Metody značení a
imobilizace biomolekul
Petr Skládal
Ústav biochemie PřF MU
Kamenice 5, Brno
skladal@chemi.muni.cz
Úvod
modifikace biomolekul:
– vzájemné spojování
– zavádění vhodných značek
– navázání na pevný povrch (separační materiály,
mg. částice, sensory, …)
základ řady moderních:
– vědeckých výzkumných metod
– bioanalytických procesů
– terapeutických postupů
často zmiňovány jen okrajově
– cílem přednášky je podat ucelený
pohled na tuto problematiku
Souhrn přednášky
1. Modifikace proteinů a peptidů.
2. Funkční skupiny nukleotidů, modifikace DNA a RNA. Modifikace
(poly)sacharidů.
3. Chemické reakce vybraných skupin biomolekul.
4. Biokonjugační reakce, zesíťující činidla. Štěpitelné můstky.
5. Fluorescenční značky.
6. Biotinylace, chelatační skupiny, histidinové skupiny, boronátové
komplexy. Radioaktivní značení. Liposomy, nanočástice.
7. Enzymové značky, metodiky značení a detekce aktivity.
8. Imobilizace biomolekul. Aktivace matric, polymerní materiály,
porézní skleněné nosiče.
9. Aktivace povrchu zlata, platiny, uhlíku a křemíku. Spontánní vznik
monovrstev, fotoaktivace.
10. Charakterizace biokonjugátů - stupeň substituce, povrchová
hustota ligandu.
11. Aplikace: konjugace haptenů s nosiči, značení protilátek.
12. Aplikace: imobilizace proteinů na povrch zlata, příprava DNA
biočipů.
Literatura
P. Skládal: Metody značení a imobilizace biomolekul.
Elektronický text (PDF), MU Brno, 2017(?).
Lowe C.R., Dean P.D.G.: Afinitní chromatografie. SNTL,
Praha 1979.
Hermanson G.T., Mallia A.K., Smith P.K.: Immobilized
Affinity Ligand Techniques. Academic Press, San
Diego, CA, 1992.
Hermanson G.T.: Bioconjugate Techniques. Academic
Press, San Diego, CA, 1996.
C.M. Niemeyer: Bioconjugation Protocols, Strategies
and Methods. Humana Press, Totowa, NJ, 2004
internetové zdroje - webové stránky dodavatelů
reagencií (Pierce, Sigma, …)
Hermanson G.T., Mallia A.K., Smith P.K.: Immobilized Affinity
Ligand Techniques. Academic Press, San Diego, 1992.
The matrix
Activation methods
Immobilization of ligands
Techniques of the trade
Selected applications
Hermanson G.T.: Bioconjugate Techniques. Academic
Press, San Diego, 1992 - 2008.
C.M. Niemeyer: Bioconjugation Protocols, Strategies and
Methods. Humana Press, Totowa, NJ, 2004
H3N
C
H
O
O
R
+
-
O
C
H
O
C
H
R
N
H
H3N C
H
R
N
H
R
O
O
+ C
C C
Modifikace
peptidů a proteinů
aminokyseliny spojené navzájem peptidovou vazbou:
modifikovat lze některé postranní řetězce AK, koncovou
aminoskupinu a karboxyskupinu, a případně také
kovalentně připojené prostetické skupiny (např.
koenzymy)
AK nepolární a hydrofobní: glycin, alanin, valin, leucin,
isoleucin, methionin a prolin
AK nepolární aromatické: fenylalanin a tryptofan
– tyto jsou často orientovány dovnitř struktury proteinu, a tedy
nepřístupné pro modifikační činidla
AK polární: asparagin, glutamin, threonin a serin
– mimo Gln často posttranslačně modifikovány oligosacharidovými
zbytky přes N- nebo O- glykosidické vazby
– často modifikovány enzymově (např. fosforylace), avšak chem.
