VYBRANÉ PROBLÉMY
ELEKTROCHEMIE
RNDr. Mgr. Iveta Třísková, Ph. D.
2
Elektroneutralita a iontová síla
• Elektrostatické interakce iontů – vliv na stabilitu a prostorové
uspořádání biologicky významných struktur
• Elektrická vodivost roztoků
• Změny koligativních vlastností (jejich velikost závisí na počtu částic
v roztoku) – snížení bodu tuhnutí, zvýšení bodu varu nebo
osmotického tlaku v důsledku snížení chemického potenciálu
µ
• Silné elektrolyty – úplná disociace na ionty; silné kyseliny a
silné zásady
• Slabé elektrolyty – částečná disociace
• Analytická koncentrace elektrolytu = součet koncentrací
všech jeho forem přítomných v roztoku
• Pro dvojsytnou slabou kyselinu (H2A) platí: c = [H2A]+[HA-]+[A2
-]
2
21
r
QQ
F


3
Elektroneutralita a iontová síla
 Podmínka elektroneutrality - základní vztah pro roztoky
elektrolytů → kladné a záporné náboje se navzájem kompenzují
• Iontová síla – „koncentrace“ náboje v roztoku, dána vztahem
Př.: Jaká je iontová síla roztoku Al2(SO4)3 o c = 0,2 mol·dm-3 ?
I = ½ (2·0,2·32+3·0,2·22) = 3 mol·dm-3
ci molární koncentrace iontů i s nábojem zi

i
2
ii
zc
2
1
I
 
i
ii 0zc ci molární koncentrace iontů i s nábojem zi
4
Aktivita elektrolytů
• Odchylka od ideálního chování je způsobena elektrostatickými interakcemi
mezi ionty roztoku, proto pro přesnější výpočty lépe uvažovat
aktivitu iontů :
• Střední aktivitní koeficient
iii ca  
v vv 


  
ci je koncentrace iontů i; γi je aktivitní koeficient
(nejčastěji molární nebo molální)
Geometrický průměr aktivitního koeficientu aniontu
a kationtu
!!!!Musí platit podmínka elektroneutrality!!!!
Aktivitní koeficient
5
Z klasické termodynamiky:
Pro reálný roztok kationtu M+ a aniontu X- při téže molalitě platí:
Gm = µ++µ- = µ+
ideal+ µideal+RTlnγ++RTlnγ-=
Gm
ideal+RTlnγ+ γγ±
= (γ+ γ-)1/2
Střední aktivitní koeficient
Obecně pro sloučeniny MpXq platí:
Gm = pµ++qµ- = Gm
ideal+pRTlnγ+ + qRTlnγγ±
= (γp
+ γq
-)1/s s = p+q
Definice středního aktivitního koeficientu
6
Debye-Hűckelova teorie iontových
roztoků
Podkladem D. – H. teorie je tendence aniontů
shromažďovat se kolem kationtů a naopak (jeden
takový lokální shluk je znázorněn kruhem). Ionty
jsou v neustálém pohybu.
1923 – Peter Debye a Erich Hückel
Iontová atmosféra
2/1
AIzzlog  
Pro velmi nízké koncentrace:
Debye – Hückelův limitní zákon
kde A = 0,509 pro vodné roztoky při 25 °C a I je bezrozměrná iontová síla roztoku
Debye-Hűckelova teorie iontových
roztoků
7
 
i
i
2
i b/bz
2
1
I ѳ definice iontové síly
Pro velmi vysoké koncentrace lze aktivitní koeficient odhadnout z rozšířeného Debye –
Hückelova zákona:










 
 CI
BI1
IzzA
log 2/1
2/1
 Rozšířený Debye-Hückelův zákon
Kde B a C jsou bezrozměrné konstanty a lze je považovat za nastavitelný empirický
parametr
Solvatace v roztocích elektrolytů
8
A Rozpouštění iontových sloučenin - pochod, při kterém jsou pozitivně a negativně
nabité ionty, vyskytující se v mřížce od sebe vzájemně oddalovány v důsledku silného
elektrostatického přitahování s dipóly vody – vznik hydratovaných iontů
Hydratace i jako chemická reakce mezi iontem a vodou vedoucí ke vzniku koordinační
sloučeniny
Při hydrataci iontů jsou v hydratační sféře předpokládány tři oblasti:
1) Vnitřní vrstva – molekuly vody jsou vzájemně pevně orientovány na povrchu iontu
(jejich struktura je uspořádanější než v samotné vodě)
2) Další vrstva – ion ruší vodíkové vazby mezi molekulami vody – porušení struktury
3) Vnější vrstva – struktura „vázané“ vody přechází na strukturu „volné“ vody
Water dissolves many crystalline salts
by hydrating their component ions. The
NaCl crystal lattice is disrupted
as water molecules cluster about the Cl
and Na ions. The ionic
charges are partially neutralized, and the
electrostatic attractions necessary
for lattice formation are weakened
2
21
r
QQ
F


