spojení dvou biomolekul - vyžaduje činidla, která dokáží
spojit přímo dvě různé nebo shodné povrchové skupiny
na obou různých molekulách
přímé spojení biomolekul bez přítomnosti nějaké
můstkové spojovací struktury - zero length crosslinkers
karbodiimidy, karbonyldiimidazol,
aldehyd + aminoskupina
včlení se spojovací můstek požadované definované délky
tzv. linker – bifunkční činidla
Biokonjugační reakce
Homobifunkční síťující činidla
symetrická činidla, co mají dvě shodné reaktivní skupiny
činidlo se spojí jedním koncem s biomolekuly A
druhý konec se spojí s biomolekulou B
vznikne A-B konjugát (to je žádaný produkt)
– nežádoucí produkty: A-A, B-B, oligomerní AxBy, prokřížení skupin v rámci
jedné molekuly A (nebo B)
průběh je málo definovaný
provádění reakce
– jednokrokově – vše se smíchá dohromady – pak vznikají často
oligomerní, případně i precipitující produkty
– nejprve biomolekulu A smíchat s konjugačním činidlem a nechat
proběhnout její modifikaci, odstranit nadbytek činidla (např. dialýzou) a
pak přidat druhou biomolekulu B
komplikace - nestabilita reaktivních skupin ve vodném prostředí
– mimo konjugaci probíhá i hydrolýza
přes uváděné nedostatky se běžně a úspěšně využívají
O
N
O
O
O
S
S
O
O
O
N
O
N
H
O
S
S
O
N
H
R
R'
Homobifunkční NHS estery
karboxylové skupiny aktivované N-hydroxysukcinimidovou skupinou
(NHS) (nebo sulfo-NHS) - velmi reaktivní vůči nukleofilním -NH2
obecná struktura NHS-z-NHS, z značí střední část = spojovací můstek:
dithiobis(sukcinimidylpropionát) (DSP nebo DTSP), Lomantovo
činidlo, z = 1,2 nm, disulfidové uskupení může být rozštěpeno pomocí
DTT nebo merkaptoethanolu
– sulfonovaná varianta:
3,3’-dithiobis(sulfosukcinimidyl
propionát) (DTSSP)
– rozpustný ve vodě
DSP a vznikající produkt:
N N
O Oz
OO
O O
OO
NH2RR' NH2
z
OO
N
H
R
N
H
R'
NHS NHS
DSP
R-z-R’
Další NHS bifunkční činidla
disukcinimidylsuberát (DSS), C8 alifatický můstek, z = 1,14 nm
– existuje sulfovarianta bis(sulfosukcinimidyl)suberát (BS3)
– hydrofilní BS3 je výhodný k prokřížení (bílkovinných) komplexů na
povrchu buněk - činidlo neprochází buněčnou membránou
– kratší C5 můstek, z = 0,77 nm, poskytuje disukcinimidylglutarát (DSG)
disukcinimidyltartrát (DST) vytváří kratší můstek o délce 0,64 nm
– přítomnost dvou hydroxylů uprostřed můstku umožňuje rozštěpit spojení
použitím mírné oxidace jodistanem
nejkratší spojení vytvoří N,N’-disukcinimidylkarbonátu (DSC)
– spojením vzniká substituovaný derivát močoviny, vůči nukleofilům je
extrémně reaktivní
– nelze použít ve vodném prostředí, hydrolýzou vzniká CO2 a 2 NHS
– pro derivatizaci polyethylenglykolů - spojí hydroxy a aminoskupinu za
vzniku karbamátového uskupení
– napřed se v nevodném prostředí aktivuje PEG, ten pak může ve vodném
prostředí reagovat s proteiny (pegylace)
O
N
O
O
O
O
N
O
O
O
DSS
O
O
N
O
O
OH
OH
O
O
N
O
O
DST
N
OO
O
O O
O
O
N
DSC
Homobifunkční
imidoestery
imidoesterová (jinak imidátová) skupina ve vodném prostředí reaguje
s aminoskupinou za vzniku imidoamidu (amidinu)
– činidlo i produkt jsou ve vodném prostředí protonovány na imidovém
dusíku, tedy dobře rozpustné
