Fluorescenční metody ■ široké použití v oblasti výzkumu i praktické aplikace ■ bioanalytické metody - klinická chemie (f luorogenní substráty při stanovení enzymů) - imunochemické metody (ELISA, FIA fluoresceční imunoanalýza) - genetické analýzy a DNA biočipy - monitorování prostředí (fluorecenční próby) ■ biomedicína - identifikaci a separace buněk v průtokové cytometrii - zobrazení buněčných komponent ve fluorescenční mikroskopii a analýze obrazu - konformace a dynamika buněčných systémů Fluorescence intenzita l0 zdroj světla fluorescence (kolmo na excitační paprsek) ■ fluorescence = fotoluminiscence, X T f I emise světelného kvanta při návratu l0» lf \ U elektronu z vyšší energetické hladiny, kam byl vybuzen fotoexcitací | detekto - fluorescence F se udává při určité vlnové délce - emisní x excitační spektra I - relativní vyjádření, alternativně jako \J =k<&£cl\ intenzita světelného toku na jednotkovou I- plochu ("count") - další charakteristiky: kvantový výtěžek 0, střední doba života r, polarizace P (směr kmitání el. vektoru emg. vlny) - fluorescence prakticky ihned (10~8s) po skončení excitace ustane - fosforescence trvá delší dobu, při excitaci vzniká metastabilní stav - energetické přechody - Jablonského diagram: (vznik a zánik excitovaných stavů) Fluorescence absorbce přechod Si absorbce kolize přechod mezi systémy vnejsi přechod S0, S15 ... energetické hladiny r= 1015s fluorescence 108S fosforescence 10-3-1 S neradiační přechody vibrační hladiny - Kashovo pravidlo: - před emisí dochází k relaxaci vibrační energie a vnitřní konverzi, takže fluorescenční přechod nastává z nejnižší vibrační hladiny prvního excitovaného stavu S-, - Vavilovův zákon: - kvantový výtěžek a doba trvání excitovaného stavu složitých molekul v roztoku nezávisí na vlnové délce budícího záření - obecná vlastnost fluorescence: emisní spektra jsou nezávislá na vlnové délce excitace - Zcadlová symetrie mezi absorpčním a fluorescenčním pásem: - absorpce i emise z odpovídajících si vibračních hladin mají stejnou relativní pravděpodobnost. Většina absorbujících i emitujících molekul se nachází v rovnovážném vibračním stavu, přičemž vibrační struktura základního i excitovaného stavu mají stejnou strukturu - po absorpci přechází elektron z rovnovážné vibrační hladiny stavu S0 na vyšší vibrační hladinu stavu S15 poté dochází k rychlé relaxaci na stavu S1 (v čase 10_12-10-13 s) a teprve poté následuje zářivý přechod na vyšší vibrační hladinu stavu S0 a další vibrační relaxace na rovnovážnou vibrační hladinu stavu S0 - výjimky jsou důsledkem rozdílného geometrického uspořádání atomových jader v excitovaném a základním stavu ■ Stokesův posuv - rozdíl v energiích mezi maximy absorpčního a emisního pásu Sledování a měření fluorescence ■ spektrof luorimetry - měří střední signál celého vzorku v kyvetě nebo v jamce mikrodestičky ■ fluorescenční mikroskopy - umožňují pozorovat fluorescenci dvojného trojrozměrných mikroskopických objektu ■ fluorescenční skenery (i "čtečky" mikrodestiček) - měří fluorescenci 2D makroskopických objektů (elektroforetické gely, bloty, chromatogramy) ■ průtokové cytometry - měří fluorescenci velkého množství jednotlivých buněk a umožňují identifikaci a separaci jejich subpopulací ■ měření relaxačních časů (pulzní, nebo fázový posun - frekvenčně modulované světlo) - fluorescenční korelační spektroskopie (FCS) - fluktuace intenzity F v mikroobjemu (10-151) určeném fokusovaným laserovým excitačním paprskem - rychle difundující fluorofory - fluktuace fluorescence (nedochází ke zprůměrování), její časová závislost se analyzuje pomocí autokorelační funkce (informace o kinetice, difúzi, koncentraci molekul ve vzorku) Rozdělení fluoroforů ■ vlastní (vnitřní, intrinsic) - přirozený výskyt - proteiny (Trp, Tyr, Phe), NADH, FAD, FMN, chorofyl - fykobiliproteiny, green