Síla iontových interakcí
Solvatace v roztocích elektrolytů
9
Rozdílná působnost iontů v hydratačních vrstvách
•Ionty Li+, Na+, H3O+, Ca2+, Mg2+, OH-, F- - uplatňují se v první vrstvě a
působí ve smyslu zpevnění struktury vody
•Ionty K+, NH4
+, Cs+, Br-, I-, IO3
- - uplatňují se především ve druhé vrstvě a
působí ve smyslu rušení struktury vody
B Rozpouštění nenabitých polárních molekul (anorganické i organické sloučeniny)
tvorba vodíkových můstků s polárními funkčními skupinami (hydroxylové skupiny
cukrů a alkoholů, karboxylové skupiny aldehydů a ketonů…)
C Sloučeniny obsahující pouze nepolární hydrofobní skupiny se ve vodě
nerozpouštějí
D Amfipatické látky – obsahují v molekule polární (hydrofilní) i nepolární
(hydrofobní) skupiny. Př.: mastné kyseliny a polární lipidy
 Tvorba micel
Voda jako rozpouštědlo
D Amfipatické látky – bílkoviny a nukleové kyseliny
Bílkoviny: důležitá role (polárních) nabitých skupin –COO-,
NH3
+ imidazolium při vazbě vody na bílkovinu
Nukleové kyseliny: fosfátové skupiny jsou primárním
místem hydratace
10
Hydratace bílkovin
• Na povrchu molekuly bílkovin v bezprostředním kontaktu s rozpouštědlem
jsou a) nabité funkční skupiny; b) nenabité struktury→ různé části povrchu
biopolymeru jsou solvatovány/ hydratovány odlišným způsobem
• Hydratační obal bílkovin – existuje vždy; část této vody vázána mimořádně
pevně – nelze ji odstranit bez nevratné destrukce nativní struktury bílkoviny;
další podíl vody vázán méně pevně; všechna vázaná voda má však
charakteristiky, kterými se liší od čistého rozpouštědla – dvojrozměrná síť
molekul vody propojených vodíkovými vazbami, která obepíná molekulu
bílkoviny a začleňuje do sebe i klastry vody v některých oblastech. Vodíkové
vazby v síti jsou pevnější a mají delší dobu života než tyto vazby ve
vzdálenějším okolí
• Hydratační obal je klíčový pro biologickou funkci bílkovin (konformační
flexibilita)
• Voda v krystalech bílkovin – 30 až 50% hmotnosti krystalu; nezbytná pro
udržení struktury; chová se jako kapalná → difuze malých molekul do dutin
krystalů bílkovin 11
Vsolování a vysolování bílkovin
12
• Rozpustnost bílkovin ve vodě lze ovlivnit přídavkem rozpustné soli
• Závislost rozpustnosti bílkovin na koncentraci přídavné soli prochází
maximem
• Vsolování – první vzestupná větev, kdy se bílkovina více rozpouští
• Vysolování - když křivka dosáhne maxima, začíná s dalšími přídavky
soli rozpustnost bílkoviny klesat a při vysoké koncentraci soli →
bílkovina z roztoku vypadne; používá se pro frakcionaci lidského séra,
isolaci bílkovin
I
rozpustnost
vsolování vysolování
Vsolování a vysolování bílkovin
13
• Na začátku bílkovina v čisté vodě → navázání iontů přidávané soli →
změna náboje molekuly bílkoviny a změna hydratačního obalu →
hydrofilisace molekuly bílkoviny → roste rozpustnost až do té doby,
než je v roztoku tak velké množství volné soli, že začíná kompetice
mezi jejími ionty a bílkovinou o molekuly vody pro hydratační obal →
částečná ztráta hydratačního obalu ve prospěch anorganických iontů,
zesílení interakcí bílkovina – bílkovina → precipitace (vysolení
bílkoviny)
Vsolování
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
H2O
H2O
H2O
H2O
H2O
H2O
H2O
Vysolování
Vsolování a vysolování bílkovin
14
• Vsolování – náboj bílkoviny z+ kompensován anionty X-; v roztoku se
ustavuje rovnováha PXz↔Pz+ + zX-;
• termodynamická rovnovážná konstanta:
• Součin rozpustnosti: Sbílk = apz+(ax-)z
• Vysolování – lze použít semiempirický vztah: log cs = logcs
0 – KsI
• Franz Hofmeister (konec 19.stol.) – sestavení řady aniontů a kationtů
dle jejich vysolovacího účinku:
• Anionty se stejným kationtem: SO4
2- > F- > IO3
- > NO2
- > Br- > NO3
- > I- >
CNS•
Kationty se stejným aniontem: Li+ > Na+ > K+ > NH4
+ > Rb+ > Cs+
• Vysolovací účinek soli závisí více na aniontu než kationtu
• Pro vysolování bílkovin: Na2SO4 > (NH4)2SO4 > NaCl > CaCl2
• Nejběžnější vysolovací činidlo pro srážení bílkovin →síran amonný
zpx
z
xpz
r
a
)a(a
K 