modifikace ve vodném prostředí nesnadná, protože nukleofilní
vlastnosti hydroxylu i amidu se blíží vodě
AK s ionizovatelnou skupinou - kyseliny asparagová
a glutamová, lyzin, arginin, cystein, histidin a tyrosin
– v deprotonovaném stavu jsou účinná nukleofilní činidla
– hlavní cíl modifikačních reakcí
Aminoskupina (Lys, Arg, His, N-konec)
volná aminoskupina (konec pept. řetězce a Lys) je
nejčastějším cílem
Lys (pKa 9,3 až 9,5) je obvykle protonován
Arg (pKa přes 12) je protonován prakticky vždy
His s imidazolovým kruhem (pKa 6,7 až 7,1)
aminoskupiny se účastní alkylačních a acylačních
reakcí, kdy fungují jako nukleofily
imidazol. kruh může být elektrofilní, např. při jodaci
Alkylace a acylace aminoskupiny
průběh při reakcích je nukleofilní substituce - vzniká tetraedrický
intermediát, X je obecná odstupující skupina
NH2
O
O
NH2
-R X
R
X
O
O
N
H
O
NH
R
R
-
N
H
O
O
NHO
R
O
R
-
acylace
alkylace
-HX
-HX
Karboxyskupina (Asp, Glu, C-konec)
postranní karboxyly (pKa 3,7 až 4,5) při fyziologickém pH
nesou záporný náboj
vhodné pro tvorbu amidových, případně i hydrazidových
derivátů
lze připravit i thioestery - ve vodném prostředí nestabilní
derivatizace probíhá přes reaktivní intermediáty nejznámější
je použití karbodiimidů (EDC, DCC, CMC):
CMC … cyklohexylmorfolinoethylkarbodiimid
DCC … dicyklohexylkarbodiimid
– nerozp. ve vodě, spíše pro konjugace malých molekul
N N CH2CH2N N N
+
O
CH3
C C
tosyl-DCC CMC
CH3
N
O O
R
N N
CH3
CH3
H
H
+
Aktivace karboxylu karbodiimidem
R O
O
-
NCH3
C N N
CH3
CH3
H
+
R' OH R' NH2
R' SH
R'
N
NH2
H
R
O
O
R'
R
O
S
R'
R
O
N
R'
H
R
O
N
N
R'
H
H
alkohol thiolamin hydrazin
EDC … ethyl-N,N-dimethyl-
-3-aminopropylkarbodiimid
N
H
N
H
O
CH3
N
+
CH3
CH3
H
subst.
močovina
ester thioesteramid hydrazid
Alternativní postupy
reakce s karbodiimidy je velmi rychlá
– nesnadná kontrola průběhu, nežádoucí postranní
reakce, konkurenční hydrolysa je rychlá
konjugační reakce se provádí přes
stabilnější aktivované meziprodukty - NHS,
N-hydroxysukcinimid, nebo rozpustnější sulfo-NHS
OH
O
N
O
R O
O
-
N
N
N
N
O
N
O
O
SO3
OH
-
N
N
R
O
N
O
O
SO3
O
O
R
+
EDC
karbonyldiimidazol
… další možnostsulfo-NHS
NHS
vzniklé NHS-deriváty nebo imidazolylové deriváty jsou
relativně stabilní ve vodném prostředí a ochotně reagují
např. s aminoskupinou za vzniku amidů
komerčně je dostupná široká škála NHS-aktivovaných
molekul (NHS-biotin, NHS-fluorescein, …), které se pak
velmi jednoduše mohou konjugovat s cílovou
biomolekulou (R'-NH2):
R' NH2
R
O
N
R'
H
N
O
O
SO3
O
O
R
-
NHS
Thioskupina (Cys)
cysteinové zbytky jsou normálně protonované a bez náboje (pKa 8,8