amidinová vazba je stabilní v mírně kyselém prostředí, při vyšším pH
může hydrolyzovat
činidla jsou na bázi imidoderivátů dikarboxylových kyselin:
– dimethyl adipimidát (DMA, C6 z = 0,86 nm)
– dimethyl pimelimidát (DMP, C7 z = 0,92 nm)
– dimethyl suberimidát (DMS, C8 z = 1,1 nm)
DMP stabilizuje komplexy protilátek s proteinem A
dimethyl-3,3’-dithiobispropionimidát (DTBP) obsahuje uprostřed
disulfidové spojení (z = 1,19 nm)
– může být případně rozštěpen DTT
O Oz
NHNH
CH3
CH3
NH2RR' NH2
z
NHNH
N
H
R
N
H
R'
CH3OH CH3OH
Homobifunkční činidla spojující -SH
skupiny
dvě skupiny podle stability vznikajícího spojení:
– disulfidová vazba - spojení lze snadno rozrušit pomocí oxidačních činidel
– thioetherová vazba - spojení trvanlivé
1,4 di-[3’-(2-pyridyldithio)-propionamido] butan (DPDPB)
– reverzibilní spojení biomolekul, z = 1,6 nm, 14 atom. řetězec
– odštěpovaný pyridin-2-thion lze sledovat při 343 nm
– pro vytváření konjugátů redukovaných molekul protilátek s enzymy
NS
S
O
N
N
O
S
SN
NS
S
S
O
N
N
O
S
S
H
H
H
H
R SH SH R'
NS
R
R'
DPDPB
Thioetherové spojení
bis(maleimido)hexan (BMH) reaguje v neutrálním prostředí za vzniku
stabilního spojení (z = 1,6 nm)
dochází k adici sulfhydrylových skupin na dvojné vazby v cyklu a
vznikají tak stabilní thioetherové vazby
– mechanismus vychází z použití N-ethylmaleimidu (NEM) jako inhibitoru
cíleného na SH skupinu
R SH SH R'
N
N
O
O
O
O
N
N
O
O
O
O
S
R'
S
R
BMH
Homobifunkční aldehydy
dříve zmíněný glutaraldehyd
formaldehyd - nejkratší spojovací můstek, reaguje prostřednictvím
Mannichových kondenzací (A)
– spojuje sloučeniny s aktivovanými vodíky (např. na jádře fenolu v ortho a
para polohách) s formaldehydem a dále s aminoskupinou
přes imoniový kationt s aminoskupinou (B)
– spontánně vznikne reaktivní imoniový kation, který zreaguje s další
aminoskupinou a dojde ke spojení přes C1 můstek
OH
R
O
H H
R' NH2
OH
R
N
H
R'
R' NH2
R NH2
O
H H
R NH2
CH2
OH R NH CH2 R
N
H
N
H
R'
+
+ +
+
A
B
- H2O
Bis-epoxidové sloučeniny
jsou schopné spojovat biomolekuly obsahující nukleofilní skupiny
včetně aminů, hydroxylů a sulfhydrylů
dochází k otevření tříčlenného epoxidového kruhu (A)
reakce probíhají v mírně alkalickém prostředí
k aktivaci matric nesoucích hydroxylové skupiny (polysacharidy)
nejznámějším činidlem je 1,4-butandiol diglycidylether (B)
OHR'
H
N
OH
R
R'
NH2R'
S
OH
R
R'
O
OH
R'
OR
R' SH
O
OO
O
R
A
B
bis[β-(4-azidosalicylamido)ethyl]disulfid (BASED) je aktivován
ozářením UV světlem (270 nm)
uvolní se molekula dusíku a vznikne velmi reaktivní a nestálý
arylnitren - rychle se přemění za rozšíření aromatického kruhu na
dehydroazepin, ten následně reaguje s aminoskupinou biomolekuly
derivát vzniklý po konjugaci obsahuje na 7-členném kruhu fenolický
hydroxyl, který ho aktivuje např. pro elektrofilní značení
radioaktivním jodem
Fotoreaktivní crosslinkery
N
OO
N
S
S
N
OO
N
N
N
N
N
H
H
H
H
N
OH
N
OH
N
H
N
OH
RN2
R NH2
UV
+
-
+
-
BASED
další možnosti…
aktivované vodíky na aromatickém jádře - diazoniové deriváty
úspěšné spojení se projeví oranžovým nebo ještě tmavším