15
Kyselost roztoků
• Druhá pol. 19. stol. →kyselost roztoků způsobena hydroxoniovými ionty
H3O+; jejich koncentrace souvisí s autoprotolýzou vody dle rovnice:
• Rovnovážná konstanta autoprotolýzy:
• Iontový součin vody Kw: Kw =[H3O+][OH-]= 1,008·10-14 mol2·dm-6
• V neutrálním roztoku: [H3O+] = [OH-] = 1,004·10-7 mol ·dm-3
• pH (Sørensenův vodíkový exponent): -log [H+]

 OHOHOH2 32
 
O2H
2
OHO3H
aO2H
a
aa
K


    7
OH 10.1KOHH 2


16
Měření pH
kde pH2 je parciální tlak plynného vodíku ve vodíkové elektrodě, pro níž je
Ev
0 = 0 V dle definice
•Pro vysvětlení podstaty techniky měření pH je vhodné vycházet z klasického
způsobu měření, kdy se používá článek složený z vodíkové jako indikační a
kalomelové jako referenční elektrody
•Pt|H2(g)|roztok X|KCl(nas)|Hg2Cl2(s)|Hg(l)|Pt
•Reakce: ½ H2(g)+ ½ Hg2Cl2(s)↔Hg(l)+H+(aq, X)+Cl-(aq)
•Elektrodové potenciály:
2
O3H
23v
pH
a
ln
F
RT
)H/OH(EE


 Vodíková elektroda

Cl
0
k22k aln
F
RT
E)Hg/ClHg(EE Kalomelová elektroda
Měření pH
17
•Elektromotorické napětí Ex = Epravá - Elevá
Nutno zvýšit o kapalinový potenciál ΦL,X na rozhraní roztok X a
nasycený KCl; ustavuje se na každém rozhraní, kde se stýkají dva
roztoky











  2HClxO3H
k
0
X,Lx pln
2
1
alnaln
F
RT
EE 











  2HClSO3H
k
0
S,LS pln
2
1
alnaln
F
RT
EE 
Odečteme rovnice











  SO3HXO3HS,LX,LSX )aln(aln
F
RT
EE 
Přirozené logaritmy převedeme na dekadické a po
dalších úpravách
 
RT303,2
EE
)S(pH)X(pH SX 
 Základ měření pH
18
 
RT303,2
EE
)S(pH)X(pH SX 

Standardní roztok, má jednoznačně přiřazenou jistou hodnotu pH; nejčastěji pufry
Praktická škála pH
19
Skleněná elektroda
• Iontově selektivní elektroda s membránou ze speciálního druhu skla
• Vnitřním elektrolyt: octanový nebo fosforečnanový pufr s přídavkem
chloridu
• Referentní elektroda: argentchloridová nebo kalomelová elektroda
ponořená do vnitřního roztoku elektrolytu
• Základní fce skleněné elektrody: výměnná reakce iontů mezi sklem a
roztokem, jehož pH je měřené (na základě této reakce se na povrchu
elektrody ustavuje Donnanův potenciál – potenciálový rozdíl mezi povrchem
membrány a okolním roztokem).
• Membránový potenciál: rozdíl Donnanových potenciálů na vnější a
vnitřní straně skleněné membrány
20
Skleněná elektroda








