Modifikace nukleových kyselin
nukleové kyseliny (DNA a RNA) jsou tvořeny z
jednotlivých nukleotidů spojených fosfodiesterovou
vazbou mezi sacharidovými kruhy
základní složkou jsou báze
– pyrimidinové (C cytosin, T thymin a U uracil)
– purinové (A adenin, G guanin)
spojením s molekulou sacharidu (ribosa nebo
deoxyribosa) poskytují nukleosidy (např. Ade adenosin
nebo dAde deoxyadenosin)
připojením fosfátu vznikají nukleotidy (např. AMP
adenosin monofosfát).
N
N N
H
N
7
8
9
1
2
3
4
5
6
N
N
1
2
3
4
5
6
Nukleové kyseliny
modifikační reakce mohou typicky
směřovat na molekuly bází
méně časté je využití sacharidové
části (2' hydroxyl u RNA)
velmi běžné je připojení dalších
funkčních molekul na konec řetězce
nukleové kyseliny
P O
O
O
N
N N
N
NH2
O
OH O
PO O
O
O
-
-
5' konec
3' konec
2' hydroxyl schází
u DNA (deoxy …)
Pyrimidinové base
části jejich molekul mohou být cílem ataku elektrofilních
(červeně) i nukleofilních (modře, pozice 4 a 6) činidel
v molekule uracilu nukleofilní substituce v C6 pozici
následně aktivuje C5 pozici pro elektrofilní atak:
NH
N
O
O
N
NO
NH2
N
N
O
O
CH3
U C T
NH
N
O
O X
NH
N
O
O
NH
N
O
O
Y
X
NH
N
O
O
Y
-
XY+
-HX
HN
NO
NH2
HN
NO
NH2
SO3
HSO3
-
HN
NO
NH
SO3
R
NH
NO SO3
O
R NH2
NH4
+
NH4
+
HN
NO
NH
R
NH
NO
O
HSO3
-
HSO3
+
+
-
+
-
+
-
H2O
+
+
Reakce cytosinu s hydrogensiřičitanem
vzniká sulfonovaný derivát,
v přítomnosti nukleofilu (amin)
dojde k transaminaci - možnost
zavést funkční skupiny
v slabě kyselém prostředí pak dojde k hydrolyse
aminoskupiny na C4 a následně po alkalizaci se odštěpí
hydrogensiřičitan - proběhla konverze na uracil
Biotinylace cytosinu
reaktivní adukt cytosinu s hydrogensiřičitanem se
v reakci s biotin-hydrazidem přemění na žádaný derivát
O
O
O
SNO
HN
NH2
N N
O
SO
NH2
N
H
O
N N
S
O
N
H
NO
HN
R
NH4
+
HSO3
-
+
-
R
HN
+
Cytosin - halogenace
možností vpravení vhodné reaktivní aminoskupiny
v postranním řetězci je halogenační reakce
vodný roztok jodu nebo bromu, případně pomocí
N-bromosukcinimidu
poslední krok je substituce diaminem:
N
NO
NH2
N
O
Br
O
N
NO
NH2
Br
N
NO
NH2
N
H
(CH2
)6
H2
N(CH2
)6
NH2
NH2
Purinové base
pozic pro nukleofilní
i elektrofilní ataky je
celá řada
halogenační reakce s N-bromosukcinimidem poskytuje
brom v pozici C-8 jak v případě adeninu, tak guaninu
reakce s kyselinou jodoctovou:
NH2
N
N
N
N
N N
N
NH
O
NH2
A G
N N
N
N
N
H
O
O
N N
N
N
N
O
O
H
NN
N
N
N
OO
N
N
N
NNO
O
O
H
H
H
H
R
2
+ I
-
R
+
2
R
-
R
2
pomalá
alkylace v slabě
kyselém prostředí
zvýšená teplota, alk. prostředí
Fischer-Dimrothův přesmyk
karboxyskupina na N6
Modifikace DNA
in vitro enzymová synthesa DNA polymerasou pomocí
komplementárního templátového vlákna
do reakční směsi se přidají pozměněné nukleotidy,
schopné párování, které tak do struktury DNA vnesou
žádané funkční skupiny
je-li vyžadováno správné párování, tak stupeň substituce
max. 30-40 modifikovaných míst/1000 bází
– derivatizace na cukr-fosfátové kostře nebo na koncích vlákna
párování nevadí
pozměněné base - deriváty s biotinem, nebo methylenový
řetězec s volnou aminoskupinou
– menší modifikace - není ovlivněna rychlost připojování bází
mnohočetné včlenění značených bazí může být
nevýhodné pro hybridizační reakci
Derivatizované base
biotin-11-dUTP
biotin-14-dATP
8-aminohexyl-dATP
N
O
S
O
N
O
N
O
O
H
H
OOO
OOO