zbarvením vzniklých konjugátů -charakteristické pro diazosloučeniny
diazoniové sloučeniny se obvykle generují z příslušných diaminů o-tolidin
a benzidin (p-diaminodifenyl) - reakcí s NaNO2 v slabě
kyselém prostředí v chlazené reakční směsi
vzniklá diazoniová sůl reaguje ochotně se zbytky tyrosinu a histidinu
difluorbenzenové deriváty - atomy fluoru na vhodně aktivovaném
aromatickém jádře (např. pomocí nitroskupin) reagují substitučně s
aminoskupinami
– mohou ale reagovat i jiné nukleofily
dostupná činidla jsou 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen (DFDNB) nebo
4,4’-difluoro-3,3’-dinitrodifenylsulfon (DFDNPS)
Heterobifunkční konjugační činidla
obsahují dvě různé reaktivní skupiny - spojí se s různými funkčními
skupinami konjugovaných biomolekul
použití obvykle probíhá ve dvou nebo třech krocích
– výrazně se omezuje množství oligomerních nebo polymerních produktů
– činidlo je smícháno s první biomolekulou, kterou derivatizuje svou
reaktivnější skupinou
– nadbytek činidla je odstraněn (dialýza, gelová filtrace)
– druhá reaktivní skupina je obvykle stabilnější a následně reaguje
s druhou biomolekulou
variabilita reaktivních skupin - lze lépe vybrat cílové místo
– menší narušení důležitých aktivních míst (epitop antigenu, vazebné místo
protilátky, aktivní místo enzymu …)
důležitá je i spojovací můstková část – linker
– může být samozřejmě pasivní
– může být cílem dalších reakcí, zejména se jedná o rozštěpení
– význam pro zachování bioaktivity konjugátu má délka a polarita linkeru
Spojení -SH a -NH2
nejčastější vzhledem k běžné dostupnosti cílových skupin
v bílkovinách
pro aminoskupinu je v činidle nejčastěji přítomna NHS skupina
v kombinaci s několika možnostmi pro SH skupiny
N-sukcinimidyl-3-(2-pyridylditio)propionát (SPDP) poskytuje
amidovou vazbu s biomolekulou nesoucí -NH2 a disulfidovou vazbu
s biomolekulou nesoucí -SH:
pro SPDP je z = 0,68 nm
s delším řetězcem (z = 1,12 nm) pod názvem LC-SPDP (long-chain)
rozpustnější se sulfonovanou NHS skupinou – Sulfo-LC-SPDP
N
S
S
N
O
O
O
O
S
SO
N
H
R
R'
R NH2 R' SH
N
S
SO
N
N
SNHS
R
SPDP
sukcinimidyloxykarbonyl-α-methyl-α-(2-pyridyldithio)toluen (SMPT)
– můstek tvořený benzenovým jádrem a methylovou skupinou chránící
disulfidovou skupinu (sterická zábrana ataku) zlepšuje trvanlivost
konjugátů
– analog Sulfo-LC-SMPT
– spojení biomolekul lze rozebrat
v místě -S-S- vazby redukcí (např. DTT)
„nerozebíratelné“ spoje používají pro SH skupinu maleimidovou nebo
jodacetátovou reaktivní část
– sukcinimidyl-4-(N-maleiimidomethyl)cyklohexan-karboxylát (SMCC)
z = 1,16 nm)
– další alternativní činidla: m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysukcinimidoester
(MBS, 0,99 nm), sukcinimidyl-4-(p-maleimidofenyl)butyrát (SMPB, 1,45 nm)
a N-(γ-maleimidobutyryloxy)-sukcinimidester (GMBS, 1,02 nm)
N
SSON
OO
O
CH3
SMPT
O
N
O
OO
O
ON
SO
O
N
O
N
H
R'
R
R NH2 R' SH
NHS
SMCC
N-sukcinimidyl(4-jodoacetyl)-aminobenzoátem (SIAB, 1,06 nm)
alternativní činidla
– sukcinimidyl-6-[(jodoacetyl)-amino]hexanoát (SIAX)
– jeho varianta s můstkem prodlouženým o aminohexanovou kyselinu, tj.