 
j
jz/iz
jjii
i
)ak(aln
Fz
RT
KE
Nicolsky-Eisenmanova rovnice
• Alkalická (pozitivní) chyba skleněné elektrody - pH > 10, způsobena
rušivým účinkem sodných iontů
•Kyselá (negativní) chyba skleněné elektrody – pH = 1 a nižší, nasycení
protony v povrchu skleněné membrány→ elektroda přestane být k
dalšímu snižování pH citlivá
•Nernstovská odezva elektrody je rovna 59,12 mV (t = 25 °C)
K … standardní potenciál ISE [V]
zi … nábojové číslo sledovaného iontu i
ai … aktivita sledovaného iontu i v měřeném roztoku
R … molární plynová konstanta (8,314 J·K-1·mol-1)
T … termodynamická teplota [K]
F … Faradayova konstanta (96 485,33 C·mol-1)
zj … nábojové číslo interferujícího iontu j
aj … aktivita interferujícího iontu j
kij … konstanta selektivity (vyjadřuje velikost vlivu
interferujícího iontu na potenciál elektrody)
21
Měření pH - přístroje
• Potenciálový rozdíl je odváděn vnitřní elektrodou (Ag/AgCl) a měří
se proti referenční argentchloridové nebo kalomelové elektrodě
• Potenciometr s vysokým vstupním odporem a digitální indikací;
škála v jednotkách mV nebo pH
• pH metry se skleněnou elektrodou – standardizace na dva základní
roztoky pufrů o pH 4 a 7
pH metr CyberScan 5500
22
Závislost pH na teplotě
Elektrolyty typu 1-1; jejich molalita je vyšší než 10-6
mol·kg-1
 Silné kyseliny a zásady – závislost paH (zde záporný logaritmus
aktivity H3O+ iontů) na teplotě se omezuje na teplotní závislost
aktivitního koeficientu γ
 paH silných kyselin s teplotou mírně roste
 paH silných zásad s teplotou výrazně klesá
m,pm,p
H
T
log
T
pa
















m,pp
w
m,p
H
T
log
T
Klog
T
pa
























velmi malá hodnota
Při 25 °C je rovno -0,033
23
Závislost pH na teplotě
• Pufry
• Rozhodující vliv na průběh pH pufru s teplotou má teplotní
závislost disociační konstanty slabého elektrolytu → závislosti
paH na teplotě mají stejný tvar jako závislost pK na teplotě
• S rostoucí teplotou pH kyselých pufrů roste, zásaditých klesá
Teplotní závislost pH acetátového pufru tvořeného 0,05 M kyselinou octovou a
0,05 M octanem sodným (25 C, pH 4,65)
24
Obecná teorie kyselin a zásad
• Arrheniova teorie (1889)
 Kyselina – sloučenina odštěpující kation H+
 Zásada – sloučenina odštěpující anion OH•
Brønstedova teorie (1923) – Obecná teorie kyselin a zásad•
kyselé nebo zásadité vlastnosti sloučeniny se projevují po její reakci s
rozpouštědlem
 Kyselina – látka schopná odštěpovat proton
 Zásada – látka vázající proton
• V roztoku musí být přítomni současně oba partneři - konjugované páry
• Lewisova teorie – velký význam pro výklad mechanismu organických
reakcí
 Kyselina – akceptor elektronového páru
 Zásada – donor elektronového páru
25
Disociace slabých kyselin a zásad
• Slabá jednosytná kyselina HA: HA ↔H+ + A
Disociační konstanta:
 Stupeň disociace:
• Slabá zásada BOH: BOH ↔B+ + OH
 
  




1
c
HA
AH
K
2
A
 
   



