Reaktivní skupiny
obecný pohled na reaktivní skupiny bez vazby na
konkrétní typ biomolekuly - univerzálně použitelné
metody
možnosti konverze existujících skupin
reakce typické pro vybrané skupiny
Vnášení reaktivních skupin
přirozené reaktivní skupiny biomolekuly nemusí
dostačovat pro zamýšlené syntetické postupy
konjugace bílkovin - často heterobifunkční činidla, která
vyžadují různé koncové skupiny v obou partnerech
jeden z reakčních partnerů předem upraven zavedením
potřebné skupiny
Thiolace (zavedení -SH)
volná -SH skupina je pro konjugace velmi oblíbená
v bílkovinách obvykle zřídka, nebo blokováno ve formě
disulfidických -S-S- můstků
stabilita -SH špatná - oxidace (inertní atmosféra,
chelatace iontů kovů - katalyzují oxidaci)
methyl-4-merkaptobutyrimidát
(Trautův reagent)
cykl. na 2-iminothiolan
(imidothioester)
v mírně alk. podmínkách reaguje s primárními aminy
alternativní methyl-3-merkaptopropionimidát poskytne
kratší můstkovou část
O
SHCH3
NH2
SH
NH2
N
H
R
R NH2
S
NH2
CH3OH
+
+
+
2-iminothiolan
-NH2 na -SH pomocí SATA
N-sukcinimidyl-S-acetylthioacetát (SATA) působí konverzi
aminoskupiny na thioskupinu
odštěpí se N-hydroxysukcinimid, produkt obsahuje chráněnou
sulfhydrylovou skupinu (lze uchovávat)
deprotekce nadbytkem hydroxylaminu
není třeba redukce - neovlivní se tedy nativní -SH skupiny
analog N-sukcinimidyl-S-acetylthiopropionát (SATP) poskytne delší
můstek
N O
O
S
O
CH3
O
O
R NH2
N OH
O
O
O
S
O
CH3
N
H
R
NH2OH
O
SHN
H
R
OH N
H
O
CH3
SATA
-NH2 na -SH: citiolon a SAMSA
citiolon, N-acetylhomocysteinthiolakton resp. 2-acetamido-
4-merkaptobutyrát reaguje jako Trautův reagent, reakci urychluje Ag+
reaktivní cyklický anhydrid - anhydrid S-acetylmerkaptojantarové
kyseliny (SAMSA)
uvolnění -SH skupiny deprotekcí s hydroxylaminem
R NH2
S
O
N
H
O
CH3 R N
H
O
NH
SH
CH3
O
O
O
O
S CH3
O
R N
H
SH
O
COOH
citiolon
SAMSA
>C=O na -SH
konverze oxoskupiny (aldehyd / keton) je možná hydrazidem
2-acetamido-4-merkaptomáselné kyseliny (AMBH)
např. pro jodistanem oxidované sacharidy či glykoproteiny
R
O
H
CH3
O NH
SH
O
N
H
NH2 CH3
O NH
SH
O
N
H
N R
AMBH
-COOH nebo -O-PO3
2- na -SH
cystamin v přítomnosti karbodiimidu (EDC)
vznikne amidová resp. fosfamidová vazba
vnesené -S-S- disulfidové uzkupení je možné přímo spojit
s molekulou obsahující volnou -SH skupinu (uvolní se
cysteamin)
nebo lze získat volnou -SH skupinu redukcí, např. DTT
cysteamin = 2-aminoethanethiol / 2-merkaptoethylamin /
dekarboxycystein / thioethanolamin
cystein
cystin
NH2
S S
NH2
-S-S- na -SH
speciální případ, k rozštěpení dojde redukcí, činidel je
celá řada, např. s volnou -SH skupinou:
– dithiothreitol (DTT, Clelandovo činidlo), 2-merkaptoethanol,
2-merkaptoethylamin
imobilizované formy činidel - není třeba provádět
separaci nadbytečného činidla
odobný výsledek poskytuje i TCEP,
tris(karboxyethyl)fosfin
nejjednodušší redukce
pomocí borohydridu NaBH4
má význam i pro štěpení
nativních S-S můstků
v bílkovinách
P
O
OHOH
O
O OH
TCEP
Karboxyskupina místo -NH2
užívají se cyklické anhydridy dikarboxylových kyselin
reagují s volnou aminoskupinou - otevírá se kruh a vzniká amid
může reagovat i hydroxyl serinu a threoninu, fenolátový anion dává
nestabilní produkt
dočasné blokování aminoskupiny - anhydrid kyseliny citrakonové
– poskytuje amidovou vazbu při pH 8, snadno hydrolyzuje při pH 3 až 4 za