sukcinimidyl-6-[6-(((jodoacetyl)amino)-hexanoyl)amino]hexanoát (SIAXX)
– sukcinimidyl-4-(((jodoacetyl)amino)methyl)cyklohexan-1-karboxylát
(SIAC) s analogem SIACX mají objemnější spojovací můstek
p-nitrofenyljodo-acetát (NPIA) vůči –NH2 reaguje podobně jako NHS,
vzniká také amidová vazba
– výhodou může být krátké spojení mezi biomolekulami
N
N
H
OO
O
OO
I
R'
S
O
N
O
N
H
R
R NH2
R' SH
NHS HI
SIAB
R NH2
R' SH
O
I
O
O2N
nitrofenol
N
H
IR
O
N
H
SR
O
R'
NPIA HI
N
O
N
H
NH2
O
O
N
O
N
H
NH2
O
O
S
R
R SH
R'
O
H
N
O
N
H
N
O
O
S
R
R'
N
S
S
N
H
O
NH2
Spojení >C=O a -SH
pro konjugaci zejména sacharidů (a glykoproteinů)
– oxoskupina se snadno generuje mírnou oxidací jodistanem
– reaguje s ní zejména hydrazidová skupina
– z druhé strany se účastní skupiny popsané již dříve
hydrazid kyseliny 4-(4-N-maleimidofenyl)-máselné (MPBH), z = 1,79 nm
– je vhodné provést reakci nejprve s SH skupinou, purifikovat produkt a následně
připojit aldehydovou skupinu.
rozebíratelné spojení se získá 3-(2-pyridyldithio)-propionylhydrazidem (PDPH)
MPBH
PDPH
Amino- a fotoreaktivní konjugační činidla
jedna část činidel je aktivována světlem - arylazidy, fluorované aryl
azidy, benzofenony, některé diazosloučeniny a diazirinové deriváty
– první konjugační reakce napojí činidlo na biomolekulu (pracovat ve tmě)
– odstraní se nadbytek činidla a navázaná fotoreaktivní skupina pak po
osvětlení reaguje s partnerskou biomolekulou
N
N
N
N
N
N
H
N
R
N2
R NH2
UV
R NH2
N
H
N
R
R H
R H
R
N
R
N
H
NH
R
N
R
+
-
arylazid
nitren
dehydro
azepin
N-hydroxysukcinimidyl-4-azidosalicylát (NHS-ASA, 0,80 nm)
– derivatizuje aminoskupiny obvyklým způsobem – vznik amidové vazby
– k dispozici jsou i varianty Sulfo-NHS-ASA a Sulfo-NHS-LC-ASA (1,8 nm)
fenolický hydroxyl aktivuje benzenové jádro pro značení
radioaktivním jodem, to lze provést před fotoreakcí
– k dispozici jsou varianty bez hydroxylu na benzenovém jádře:
N-hydroxysukcinimidyl-4-azidobenzoát (HSAB, 0,90 nm)
případně s nitroskupinou N-5-azido-2-nitrobenzoyloxysukcinimid
(ANB-NOS, 0,77 nm)
štěpitelné konjugáty poskytuje sulfosukcinimidyl-
2-(p-azidosalicylamido)ethyl-1,3’-dithiopropionát (SASD, 1,89 nm)
linker může být alifatický řetězec u N-sukcinimidyl-6-(4’-azido-
2’-nitrofenylamino)hexanoátu (SANPAH, 1,82 nm)
– nitroskupina podporuje fotoaktivaci již nad 320 nm
N
N
NO
O
N
O
O
O
H
+
-
NHS-ASA
sulfosukcinimidyl-2-(7-azido-4-methylkumarin-3-acetamid)ethyl-
1,3’-dithiopropionát (SAED, 2,25 nm)
– vzniklý konjugát obsahuje fluoreskující uskupení – derivát kumarinu
– lze tak pohodlně sledovat pohyb konjugátu
– fluorescence se přitom iniciuje až po fotolytické reakci
podobně se chová sulfosukcinimidyl-7-azido-4-methylkumarin-
3-acetát (Sulfo-SAMCA, 1,28 nm)
O
N
SO3
H
O
O
O
O
S
S
N
H
O
O
CH3
N
N
N
OO
CH3
N
H
R
R H
N2
+
-
SAED
alternativní fotolytickou skupinou je diazopyruvátové uskupení
– poskytuje reaktivní karbenové uskupení, které se přemění Wolfovým
přesmykem (W) na ketenové uspořádání
– pak aduje nukleofilní skupinu - p-nitrofenyldiazopyruvát (pNPDP)