AHA
A

)clogpK(
2
1
pH A 
)clogpK(
2
1
14pH B 
c je celková
koncentrace kyseliny;
α je stupeň disociace
26
Pufry
pH se nemění
pH pufru
27
Pufry
A - vztah pH a složení roztoku pro kyselý a basický pufr, které vycházejí ze slabých
elektrolytů s hodnotami pKA = 4 (křivka 1) a pKB = 4 (křivka 2). Koncentrace obou pufrů je
0.1 M. Na svislé ose je vynesena koncentrace c silné zásady přidané k slabé kyselině, resp.
silné kyseliny přidané k slabé basi. Maximum pufrační kapacity je pro oba pufry označeno
čárkovaně; pro kyselý je to pH odpovídající číselně pKA; pro basický odpovídající hodnotě
(14-pKB).
B – závislost pufrační kapacity na pH pro kyselý pufr znázorněný na panelu A křivkou 1
Pufr má maximální pufrační kapacitu, když je jeho pH rovno pKA použité slabé
kyseliny
28
Amfolyty
• Sloučeniny schopné vystupovat jako kyseliny nebo jako zásady
• Dle klasické Arrheniovy teorie:
HXOH ↔H+ + XOHHXOH
↔HX+ + OH
Reakce amfolytu s vodou: HXOH + H2O↔H3O+ + XOHHXOH
+H2O↔ H2XOH+ + OH
Tyto úvahy platí pro neutrální molekuly; v biologických soustavách jsou
typické amfolyty aminokyseliny
 Vnitřní ionizace aminokyselin: NH2RCOOH ↔NH3
+RCOO-
HXOH
XOHOH
A
c
cc
K 3


HXOH
OHXOHH
B
c
cc
K 2


29
Amfolyty
• Protolytické rovnováhy aminokyselin:
NH3
+RCOO- + H2O ↔ H3O+ + NH2RCOO- , [K1]
NH3
+RCOO- + H2O ↔ NH3
+RCOOH + OH- [K2]
• K1 – schopnost aminoskupiny NH3
+ odštěpovat proton; míra
kyselosti této skupiny
• K2 – míra bazicity karboxylátového aniontu
 Pro vyjádření bazicity aminoskupiny a kyselosti karboxylu
platí rovnováhy: NH2RCOO- + H2O ↔ NH3
+RCOOH + OH-
[K3]
NH3
+RCOO- + H2O ↔ H3O+ + NH3
+RCOO- [K4]
• Hodnoty bazických konstant lze získat pomocí iontového
součinu vody ze vztahů: Kw = K1K3 = K2K4; tedy pK3 = 14 – pK1
apK2 = 14 - pK4
30
Amfolyty
• Isoelektrický bod – charakteristický parametr, významný hlavně u
aminokyselin (AMK) a bílkovin; je to takové pH při němž daná sloučenina
neputuje v elektrickém poli; u AMK splněna podmínka:
• S využitím K1 a K4 (viz. slide 30) získáme:
• Hodnotu isoelektrického pH lze vypočíst:
  RCOONHRCOOHNH 23
cc
RCOOHNHRCOOHNH
RCOONHRCOONH
3
2
41
33
22
c
c
OHaKK






)pKpK(
2
1
)alog(pI 41
2
OH3
 
31
Aminokyseliny jako pufry
• Titrační křivka
Titrační křivka histidindihydrochloridu (–) a jeho pufrační kapacita (-----)
Disociace neutrální
α-karboxylové
skupiny
Disociace
imidazolové a αaminové
skupiny
32
pH tělních tekutin
• Nekontrolované hromadění metabolických produktů
organismu → pokles pH extracelulární tekutiny → narušení
až znemožnění životních dějů
• „Fyziologické pH“ (pH 7,4) – pH krevní plazmy
• Pufrovací (nárazníkové) systémy – umožňují čelit výchylkám
pH mimo referenční interval (7,36 – 7,44)
• Acidémie – pokles pod dolní mez
• Alkalémie – vzestup nad horní hranici referenčního rozmezí
33
Krevní pufry
• A) Fosfátový (HPO4
2-/ H2PO4
-) – podílí se na udržování intracelulární
hodnoty pH; fosfáty jsou hlavní pufrační systém moči, v krevní plazmě
pouze 1% pufrační kapacity (v krvi dominuje hydrogenuhličitanový
systém)
• B) Hydrogenuhličitanový (HCO3
-/H2CO3
-) – klíčový pro udržování pH
krevní plazmy
• H2CO3 ↔H++HCO3
- (pK1 = 3,8 při 37 C), daleko od fyziologického pH –
nedostatečná pufrační kapacita
• Otevřený pufrační systém – prostřednictvím CO2 komunikuje s okolím
 
 32
3
COH
HCO
log8,34,7pH

 3981
cH2CO3 = 5·10-6 mol·dm-3
cHCO3
- = 20·10-3 mol·dm-3
34
Krevní pufry
CO2(rozp.)+H2O Kr
H2CO3
H2CO3
KA
H++HCO3


 .)rozp(CO
COH
K
2
32
r  [H2CO3] = Kr[CO2(rozp.)]
  