POPOPO
OOO
OOO
POPOPO
O
OH
O
OH
OOO
OOO
POPOPO
O
OH
N
N
N
N
H
H
O
S
O
N
O
N
N
N
N
N
NH
HN
HN
5
- - -
OH
- - -
OH
- - -
OH
NH
HN
6
NH
NH
NH
NH
2
2
8
Metoda náhodných primerů
směs náhodných hexanukleotidových úseků sloužících
jako 3’-OH primery s templátovou DNA
modifikované nukleotidy se připojují pomocí DNA
polymerasy I
– pouze Klenowův fragment, který postrádá 5’-3’ exonukleasovou
aktivitu přítomnou v nativním enzymu z E. coli
výsledkem je náhodné včlenění značených bazí
Nick-translace
nick-translační značení účinkuje na dvojitou šroubovici
směs pankreatické deoxyribonukleasy I (DNasa I) a DNA
polymerasy I
v přítomnosti Mg2+ DNasa (v limitujícím množství) provádí
hydrolýzu pouze v jednom vlákně
vzniklé štěpy jsou však ihned zaplněny přítomnými
modifikovanými i nativními nukletidovými monomery za
katalysy DNA polymerasy
výsledkem je modifikace původní molekuly dsDNA
nejúčinnější metodou je provést značení DNA v průběhu
polymerasové řetězové reakce (PCR)
– současně se samozřejmě zmnoží množství původní DNA
buď se do reakční směsi prostě přidají značené
nukleotidy a jsou náhodně vestavovány do nově
syntetizovaných řetězců
nebo je možné použít pouze značené primery (např.
biotinylované)
Značení v průběhu PCR
Koncové značení
cílem je zamezit modifikaci uprostřed řetězce DNA
využití terminální transferasy - přidává nukleotidy ke
3’-OH koncům DNA bez potřeby templátového vlákna
např. také pro radioaktivní značení
Sekvenčně-specifické značení
rozpoznání cílového místa, vytvoření kovalentní vazby se
značkou
DNA methyltransferasy (MTasy) - přenáší methylovou
skupinu z S-adenosyl-L-methioninu (AdoMet) na A nebo
C zbytky
methylová skupina se nahradí něčím "užitečnějším" aziridinový
reaktivní zbytek pro vytvoření kovalentní
vazby s DNA v průběhu enzymové methylace, biotinová
skupina připojena v postranní části
značení DNA v předem určeném místě, daném polohou
cílové sekvence MTasy
N
N
N
N
O
OO
NH2
5'-------T C G - ---3'
3'-------A G C ......... T .... ---5'
N
N
N
N
O
OO
NH
CH3
N
N
N
N
O
OH OH
NH2
S
+
CH3
NH2
COOH
N
+
N
N N
N
O
OH OH
NH2
H
NH(CH2
)4
NH-CO-(CH2
)4 S
NHNH
O
HH
N
N N
N
O
OH OH
NH2
NH(CH2)4NH-CO-(CH2)4
N
N
N
N
O
OO
NH
N
H
S
NHNH
O
HH
5'-------T C G - ---3'
3'-------A G C ......... T .... ---5'
5'-------T C G - ---3'
3'-------A G C ......... T .... ---5'
M-TaqI
AdoMet
Aziridin-Ado-Biotin
Značení pomocí methyltransferasy
cílová sekvence 5'-TCGA-3'
Fosforamidová metoda
aktivace konc. fosfátu EDC vede s aminy k fosforamidům
reakci lze provést také s imidazolem, čímž vznikne
fosforimidazolidový produkt
– má ve vodném prostředí prodlouženou životnost a reaguje velmi
dobře s aminy - vyšší výtěžky fosforamidové reakce
H
NCH3
N
N
NN
CH3
CH3
H
H
H
NN
O
NCH3
CH3
CH3
N
N
O
NNN
CH3
O
CH3
P
O
OH
CH3
O
O
P
O
OH
O
O
P OH
-
+
C
+
+
oligonukleotid
s 5’-Pi
EDC
imidazol
fosforimidazolid
H
H H
aktivní EDC
fosfodiester
N
H
N
N
N
O
O
P OH
NH2
NH2
O
O
P
NH
OH O
O
P
NH
OH
S
S
NH2
NH2
NH2
S
S
NH2
O
O
P
NH
OH
SH
NH2
SH
vnesení amino nebo thioskupiny na konec DNA
diamin
DTT,
redukce
cystamin
Fosforimidazolid
Modifikace RNA
molekuly RNA obvykle jednořetězcové, vnitřní vzájemně
komplementární krátké sekvence
párování vede ke vzniku různých třídimenzionálních
struktur (helikální úseky, smyčky, vlásenky, G-kvartety...)