fluorescent protein (GFP) ■ nevlastní (vnější, extrinsic) - přidávají se ke vzorkům, které samy nemají fluorescenční vlastnosti ■ fluoresceční značky (váží se kovalentně) ■ f luoresceční sondy (váží se nekovalentně) - fluorofory, jejichž kvantový výtěžek, případně i spektrální vlastnosti se výrazně mění po navázání na bílkoviny, nukleové kyseliny, membrány aj. - studium změn konformace, membránového potenciálu, polarity a viskozity prostředí ■ fluorescenční indikátory (chemické sondy) - spektrální vlastnosti nebo intenzita fluorescence jsou citlivé na přítomnost dalších látek - zjištění koncentrace Fluoresceční značky ■ klasické: organická barviva, fluorescentní bílkoviny, cheláty lanthanidů - dobře rozpustné ve vodě, snadné použití, mnoho existujících protokolů a aktivovaných forem - ale široké spektrální pásy, náchylné na fotorozklad ■ moderní - polovodičové kvantové tečky, anorganické nanočástice dopované lanthanidy, nanočástice latexu a kremičitanu s navázanými fluorofory - díky pokroku v oblasti materiálových věd Fluorescein nejčastěji používaný fluorofor - výhody: vysoká absorbce, velké 0, nízká cena - exc. lze při 488 nm Ar laserem (kofokál. mikrosk., cytometrie) fluorescein-5-isothiokyanát - FITC, 494 / 520, s -NH2 skupinou dává thiomočovinové uskupení výhodnější je NHS-f luorescein - reaguje rychleji, stabilnější produkt na -SH skupiny: 5-jodoacetamidofluorescein (5-IAF) a fluorescein-5-maleimid na aldehydové či oxoskupiny: - fluorescein-5-thiosemikarbazid, dá hydrazonovou vazbu - použitelný např. pro značení cytosinův DNA či RNA po jejich aktivaci hydrogensiřičitanem na sacharidové zbytky: ' ' NHS-fluorescein - fluorescein-dichlorotriazin (DTAF), i na jine biomolekul s volnými alifatickými hydroxyly, také na tubulin Problémy s fluoresceinem ■ náchylný na fotorozklad - signál vydrží pouze pár minut ■ pH závislost fluorescence - výrazně klesá signál pro pH pod 7 ■ existence isomerů - může komplikovat geometrii vazby k proteinům, následně eluční časy v chromatografii, migraci v gelech ■ méně vhodný pro "ultracitlivé" aplikace Rhodaminy r o o" O sulforhodamin 101 (Texas Red) O" tetramethylrhodamin (TMR) 1.+ rhodamin B S03- 0 ^0 rhodamin 6G >H2 0 c O rhodamin 110 TRITC ^N strukturně podobné fluoresceinu, který doplňují - místo atomů kyslíku jsou na postranní cykly vázány dusíkové atomy - mohou nést různé substituenty a tím je dostupná široká škála variant emise probíhá při delších vlnových délkách ve srovnání s fluoresceinem - použitelné pro techniky s dvojím značením - vyšší fotostabilita a dobrá excitovatelnost světlem rtuťových výbojek sulforhodamin B, jinak Lissamin rhodamin B - obsahuje na dolním aromatickém jádře dvě sulfoskupiny v polohách 3 (vpravo nahoře) a 5 (dole) (Imperiál Chemical Industries) sulforhodamin 101, Texas Red (Molecular Probes) - emitující nad 600 nm tetramethylrhodamin-5-isothiokyanát (TRITC) resp. (TMR) - od tetramethylrhodaminu, nejběžnější značkovací činidlo z této skupiny, (544/570), £544 = 105 Mcm-1 - reakce s aminoskupinou probíhá analogicky jako u FITC - karboxytetramethylrhodamin (TAMRA) další alternativa NHS-rhodamin (5-karboxymethylrhodamin sukcinimidylester) (544 / 576) karboxy-X-rhodamin (ROX) - značení oligonukleotidů, sekvenování Lissamin Rhodamin B sulfonylchlorid (556 / 576) - má v 5-pozici reaktivní skupinu -S02CI - s -NH2 vzniká sulfonamid - podobně existuje sulfonylchlorid i od Texas Red derivátu na derivatizaci SH: tetramethylrhodamin-5-jodacetamid (540 / 567) pro reakci s aldehydy Lissamin rhodamin B sulfonylhydrazin - má v 5 poloze skupinu -S02-NH-NH2) (560 / 585) - sulfonylhydrazin Texas Red emituje při delší vlnové délce (580 / 604) Rhodaminy - zhodnocení ■ fluorescence v červené oblasti ■ vyšší stabilita než fluorescein ■ excitovat (při 520 nm) lze rtuťovou výbojkou SCLH SOoH H0N S0oH SOoH ,COOH Alexa