 32
3
A
COH
HCOH
K


  
 .)rozp(COK
HCOH
K
2r
3
A


  
 .)rozp(CO
HCOH
KK
2
3
rA

 = Kcelk
pKcelk = 6,31
Plynný CO2 doplňuje ztráty H2CO3 v důsledku její disociace, a tím udržuje pH krve
CO2(g)↔CO2(rozp.) cCO2(rozp) = 1,6·10-3 mol·dm-3
Koncentrace HCO3
- v krevní plazmě = 20·10-3mol·dm-3 a pH 7,4
35
Krevní pufry
C) Bílkovinné pufrující systémy
Bohrův efekt – v plicích uvolňuje HbO2 ionty H+, a tím porušuje rovnováhu mezi
rozpuštěným HCO3
- a CO2 ve prospěch vzniku CO2, jenž je vydechován; v tkáních se
naopak hemoglobin stává po uvolnění kyslíku akceptorem protonů a pufruje kyselinu
uhličitou vznikající metabolickými procesy
Hemoglobin
H2CO3 H++HCO3
HbO2
+ H+ (Hb)H+ + O2
36
Hondoty pH některých tělních
tekutin dospělého člověka
Tělní tekutina pH Tělní tekutina pH
Krevní plasma 7,34-7,43 Střevní šťáva 6,1-7,3
Lymfa 7,2-7,6 Slzy 7,35
Moč 4,8-7,5 Pot 3,8-6,8
Sliny 5,8-7,1 Sperma 6,9-7,4
Žaludeční šťáva ≈ 2,0 Mateřské mléko 6,6-7,0
Duodenální
šťáva
7,5-8,8 Cytoplasma
jaterních buněk
6,4-6,5
Žluč 6,2-8,5 Cytoplazma
centrálního
nervstva
6,7-6,9
37
Metody studia proteolytických
rovnovah v roztoku
38
Potenciometrie
• Elektrochemická metoda – měří se rovnovážné napětí E
galvanického článku
• Skleněná elektroda – měrná elektroda
• Argentchloridová a kalomelová elektroda – referenční
elektrody
• Nernstova rovnice:
ox
red0
ox/red
a
a
ln
nF
RT
EE 
39
Přímá potenciometrie
 Využívá se ke stanovení obsahu sloučenin, kde máme k
dispozici příslušné indikační elektrody
 Srovnání napětí měrného článku ve vzorku s napětím téhož
článku, ponořeného do standardního roztoku analytu
40
Potenciometrická titrace
• Nepřímá potenciometrie
• Sledování závislosti napětí článku na objemu přidávaného
titračního činidla
• Acidobazické titrace – skleněná elektroda
• Srážecí titrace – stříbrná elektroda, ISE
• Komplexometrické titrace – ISE
• Redoxní titrace – platinová redoxní elektroda
• Grafické vyjádření: titrační křivka esovitého tvaru
• Určení bodu ekvivalence: a) druhá derivace titrační křivky
• b) Granova transformace
• c) Samsonkova metoda
41
Potenciometrická titrace
• Potenciometrická titrační křivka
Titrace 0,1M HCl 0,1M NaOH
-400
-300
-200
-100
0
100
200
300
0 2 4 6 8 10 12
V [ml]
E[mV]
42
Granova transformace
• Titrace silné kyseliny silnou bazí
• Podmínka ekvivalence:
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
V [ml]
F
0oBe cVcV 
  VV
cV
VV
cV
H
0
B
0
00






43
Granova transformace
• Granova funkce před bodem ekvivalence
• Pro linearizaci části titrační křivky před bodem ekvivalence
lze použít transformaci:
  VV
)VV(c
H
o
eB



)VV(c)VV(10 eBo
pH

pH
o1 10)VV(F 

F1
F1
44
Granova transformace
• Granova funkce za bodem ekvivalence
  VV
)VV(c
OH
o
eB



)VV(c)VV(10 eBo
)14pH(

• Pro linearizaci části titrační křivky za bodem ekvivalence
lze použít transformaci:
)14pH(
o2 10)VV(F 

