenci dva páry primem nebo 2. Jsou použity oligonukleotidy hybridizující k nemetylovaným sekvencím a blokující PCR ni ._m_ Aplikace Single cell profiling ton > glass capillaries flow cytometry laser capture Total number of transcripts = 6 O Ob Total number of transcripts = 7 Total number of \ transcripts = 6 B Total number of transcripts = 6 Total number of transcripts ■ 7 Total number of ^ transcripts = 6 Cell collection > Cell lysis Reverse transcription Real-time PCR Data analysis purification detergents heat osmotic mechanic * reverse transcriptase ■ priming * temperature profile * pre-amplification mastermix priming temperature profile detection chemistry pre-amplification normalization • quality assessment • statistics Stahlberg A. and Bengtsson M. 2010. Methods 50(4):282-288 Aplikace Circulating tumor cells (CTCs) Alluni-Fabbroni. 2010. Methods 50(4):289-297 Droplet digital PCR • Precizní sensitivní stanovení NK • Kombinuje klasické PCR postupy s fluorescenčním stanovením produktu • Rozdělení PCR reakce na stovky až tisíce subreakcí - někde dojde k replikace, někde ne - přítomnost/nepřítomnost hledané sekvence • Subreakce individuálně analyzovány • Ratio pozitivních a negativních reakcí - počáteční množství molekul templátu • Absolutní kvantifikace bez externích standard ddPCR-využití • Kvantifikace virů a patogenů • Genové exprese - pokud rozdíly menší než dva krát • Copy number variations • Single cell analysis • Rare mutations.... ddPCR ■juler Enzym* PCR Prmer* Deiaciion syii*m (prone or