Fluor rhodaminový nebo kumarinový skelet doplněný o sulfoskupiny vyšší rozpustnost celá odstupňovaná řadu sloučenin s posunujícími se exc. a emis. maximy napojení na značené biomolekuly probíhá v dolní části molekuly přes karboxyl v poloze 5 aktivovaný např. NHS skupinou - jsou přítomny i isomery se skupinou posunutou do polohy 6 Alexa 488 COOH Alexa 532 COOH i E O 550 600 650 700 Wavelength (nm) 850 1. Alexa 2. Alexa 3. Alexa 4. Alexa 5. Alexa 6. Alexa 7. Alexa 6. Alexa 9. Alexa 10. Alexa 11. Alexa 12. Alexa 13. Alexa 14. Alexa 15. Alexa 16. Alexa 17. Alexa 18. Alexa 19. Alfixa Fluor 405 Fluor 350 Fluor 500 Fluor 488 Fluor 430 Fluor 514 Fluor 532 Fluor 555 Fluor 546 Fluor 568 Fluor 594 Fluor 610 Fluor 633 Fluor 635 Fluor 647 Fluor 660 Fluor 680 Fluor 700 Fluor 750 Značení AlexaFluor 'V /Z* J A. ■ }J J \*f J S- V*- y^t« imunolokalizace ribulosabisfosfát karboxylasy v 2.0 |im řezu listu kukuřice (C4, separovány fotosynt. složky mezi mezofil a svazky cévní) - anti rubisco Ab, Alexa Fluor 488 kozí Ab anti králičí IgG - autofluorescence chlorofylu (červeně, v mezofylových plastidech) - lignin (matně zelený) v xylemu svazků - kutin (jasně zelený) v kutikule vně epidermis periferní neurosystém embrya Drosophily: - mAb 22c10 anti mikrotubuly, Alexa Fluor 488 králičí Ab anti-myší IgG - dělící se buňky - Ab anti histon-H3, Alexa Fluor 594 kozí Ab anti králičí IgG - jádra DAPI (modrá fluorescence) Kumariny kumarin = 2H-1-benzopyran-2-on je přírodní látka - 7-amino-4-methylkumarinové deriváty, zejména 7-amino-4-methylkumarin-3-octová kyselina (AMCA) (345 / 450) - pro -NH2 AMCA-NHS .- 4-methyl-7-hydroxykumarin - prO -SH AMCA-HPDP excitaceA A emise - pro aldehydy AMCA-hydrazid / j M ■ 7-diethylamino-3-[(4'-(jodacetyl)amino)-fenyl]- / I / \ -4-methylkumarin (DCIA) \ \ - velmi intenzívní fluorescence (382 / 472) / W \ - na světle nestabilní s/ y V i i i i i i 300 350 400 450 500 550 _(nm)A 4,4-difluoro-4-bor-3a,4a-diaza-s-indacen - nemá ionizovatelné skupiny - málo ovlivněn pH - vysoké absorbance a vysoké kvantové výtěžky fluorescence - menší komplikací jsou malé Stokesovy posuny pod 20 nm - modifikace v krajních polohách postranních cyklopentadienů - deriváty s posunutými spektrálními charakteristikami - pro -NH2 existuje BODIPY FL C3 SE s postranní NHS skupinou (502 / 510) - komplikací je vzájemné zhášení, pokud je stupeň substituce vyšší - dostupné deriváty s jodacetamidovou a hydrazidovou skupinou ■ deriváty BODIPY 530/550 C3-X - maxima k vyšším vlnovým délkám - přítomnosti objemných aromatických postranních substituentů - reaktivní skupinou X může být NHS nebo hydrazid bromderivát Br BODIPYpro substituce sulfhydrylových skupin Cascade blue R-NhL 0 S0„H S0oH R-OH SO„H NH(CH2)2NH2 NH(CH2)5NH2 NH-NhL od sulfonovaného pyranu - vlastnostmi vhodně doplňuje fluorescein při multiznačení - výborná rozpustnost ve vodě - dobré kvantové výtěžky (kolem 50%) - malá úroveň vzájemného zhášení při vyšších substitučních poměrech - mateřská sloučenina má na horním jádře vpravo pouze methoxyskupinu. pro značení aminoskupin - acetylazidový derivát (375+400 / 410) - při vyšších teplotách - kolem 80 "C v DMF probíhá p řesmyk azidového uskupení na isokyanátovou formu a odštěpí se molekula dusíku - isokyanát reaguje s volnými hydroxyly, vzniká urethanové uskupení - další formy mají v postranní části hydrazinový, ethylendiaminový nebo kadaverinový (pentamethylendiaminový) zbytek Lucifer yellow základní sloučeninu z = H deriváty 4-aminonaftalimid--3,6 disulfonátu napojení se realizuje přes horní imidový atom dusíku - jodacetamidový derivát (na -SH) - hydrazidová skupina (Lucifer Yellow CH, na aldehydy) - optické parametry (427 / 530) především v cytochemii Cyaninové fluorofory - velmi populární zejména v oblasti DNA biočipů využívajících cDNA fragmenty jako imobilizované próby základem je