F2
45
Aplikace potenciometrické titrace
• Studium protonačních rovnovah NK a jeho složek (purinové a pyrimidinové
báze) a derivátů purinů (cytokininy) ve vodných i směsných roztocích (%
(v/v)CH3OH – H2O) a stanovení disociační konstanty pKa s využitím stupně
ztitrování z
 Závislost disociační konstanty na teplotě umožňuje stanovit
termodynamické parametry ΔH a ΔS
 Lze stanovit i konstanty stability komplexů β uvedených ligandů s
biogenními dvojmocnými kovy Cu2+, Zn2+
  






 
z1
z
logHlogpKa1
  




 
 
z
z1
logHlogpKa2
 MK
K´K



K - zdánlivá protonační konstanta (ligand + kov)
K – protonační konstanta ligandu
[M] – koncentrace kovu
46
Aplikace potenciometrické titrace
• Purinové báze: adenin a guanin
• Pyrimidinové báze: cytosin, thymin, uracil
N
NH
NH
N
NH2
O
adenin guanin
N
NH
NH2
O NH
NH
O
O
CH3
NH
NH
O
O
cytosin thymin uracil
5
4
6
N
3
N
1
2
NH
9
8
N
7
NH2
47
Potenciometrická titrace -
instrumentace
• Automatický titrátor Titrando 835, Metrohm
• Různé objemy byret (1 - 20 ml)
• Možnost titrace ve vodných i vodně- alkoholických prostředích
• Software Tiamo 1.2
• Možnost vytvoření vlastní titrační metody (MET U – monotonic endpoint
titrations)
• Možnost nastavení vlastního titračního módu vybrané metody (OPTIMAL)
• Volitelný přídavek titračního činidla
• LL Ecotrode plus
• Inertní argonová atmosféra; temperace
48
byreta
nádoba s odměrným
roztokem
kapilárka
přívod argonu
LL Ecotrode
plus
hlava byrety
magnetická
míchačka
temperovaná
nádobkaAutomatický titrátor
Polarografie
•1922 – Jaroslav Heyrovský
•Elektrolýza elektroaktivní látky v roztoku základního elektrolytu
•Potenciál se vkládá mezi pracovní (Hg) a referenční elektrodu
(Ag/AgCl/3M KCl)
•Polarografická vlna
•Polarizace elektrody
Polarografické (voltametrické)
proudy
Nabíjecí proud (Ic)
• Důležitý při nabíjení elektrodové dvojvrstvy
• Nefaradayický charakter
Migrační proud
• Spojený s transportem elektroaktivní látky k povrchu elektrody
• Eliminován přídavkem nadbytku základního elektrolytu
Difúzní proud (Id)
• Pro reakce, kde je rychlost určujícím krokem (rate determining step; rds)
difúze
• 1934 – Dionýz Ilkovič
x
c
zFAD
dt
dn
zFId



cmkzFDI 6/13/22/1
D

Illkovičova rovnice
Cyklická voltametrie a voltametrie s lineárně se
měnicím potenciálem
• Elektrolýza elektroaktivní látky v nadbytku základního elektrolytu
• Tří-elektrodové zapojení
•dE/dt (rychlost polarizace)
• Voltametrické signály mají tvar píku
• Studium redoxních reakcí – mechanismus elektrodové reakce a reversibilita
Cyklická voltametrie
•Reversibilní procesy: Randles – Ševčíkova rovnice
2/10
ox
2/12/35
p vcADn1069,2I 
kde Ip je proud píku(A); n počet elektronů; A efektivní plocha elektrody (cm2); D je
difúzní koeficient (cm2/s); cox koncentrace elektroaktivní látky(mol/cm3) a v je rychlost
polarizace (V/s).
•Ireversibilní procesy: Delahayova rovnice
  2/1v0
oxc2/1DA2/1
ann51099,2pI  
kde α je koeficient přenosu náboje; na je počet přenesených elektronů v rychlost
určujícím kroku(rds)
53
Eliminační voltametrická
procedura (EVP)
• Eliminační voltametrická procedura (EVP) – rozvíjela se současně
s eliminační polarografií (EP), však ve srovnání s EP je EVP
snadnější, rychlejší a lze ji aplikovat i na pevné elektrody
• EVP – matematická procedura eliminující/zachovávající některý z
dílčích voltametrických proudů (difúzní, nabíjecí, kinetický) z
naměřených LSV nebo CV křivek
• Eliminační funkce jako lineární kombinace celkových proudů
měřených při různých rychlostech polarizace
54
2. podmínka
   vWEYI jjj 