podobným mechanismem reaguje i p-nitrofenyl-2-diazo-
3,3,3-trifluoropropionát (PNP-DPT)
O
O
O
N N
O2N
R NH2
R' NH2
O
O
N N
N
H
Rp-nitrofenol
O
O
C
N
H
R
O
N
H
R
O
H
O
N
H
R
O
NH
R'
+ +
-
NPDP UV
- N2
W
O
N
H
O
I
O
N
H
O
S
R
C
O
N
H
O
S
R
OH
N
H
O
S
R
R'
R SH
R' H
Sulfhydrylová a fotoreaktivní konjugační činidla
kombinací předchozích skupin je 1-(p-azidosalicylamido)-
4-(jodacetamido)butan (ASIB) a N-[4-(p-azidosalicylamido)butyl]-
3’-(2’-pyridyldithio) propionamid (APDP)
jinou fotoaktivní část obsahuje benzofenon-4-jodacetamid
– výhoda benzofenonu - možnost opakovaného průběhu fotoaktivace i po
nekonjugační zpětné rekombinaci volných elektronů
– vyšší výtěžky konjugace
– alternativní SH-reaktivní část má benzofenon-4-maleimid
UV
benzofenon-4-jodacetamid
HI
Další fotokonjugace
s guanidinovou skupinou argininu může reagovat
p-azidofenylglyoxal (APG)
pro napojení fotoaktivní části na aldehydovou skupinu je
použitelný p-azidobenzoylhydrazid (ABH)
karboxyskupina může být fotoaktivována pomocí
4-(p-azidosalicylamido) butylaminu (ASBA)
– jeho volná aminoskupina se spojí s karboxylem v přítomnosti
karbodiimidu, kdy vznikne amidová vazba
N
N
N
N
H
NH
NH2
N
N
N
N
H
N
OH
OH
N
H
+
-
+
-APG
zbytek argininu
Click-konjugace – modulární syntéza
základem Huisgenova cykloadice:
za několik hodin vznikne směs 1,4- a 1,5-triazolů
Fokin a Sharpless – v přítomnosti Cu(I) se reakce zrychlí
na minuty a probíhá za normální teploty:
přitom vzniká převážně 1,4-isomer
– pokud by byl žádoucí 1,5-isomer, použije se katalýza Ru
Mechanismus
www.click-chemistry.net
(Jena Bioscience)
jsou i varianty,
které nepotřebují
Cu(I) – využití v
biologických
systémech
… další varianty
Výhody oproti klasickému postupu
reagencie cílené na –NH2 a –SH skupiny
– značení a konjugace čistých proteinů (biopolymerů), které se
následně přidají do biologického systému
– pokud se reagencie přidají do komplexního biosystému (např.
buňky), tak se označí (konjuguje …) nespecificky mnoho
biopolymerů
Click-iT značení
– reagujicí partneři vznikají z nově syntetizovaných biopolymerů
díky přidaným prekurzorům
– v přirozeném biosystému se nevyskytují
– výhodou je i malá velikost značky:
Příprava
click-reagencií
biotin-PEG3-propargylamid
– zavedení alkynové konc.
skupiny do „bioafinitních“
značek
– Cu(I) je vhodnější dodat
jako Cu(II) a zredukovat
přímo v reakční směsi
Záměna aminokyselin
vestaví se do nativních bílkovin při proteosyntéze místo
přirozené aa
Záměna sacharidových jednotek
vestavba azidové skupiny do oligo/polysacharidů a do
glykoproteinů
– acetylace umožní průchod do buněk
k dispozici pro různé biosyntetické reakce:
» A nukleové kyseliny, B proteiny, C sacharidy, D lipidy
Další click prekurzory
Průchod do buňky
pro post-translační modifikaci proteinů:
přidá se upravený (acetylovaný) prekurzor, který projde
buněčnou membránou
uvnitř se deacetyluje a zapojí se do biosyntetických
reakcí
vzniklé produkty lze následně afinitně značit, separovat,
…
www.lifetechnologies.com