opětovného uvolnění aminoskupiny
možnosti: a sukcinanhydrid, b glutaranhydrid, c maleinanhydrid,
d anhydrid kyseliny citrakonové
změna aminoskupiny
za karboxyskupinu
mění
náboj a pI dané
biomolekuly
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
OCH3
O
O
O
R NH2
R N
H
OH
O
O
+
a b c d
Halogenoctové kyseliny
kyselina jodoctová:
– může reagovat s aminoskupinami lyzinu nebo imidazolového
kruhu histidinu, se sulfhydrylovou skupinou cysteinu i
s methylthioskupinou methioninu
– reakce závisí na pH prostředí
další α-halogenoctové kyseliny - podobně
– reaktivita derivátů klesá v řadě I > Br > Cl > F
– z druhé strany v řadě sulfhydryl > imidazolyl > thioether > amin
– za ekvimolárních poměrů a v mírně alkalickém prostředí jodacetát
reaguje exkluzivně s cysteinovým zbytkem
kyselina chloroctová slouží k derivatizaci hydroxylových
skupin v polysacharidových matricích (dextran)
– reakce probíhá v alkalickém pH:
R OH Cl
O
O R
O
O
O
-HCl
+
nejběžněji konverze karboxylu pomocí diaminů v přítomnosti
karbodiimidu (EDC) - vzniká amidová vazba a druhá koncová
aminoskupina zůstává volně k dispozici
konverze karboxyskupiny na aminoskupiny výrazně ovlivní celkový
náboj biomolekuly a také její pI hodnotu
– často je to zamýšleným účelem modifikace
Vnesení aminoskupiny
NH2
NH2
NH2
N
H
NH2
NH2
O
O
NH2
NH2
NH2
ethylendiamin (krátký můstek)
hexamethylendiamin
(1,6-diaminohexan)
3,3’-iminobis(propylamin)
Jeffamin EDR-148 (hydrofilní)
lze pomocí aminoethyl-8,N-(jodoethyl)trifluoracetamidu:
– deblokace v druhém kroku je spontánní
ethylenimin v alkalickém prostředí - reakce převážně pouze s Cys
– činidlo může vznikat přímo v alk. směsi cyklizací z 2-bromoethylaminu
-SH na -NH2
I
N
H
O
F
F
F
R SH F
F
F
O
OH
R
S
NH2
H-I
N
H
F
F
F
O
S
R
R S
N
H
R
S
NH2+
Aldehyd na -NH2
redukční aminace pomocí amoniaku nebo diaminu
v přítomnosti kyanoborohydridu sodného NaCNBH3
– vzniká Schiffova báze, pak stabilizována redukcí
– lze takto připravit např. aminovaný dextran po předcházející
oxidaci jodistanem
– nedochází k redukci aldehydické skupiny
R H
O R
NH
R
NH2
NH2
NH2
R
N
NH2
R
NH
NH2
NaCNBH3
NH3
-NH2 z tyrosinu
nitrace pomocí tetranitromethanu
nitroskupina se zredukuje na aminoskupinu
lze výhodně aktivovat kyselinou dusitou na diazoniovou
sůl pro kopulační reakce
R OH
C(NO2
)4
R OH
NO2
R OH
NH2
Na2
S2
O4
Aminoskupina na aldehyd
sukcinimidyl-p-formylbenzoová kyselina (SFB)
sukcinimidyl-p-formylfenoxyoctová kyselina (SFPA)
– při reakci vzniká amidová vazba, v případě proteinů výrazně
narůstá jejich hydrofobicita
N
O
O
O
O O
H N
O
O
O
O O
O
H
SFB SFPA
H
O
H
O
H
O
H
N
H
H
O
OOH
NHH
O
RH
O
OHOH
H
O
HH
OO
H
H
HN
N
O
N
O OO HH
H
H
N
HH
OO
N
O
N
N
HH
O O
H
H
O
N
N
R NH2
NaCNBH3
R
2
3
+
+
+
(CH )
2 3
+
GA
A
C
D
E
Glutaraldehyd
kyanoborohydrid neredukuje
aldehydy, borohydrid ano!
B
Schiffova báze
-C=N- je redukována na
stabilnější formu (A)
reagují i oligomerní adukty
glutaraldehydu (E), probíhá
adice aminoskupiny na
dvojnou vazbu (B)
kondenzace na cykl. produkt (C),
pak reakce s lyzinovými
zbytky - zesítění
tvorba smíšených konjugátů,
málo definované a často
vysokomolekulární
cyklická hemiacetalová forma se
vyskytuje zejména v kyselém
prostředí, může dále
polymerovat (D)
α,β nenasycený aldehydový
polymer (E) vzniká při
zásaditém pH