indokarbocyaninový skelet - je sulfonován, obě aromatické části jsou spojeny uhlíkatým můstkem s konjugovaným systémem dvojných vazeb (methin) je k dispozici odstupňovaná řada fluoroforů (Amersham Biosci.) Cyaniny - zhodnocení ■ délka polyenového spojovacího řetězce - monomethinové sloučeniny - thiazol orange (TO), oxazolle yellow (YO) nebo jejich dimery (TOTO, YOYO) - fluoreskují po vazbě na nukleové kyseliny (fluorescenční sondy) - polymethinové sloučeniny - Cy3, Cy5,... - délka spoj. řetězce, resp. počet vinylenových -CH=CH- skupin působí bathochromní posun o cca 100 nm - fluorofory emitující až v NIR oblasti ■ výhody NIR fluorescence - není zde už autofluorescence biologických složek - vyšší citlivosti - méně nákladná instrumentace, excitace při delších vlnových délkách ■ problémy - úzké excitační pásy, fotorozklad, menší intenzita v NIR Atto vysoká absorbce a výtěžek, fotostabilita modifikace oligonukleotidů několik typů struktur na bázi kumarinu, rhodaminu,... (Atto-Tec) Fluorescent Dye Absorption max. [nm] Emission max. [nm] Extinction coefficient [cm_1M_1] Atto 390 390 479 24.000 Atto 425 436 484 45.000 Atto 465 453 508 75.000 Atto 495 495 527 80.000 Atto 488 501 523 90.000 Atto 520 516 538 110.000 Atto 532 532 554 115.000 Atto 550 554 579 120.000 Atto 565 563 592 120.000 Atto 590 594 624 120.000 Atto 594 601 627 120.000 Atto 620 619 643 120.000 Atto 633 629 657 130.000 Atto 647N 644 669 150.000 Atto 655 663 684 125.000 Trojnásobné značení endotheliálních buněk (HUVAC): von Willebrand faktor - Atto 550 znač. Ab (zelené), kadherin - Atto 655 zanč. Ab (červeně) a jádra DAPI (modře) Fluorogenní substráty hydrolas deriváty resorufinu deriváty fluoresceinu, např. fluoresceindifosfát pro ALP rhodamin 110, bis-(/V-CBZ-L-argininamid) (BZAR), pro serinové proteinasy, (496 / 520) cca 100x citlivější než sloučeniny založené na AMC jiný příklad - rhodamin 110, bis-(/V-CBZ-L-fenylalanyl-L-arginin amid) (Z-FR-R110) pro cysteinové proteinasy katepsin B a L Fluorogenní enzymové substráty 4-methylumbelliferylfosfát (MUP), po hydrolyse fosfatasou vzniká 4-methyl-7-hydroxykumarin (methylumbelliferol), modrá fluorescence, (360 / 450) deriváty 7-amino-4-methylumbelliferolu (Z-X-AMC nebo Z-X-MCA), AMC produkt (342 / 441), např. 7-amino-4-methylkumarin A7-CBZ-L-fenylalanyl-L-argininamid (Z-FR-AMC) pro stanovení serinových proteinas a plasminu, kalikreinu, katepsinu), nebo 7-amino-4-methylkumarin, A/-CBZ-L-aspartyl-L-glutamyl-L-valyl-L-asparagylamid (Z-DEVD-AMC) pro kaspasu 3 alternativně deriváty 7-amino-4-trifluoromethylkumarinu, např. Z-DEVD-AFC A/-CBZ- je A/-benzyloxykarbonyl- o Lanthanidové komplexy DTTA N OH N V V o OH OH Eu3+ a Sm3+ ve formě chelátových komplexů - atraktivní fluorescenční značky vhodné pro časově rozlišenou fluorescenci („time-resolved fluorescence", TRF) ■ pro "prichycenľ'k biomolekulám slouží N1-(p-isothiokyanatobenzyl)-diethylen-triamin-N1,N2,N3,N3-tetraoctová kyselina (DTTA) - která se může vázat na aminoskupiny za vzniku thiomočovinového uskupení. ■ takto připravené komplexotvorné místo pak váže iont lanthanidu a získá se intenzivně fluoreskující značka s relativně dlouhou dobou záření po excitaci - při pulzní excitaci se vyčká, až vymizí či vyhasne nespecifická fluorescence pozadí, případně rozptýlené záření, a až pak se po krátké prodlevě změří fluorescence značky - lze použít i další lanthanidy, např. terbium a dysprosium - proces pod názvem DELFIA zavedla finská firma Wallac Oy Další chelátové struktury ■ kryptát terpyridin chelát s anténou 0 400 800 1000 Time (ms) Kvantové tečky - moderní f luoreskující polovodičové nanokrystaly - QD, "quantum dots" jsou menší než 10 nm a svým kvantovým chováním se nachází mezi polovodiči a izolovanými atomy ■ polovodiče - valenční a vodivostní energ. hladiny odděleny o Eg - excitace - elektron přejde