další změnou oproti DNA je existence diolového uskupení
v molekule ribosy - lze specificky oxidovat jodistanem, na
reaktivní aldehydové skupiny
vhodně orientované struktury RNA (i DNA) mohou
vytvářet vazebná místa, komplementární k jiným
biomolekulám - APTAMERY
– možnost náhrady protilátek
– tyto vazebné struktury, tzv. aptamery, lze vytvářet uměle
kombinatorickými postupy (SELEX, systematic evolution of
ligands by exponential enrichment)
– nejznámější je aptamer vážící thrombin
Modifikace sacharidů
volné existují v monomerní, oligo- a polymerní formě
vázané ve formě konjugátů s proteiny (glykoproteiny)
nebo lipidy (glykolipidy)
reaktivní skupiny - hydroxyly a oxoskupiny
– monosacharidy - dle polohy oxo skupiny aldosy a ketosy
– ve vodném prostředí přítomna zejména hemiacetalová forma
– glukosa jako glukopyranosa a fruktosa jako fruktofuranosa
– následně jsou přirozené oxoskupiny jsou méně reaktivní
k modifikaci se využívají postranní glykosidické skupiny
pokrývající povrch glykoproteinů
velký význam má derivatizace polysacharidových matric
sloužících jako stacionární fáze (separace, sensory, …)
O OH
OH
OHOH
OH
OOH
OH
OHOH
OH
Aktivace bromkyanem BrCN
klasická metoda aktivace polysacharidových materiálů
nevýhodou je vysoká jedovatost činidla
výhodou dobré výtěžky reakce
reakce probíhá v alkalickém prostředí, rozsah je úměrný
koncentraci činidla
meziprodukt imidokarbonát reaguje s aminoskupinou
biomolekuly B za vzniku různých derivátů:
OH
OH
CN
OH
C NH
O
O
H2N B
C N
O
O
B
OH
O C
NH
NH B
OH
O C
O
NH B
+ +
derivát N-substituovaný N-subst. karbamát
isomočoviny imidokarbonát
Aktivace bromkyanem
BrCN
Aktivace -OH v sacharidech
epoxyskupiny (bisoxiran, epichlorhydrin)
bromkyanová metoda
divinylsulfon
sulfonylchloridy
– tosylchlorid = p-toluensulfonylchlorid
– tresylchlorid = 2,2,2-trifluorethansulfonylchlorid
| OH
CH2
=CH-SO2
-CH=CH2
| O-CH2-CH2-SO2-CH=CH2
R-NH2
| O-CH2-CH2-SO2-CH2-CH2-NH-R
(R-OH, R-SH)
| OH | O-SO2
-CH2
CF3
R-NH2
| NH-R
Cl-SO2
-CH2
CF3
HO-SO2
-CH2
CF3
Cl-SO2 CH3 tosylchlorid
tresylchlorid
Oxidace jodistanem
jodistan (periodate) za mírných podmínek a v neutrálním
pH účinkuje na diolová uskupení v molekule sacharidů
vhodné i pro postranní sacharidové složky glykoproteinů
– postup je např. často využíván k oxidaci peroxidasy při výrobě
enzymových imunokonjugátů
získají se reaktivní aldehydové skupiny
O
OH
OH
OH
O
O
*n O
O O
OH
O
O
*n
NaIO4