až 9,1)
nejdůležitější reakcí v přirorozeném stavu je tvorba vzájemných
disulfidů (cystinové uskupení)
mohou se účastnit alkylací a reversibilních redoxních reakcí
z oxidované formy (disulfid) vzniká redukovaná forma (volná SH
skupina) pomocí redukčního činidla dithiothreitolu (DTT,
Clelandovo činidlo)
reakce může probíhat oběma směry
SH
OH
SH
OH
SS
OH OH
N
H
N
H
S
O
O
S
N
H
O
N
H
O
N
H
N
H
SH
O
O
DTT2
cystin
N
H
N
H
S
O
O
R
N
H
N
H
SH
O
O
R X
R
X
O N
H
N
H
S
O
O
O R
N
O
O
R
N
N
H
N
H
S
O
O
R
O
O
NS
S
R
NS
N
H
N
H
S
O
O
S
R
alkylace
acylace
deriváty
maleimidu
(NEM)
vznik disulfidové
vazby
thioether
(stabilní)
thioester (nestabilní,
hydrolyzuje)
adiční
produkt
(stabilní)
pyridin-2-thion
Fenolická skupina (Tyr)
diazotační kopulace - elektrofilní substituce na
aktivovaném benzenovém jádře
– probíhá do ortho polohy, spojení s aromatickými aminoskupinami,
aktivací s kys. dusitou (dusitan a HCl) vzniká regující diazoniová sůl
– vzniklé konjugáty mají oranžovou barvu
další možnost - jodace, radioaktivní značení 125I
Mannichova kondenzace - připojení aminosloučeniny
v přítomnosti formaldehydu
N
H
N
H
O
O
O
-
diazotace
Mannichova
kondenzace
jodace
Tyr
N
+
R
N
R NH2 CH2 O
N
H
N
H
O
O
OH
NH
R
N
H
N
H
O
O
OH
N
N
R
N
H
N
H
O
O
OH
I
I125
125
Specifita modifikačních reakcí
účastní se bílkoviny, které obvykle poskytují řadu
různých skupin - jejich srovnání dle síly nukleofilních
vlastností:
R-S- > R-SH, R-NH2 > R-NH3
+, R-COO- > R-COOH, R-O- > R-OH ≈ H-OH
úlohu hraje přítomnost náboje (protonovaná /
deprotonovaná forma) - lze ovlivnit volbou pH, ale
protože se hodnoty pKa často překrývají, tak to není
příliš spolehlivé
pro přesné cílení modifikace na konkrétní skupiny je
zapotřebí zvolit specificky reagující činidlo
Cílené zablokování postranních skupin
P-NH2
(Lys)
P-SH
(Cys)
P--
(His)
R-N=C=S
O2N
NO2
O2
N
HO3
S
R-CH=Oisothiocyanát
(adice - thiomočovina)
trinitrobenzensulfonová
kyselina (subst.)
aldehyd
(+ redukce borohydridem)
Cl-Hg COOH N OO
R
S S NO2
O2
N
HOOC COOH
p-chlormerkuri
benzoová k.
maleimidy, např. NEM
(adice)
5,5'-dithio-bis(2-nitrobenzoová k.)
DTNB, Ellmanovo činidlo
(substituce)
NH
N
O
CO
CO
OC2H5
OC2H5
diethylpyrokarbonát (alkoxylace)
Cílená modifikace postranních skupin
P-OH
(Ser)
P--
(Tyr)
P--
(Arg)
P
O
F
O
O
CH(CH3
)2
CH(CH3
)2
C
H2
S F
O
O
diisopropylfluorfosfát
DFP (fosforylace)
fenylmethylsulfonylfluorid
PMSF (sulfonylace)
OH
C(NO2
)4
tetranitromethan
(nitrace)
N-acetylimidazol
NAI (acetylace)N
N
CO-CH3
NH
NH2
+
NH2
O
O
CH3
CH3
O
O
H
2,3-butandion
(kondenzace) fenylglyoxal (kondenzace)