do vodivostní hladiny a zanechá za sebou kladně nabitou díru ve valenční hladině - prostorová separace tohoto páru ("exciton") odpovídá Bohrovu průměru a je typicky 1 až 10 nm - QD mají obdobnou velikost - excitony jsou v nich ohraničeny podobně jako chování částice v uzavřeném prostoru - energetické hladiny připomínají atomy či molekuly - optické vlastnosti závisí na velikosti Kvantové tečky (QD) Quantum dot synthesis heater refluxing solution of the QD precursors unikátní fluorescenční vlastnosti - stabilita vůči fotorozkladu, velké Stokesovy posuny CdTe jádro obalené CdS, rozpustnost díky vazbě thioglykolové kys. (TGA) prekurzory - Te, CdCI2, TGA a NaBH4 - NaHTe připraven redukcí Te pomocí NaHB4 - nástřik roztoku NaHTe do směsi CdCI2 a TGA v inertní atmosféře - refluxace na vzduchu (minuty až hodiny) při zahřívání roste průměr QD, emisní maximum se posouvá k delším vln. délkám větší QD mají lepší stabilitu 9000 8000 7000 Ex: 360-440 nm Em: 620-740 nm sensitivity 110 quantum dot fluorescence Ex: 485-520 nm Em: 528-620 nm sensitivity 110 fluorescein fluorescence pty well pty well Quantum dot resp. fluorescein fluorescence and background Vlastnosti QD 10:00 h 1 _ 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 Wavelength [nm]__ QD: absorbční / emisní spektra Fotoluminiscence u QD ■ vzniká radiační rekombinací excitonů spektrální vlastnosti jsou „laditelné" změnou velikosti částic - např. u CdSe nanokrystalů lze emisi nastavit od 450 do 650 nm - menší QD jsou „modřejší" (hypsochromní efekt) pro konjugaci s biomolekulami se nanáší reaktivní vrstvy - tri-n-oktylfosfinoxid (TOPO) nebo hexadecylamin - silanizační činidla vytvářející silikátový obal - thioly, thiokyseliny, glutathion, ... Výhody QD ■ oproti klasickým fluoroforům zahrnují: ■ vysoký jas (20x vyšší proti jiným typům, daný velkým kvantovým výtěžkem a vysokým extinkčním koeficientem) ■ úzké emisní pásy pod 30 nm, velké Stokesovy posuny - částice obsahujících různě barevné QD v různých poměrech, čímž vzniká chemický „čárový kód" umožňující identifikaci v komplexních směsích ■ velmi stabilní a nepodléhají fotodegradaci - často se chrání proti fotooxidaci pláštěm z polymerů nebo jiných polovodičů (např. CdSe povlečený ZnS nebo silikátem) ■ široké absorbční pásy - různě barevné QD lze excitovat stejným zdrojem světla a jednoduše tak vyhodnocovat současně různé značení odlišnými barvami při multiplexních stanoveních QDs mohou být toxické - CdSe a CdTe snadno připravitelné ve vodě, nejčastější pro bioaplikace - vysoký kvantový výtěžek (-50%), klesne po biokonjugaci (-20%) ■ "klasické" materiály - CdTe, CdSe, HgTe, PbS ... jsou toxické - nové možnosti - Si, ZnS dopovaný Mn, InP, InP / ZnS, Ag2S, Ag2Se, C dots Wavelength (nm) 28 Nanočástice s fluorofory optické kódování na základě multiplexování vln. délek polymer, uvnitř směsi různě fluoreskujících QD - charakt. spektrum možnost identifikace cílových biomolekul ve směsích při užití kombinatorických postupů A A A OOO A A A A B B B B SboO B B B B C w c s 5 0 n Code readout o c V**, c-► c c c D D D D D D E E E E E E E E 3 0 10 5 : Wavelength Bar coding (optický „čárový" kód) ■ V JL A, a A JL iL A ä A JL A íl A á JL A A A Fournier-Bidoz S, Jennings TL, Klostranec JM, W RheeA, Li D, Chan WCW Facile and Rapid One-Step Mass Preparation of C Dot Barcodes (2008) Anaew Chem Int Ed 47, 5577-5581 Multiplexní imunostanovení různé QD jako značky, stanovení několika analytů (markerů) vedle sebe v jediné proceduře Y Y Y Y 40000 J, 30000 Goldman ER.CIapp AR, Anderson GR Uyeda HT, Mauro JM, Medintz IL, Mattoussi H Multiplexed Toxin Analysis Using Four Colors of Quantum Dot Fluororeagents (2004) Analytical Chemistry 76, 684-688 450 500 550 600 wavelenath fnrrrt 650 Kapilární fluorescenční imunostanovení excitace kódování - typ biorekogničního elementu (co se měří) společná sekundární značka (kolik toho je přítomno ve vzorku) Anti-Stokes fluorescence - organic f luorophores - excitation with shorter wavelength, emission at a longer wavelength, intensity of emission is directly proportional to the excitation - however, a longer wavelength can be changed to a shorter one -energy of few photons is summarised and a higher energy photon becomes emited; intensity depends on the square of excitation -non-linear processes - two(multi)-photon luminescence - several photons interacting with a single molecule - e.g. 2-photon confocal microscopy - lower excited volume, better resolution - second harmonic generation - increased energy of photons passing through suitable crystalic materials - double frequency at the output, narrow emission peaks, coherence - nanocrystals of KNb03, LiNb03, BaTi03, ZnO ■ „upconvertion" Upconverting NPs (UCNP) gradual absorbtion of several photons lower excitation intensity compared to multiphoton techniques - observed for materials doped with Ti, Ni, Mo, actinoids quite high for NPs based on NaYF4 doped with lanthanoids (eg. Yb3+ and Er3+, or Yb3+and Tm3+) c 3 c CD o c CD O V) 0) c E 3 800 600 - 400 200 - 400 700 500 600 Wavelength (nm) Upconverting spektrum 12 nm NaYF4 NPs dopovaných Yb3+, Er3+ a Gd3+, excitace NIR laser 980 nm UV/VIS Mechanism of upconversion ■ ESA (excited-state absorption) - ions gradually absorb several photons - transfer to the target band, emission starts ■ ETU (energy transfer upconversion) - ions with a higher extinction coef. beta phase of NaYF4 doped with Yb3+ (20%, sensitiser) and Er3+, (2%, emitter) (sensitizers) become excitec absorbtion of photon and trc energy to nearby ions (emitt ESA ETU Photon excitation Energy transfer Emission by nsfer ?rs) 20 E o CO o CD c LU c 10 -2F5/2 c o 00 multi-phonon relaxation energy transfer photon absorption/ emission 0 CO 01 o CO II - in in CM m 6 c o to CO II -< Yb3+ Er3+ 4F7/2 2Hll/2 4S3/2 4F9/2 4l9/2 4lll/2 4ll3/2 lllS/2 Assays with UCNP - LRET detection of human IgG NaYF4 : Yb : Er overlap of Au absorbtion with green emission (energy transfer) homogeneous competition _, red 980 nm i green 980 nm *2£L red NaYF4:Yb,Er S/ rabbit anti-goat IgG 4 human IgG ^fk nanogold goat anti-human IgG 1 UCNPs Au NPs / IH / ZJ 05 01 o to E LU 450 500 550 600 Wavelength (nm) 650 700 300-1 250 200 f 150 I 100- 50- 0- 450 500 550 600 _Wavelength / nm 650 700 Bioimaging with UCNP (... in NIR) tissues are rather transparent for NIR light (700 .. 900 nm) - out of water and hemoglobin single molecule (bioobject) visualisation He Y, Zhong Y, Su Y, Lu Y, Jiang Z, Peng F, Xu T, Su S, Huang Q, Fan C, Lee S-T Water-dispersed near-infrared-emitting quantum dots of ultrasmall sizes for in vitro and in vivo imaging (2011) Angewandte Chemie - International Edition 50 (25), 5695-5698 Dahan, M., Levi, S., Luccardini, C, Rostaing, P., Riveau, B., Triller, A. Diffusion Dynamics of Glycine Receptors Revealed by Single-Quantum Dot Tracking (2003) Science, 302 (5644), pp. 442-445 Fykobiliproteiny - intenzivně fluoreskující proteiny z fotosyntetického aparátu eukaryot, modrozelených a červených sinic, řas a cyanobakterií - nativní nefluoreskují, ale excitační energii předávají na chlorofyly - purifikované fluoreskují s výtěžky kolem 100% - obsahují několik bilinových chromoforů (např. B-fykoerithrin 34) - to v souhrnu poskytuje vysoké extinkční koeficienty pro celou molekulu Název Zdroj Složení Mr (kDa) Počet bilinů (nm) £ (106 M"1 cm1) B-fykoerythrin Porphyridium cruentum (a(3)6Y 240 34 546 / 575 2,4 R-fykoerythrin Gastroclonium coulteri (a(3)eY 240 34 566 / 574 2,0 C-fykocyanin Anabaeba variabilis (a(3)2 72 4 614/643 0,58 allofykocyanin Anabaeba variabilis (a(3)3 110 6 650 / 660 0,70 CryptoFluor Crimson cryptomonad algae 40,2 585 / 658 CryptoFluor Gold cryptomonad algae 30,8 566 / 600 - fluorescenční výtěžky se blíží 30 fluoresceinům nebo 100 rhodaminům - fluorescence není externě zhášená - dostupnost mnoha konjugačních míst - v prodeji jako konjugáty se streptavidinem nebo biotinem Zelený fluoresceční protein ■ "green fluorescent protein", GFP - z bioluminiscentní medúzky (Aequrea victoria, jellyfish), 26 kDa - chromofor - p-hydroxybenzyliden-imidazolidinon, vniká cyklizací a oxidací aa zbytků Ser-Tyr-Gly: ■ mutagenezí získány vylepšené varianty - široké použití pro značení - divoký typ, směs fenolu a fenolátu - fenolátový anion - fenol - fenolátový anion s přidruženým pí-elektronovým systémem - indol (Trp místo Tyr) - imidazol (His místo Tyr) - fenyl (Phe místo Tyr) Použití GFP ■ biologická značka pro sledování a kvantifikaci exprimovaných bílkovin ■ studium protein-protein interakcí ■ interní buněčný "biosensor" pro sledování signálů ■ rekombinantní techniky - spojení GFP se sekvencí jiné bílkoviny - chiméry - sledování lokalizace a pohybu bílkovin v buňkách Fluorescenční polarizace (FP) založena na velikosti rotačního pohybu molekul v protikladu jsou doba života rf, a rychlost pohybu 0rot fluoroforu excitace se provádí polarizovaným světlem, tj. excitují s fluorofory vhodně ot vůči rovině světla pokud bude životnost exc. stavu mnohem kratší, než rotace, tak si excitované molekuly zachovají orien a bude emitováno polarizované záření pokud bude životnost exc. stavu dlouhá, poruší se orientace molekul a nastane depolarizace e pouze ientované Tf,«9rot * ^6 Tfi»erot ^1 c^fooo 3x> \ OCO' polarizované depolarizované emitované záření FP a mobilita molekul P0... FP v nepřítomnosti rotační difuse alternativní vyjádření rotace pomocí viskosity a molekulárního objemu V, lze dále zavést molekulovou hmotnost spec. objem bílkoviny v a hydrataci h (typ. 0.2 g vody na 1 g proteinu) v praxi jsou díky hydrataci a nesférickému tvaru korelační časy 0 asi 2x větší než odvozené pro kouli v suchém stavu (např. HSA, M= 65 kDa, A=1,9 vychází 0 kolem 50 ns) Polarizátor ■ světlo po průchodu polarizátorem osciluje pouze v jedné rovině ■ dichroické systémy - adsorbují jednu z obou rovin polarizace (film z orientovaného PVA dopovaného jódem), málo efektivní v UV oblasti ■ krystaly kalcitu vykazující dvojitou refrakci - rozptylují různě obě roviny polarizace (Nicol a Glan polarizátory, Wollastonův hranol) Měření FP zdroj světla změří se horizontální a vertikální složky emitovaného záření polarizace se vypočte podle vztahu: bývá od -0.25 po 0.5 alternativně se používá anisotropie r. polarizátory vzorek emise detektor obě veličiny jsou zaměnitelné (vnitřně souvisí): jako tracer fungují konjugáty malých molekul (peptidy, léčiva, pesticidy,...), které jsou pomocí vhodného můstku (linker) spojeny s fluoroforem (fluorescein, rhodamin) FRET Förster energy resonance transfer přenos energie zářivými nebo nezářivými mechanismy mezi dvěma chromofory - zářivý (triviální) přenos - excitovaná molekula donoru emituje záření, které je absorbováno molekulou akceptoru - nezářivý přenos energie (FRET) - ve směsi molekul dochází k absorpci pouze molekulami donoru, avšak konečným výsledkem je excitovaná molekula akceptoru (chromofor, budící záření sám neabsorbuje) - nedochází k emisi světla donorem absorbce donoru neradiační přechody ▼ «.-0* ......► rezonanční přenos emise akceptoru donor akceptor ä Distance and Energy Transfer Efficiency Förster Distance Distance (r, in Nanometers) Efektivita FRET dána poměrem vzdálenosti r mezi D a A a Forsterova poloměru r0, nebo alternativně poměry doby t nebo intenzity Ffluorescence donoru bez (t, F) a v přítomnosti (ť ,F) akceptoru, závisí dále na: - vzdálenosti mezi donorem a akceptorem - speltrální překryv emisního pásu donoru a absobčního pásu akceptoru - vzájemné relativní orientaci dipólů donoru a akceptoru pravděpodobnost rezonančního přenosu energie určuje kx - určující složkou je dipól-dipólový přenos energie - Forsterův vzorec (v případě slabé vazby, kdy vzájemné interakce donoru a akceptoru neovlivní optická spektra) - rD - doba dohasínaní fluorescence donoru, r0 - vzdálenost, ve které je pravděpodobnost přenosu energie rovna pravděpodobnosti vnitřní deaktivace vzbuzeného stavu molekuly, rDA - vzdálenost mezi donorem a akceptorem i D \ 'dA J FRET uspořádání donor - fluorescenční skupina (fluorofor) excitace \ akceptor - zhášející skupina (quencher) hydrolysa vhodné skupiny ve spojovacím můstku I I nezanvy prenos energie na blízkou skupinu akceptoru r VB ' ZADNA FLUORESCENCE I molecular beacon" komplementární DNA (target) \ oddálení - není přenos energie NASTUP ** FLUORESCENCE FRET - vhodné skupiny Vícenásobné značení - detekce mutací FISH fluorescence in situ hybridization mRNA target dual molecular beacon - vyšší specifita - obě próby musí hybridizovat s cílovými místy, technika "adjacent probes" Real time PCR - zviditelnění průběhu pomocí MB - 95 °C denaturace - 65 °C annealing, přisednutí primerů a MB = fluorescence - 72 °C prodloužení vláken 2000 CD O c CD to 1000 2? o 1,000,000 100,000 10,000 1,000 100 10 threshold 10 20 30 40 50 60 Thermal Cycles 95'C ___ 65X 72X reverse primer $_3* forward primer 5'_3- molecular beacon \y I Initiation 3'_^_^5' 5'---_________ 3' 5' 3' I 3*_ 5 5--:™=3' 31 _s .....-.......1^ - 51 3' (monitor fluorescence) I 3' _ 5" 5._Lilll,.:,,,,;.;.:.:,,,;.^.:.;.;,^.;.,;.;,.L^.,:.:.:. 3. N N Repeated 2N FRET: in vivo interakce biomolekul separované biomolekuly FRET: in vivo interakce biomolekul interakce ligand a receptor fúze liposomů FRET imaging v mikroskopii Gene-PIN T A C CCGCT A G A T GACG TAGGCGATC TAAT CCTGCATCCGCTAGATTAG TC A C-G C-G C- c- t oligonukleotid - "inteligentní" DNA proba obsahující sekvenci komplementární k cílové sekvenci v analyzovaném vzorku na jednom konci má řadu G, na druhém konci řadu C a navíc skupinu fluoroforu v roztoku tedy vytvoří vlásenkovou strukturu, v níž se fluorofor přiblíží ke guaninovým zbytkům, které fungují jako zhášeč v přítomnosti cílové sekvence se vlásenka otevře a objeví se fluorescence výhody: jednoduchost, rychlost, citlivost (107 až 1012 M) Elektrochemiluminescence (ECL) chemiluminescence jako výsledek elektrochemické reakce, ze stabilního prekurzoru na povrchu elektrody vytvořen vysoce reaktivní prvek, který reaguje za tvorby světelného záblesku chemiluminiscentní reakce, která vede k emisi fotonu z rutheniového komplexu, je iniciována elektricky, spíše než chemicky realizace ECL na povrchu elektrody umožňuje přesnou prostorovou kontrolu procesu, včetně zapnutí a vypnutí (ON / OFF), PMT detektor je prostorově velmi blízko hlavní výsledek je intenzita světelného toku, podružnou informací je závislost proudové odezvy elektrody vhodné i pro velmi nestabilní látky (generování in situ) možnost recyklování - zesilovací účinek ECL lze provést i s luminolem komplexy ruthenia s bipyridinem, [Ru(bpy)3]2+ technologie se využívá v imunoanalyzátorech firmy Roche light Systém Bioveris (Roche) Luminiscence emise světla Chemi- předání chem. energie Elektro- elektrochemická iniciace Ru(bpy)32+(1) = BV-TAG™ TPA = Tripropylamine ruthenium a TPA jsou oxidovány po aplikaci napětí na elektrodu ■ radikál TPA+ ztrácí proton, redukuje Ru3+ na Ru2+, které z excitovaného stavu přechází do základního za vyzáření fotonu - Ru se nespotřebovává - recykluje se - zesilovací mechanismus - zvýšení citlivosti stanovení BioVeris tag stabilní neizotopická značka různé formy pro biomolekuly: BV-Tag-NHS-ester BV-Tag-fosforamid BV-Tag-maleimid BV-Tag-hydrazid BV-Tag-amin aminy (bílkoviny) fosfoskupiny (nukleové kyseliny) thioly sacharidy karboxyly podobný je systém ELECSYS obvykle kombinováno se záchytem pomocí magnetického nosiče