k
j
jII
1
I = Id + Ik + Ic + ...…
1. podmínka
0
ν)E(YI kk 
1
ν)E(YI cc 
21
ν)E(YI dd Id …difúzní proud
Ik …kinetický proud
Ic …nabíjecí proud
xx
νconst.νY(E)I 
-1.45 -1.35 -1.25
25
50
100
200
300
400
500
600
800
1000
f (I) = - 11,657 I1/2 + 17,485 I - 5,8284 I2
Ik + Ic = 0 Id ≠ 0EVP E4
Dvě základní podmínky EVP
d
ref
c
ref
k
ref
vrefv I
v
v
I
v
v
I
v
v
I
2110



























Adsorptivní přenosová rozpouštěcí
voltametrie (AdTSV)
DNA nebo RNA
adsorpce
FA pufr
Oplach v MILI Q vodě
pH 1.8, 5.8 nebo
12.8 ta = 120 s
Voltametrická analýza v
FA pufru; pH 5.8
55
Diferenční pulsní voltametrie
doba kapky
I1
I2
Potenciál,V
čas, t Potenciál, VI2-I1,A
ΔI = I2 – I1
Square-wave voltametrie
•Ramaley a Krause
PotenciálE
Ei
0
Forward
sample
ΔEs
ΔEp
tp
Backward
sample
Čas
ΔI = If - Ib
Itotal
Iforward
Ibackward
58
Přístrojové vybavení
• Elektrochemické analyzátory:
 AUTOLAB PGSTAT 20 (Eco Chemie, Utrecht, The Netherland)
 μAUTOLAB TYPE III (Metrohm, Switzerland)
• GPES Manager 4.9
• Visící rtuťová kapková elektroda (HMDE)
• Polymerní pentelková grafitová elektroda
(pPeGE)
Elektrody
• Visící rtuťová kapková elektroda (HMDE)
•Grafitové elektrody
„Basal plane“ pyrolytická
grafitová elektroda
Polymerní pentelková grafitová
elektroda
Elektrody z pyrolytického grafitu
„Edge plane“ pyrolytická
grafitová elektroda
Vnitřní struktura EPPG a BPPG elektrod
Elektrody z uhlíkových
vláken
Elektrody ze skelného
uhlíku
• Grafitové elektrody
Uhlíkové pastové
elektrody
Borem dopované
diamantové elektrody
• Tištěné elektrody
Nukleové kyseliny
Nukleové kyseliny a jejich složky
N
NH2
O
R
NNH
N
O
O
R
CH3
N
N
N
NH2
R
N
N
N
N
O
R
NH
NH2
3’5’
purine bases
thymine (T)
pyrimidine bases
cytosine (C) adenine (A) guanine (G)
DNA double helix
base
pairs
sugar-
phosphate
backbone
major
groove
minor
groove
Basepairs
C•G
T•A
A
B C
D
O
O
P-O
O
O
baseCH2
2-deoxyribose
phosphate
nucleotide
minor groove
major groove
1953: James Watson, Francis Crick, Rosalind Franklin,
Maurice Wilkins: DNA double helix
1962: Nobel prize (JW, FC, MW)
Explanation of the basic principles of preservation,
transmission and expression of genetic information
64
Vlásenky
LOOP
STEM
A
G A
C G
G C
5' 3'
Tm DNA heptameru = 76 °C
(0.1 M NaCl)
Nejkratší a termodynamicky nejstabilnější vlásenka - DNA
heptamer d(GCGAAGC) – replikční počátky fága ФX 174 and
herpes simplex viru, promotorové oblasti heat – shock genů
bakterie E. coli a rRNA genů
64
65
Vlásenky
• Vlásenky jsou spojeny s rozvojem opakujících se tripletových
sekvencí v DNA řetězci, které jsou spojeny s mnoha
neurodegenerativními chorobami (syndrom fragilního
chromozomu, Huntingtonova choroba, Friedriechova ataxie)
Analýza vlásenek:
d(GCGAAGC): UV, Tm (Hirao 1989, Yoshizawa 1994, 1997), NMR (Hirao
1994, Yoshizawa 1997, Padrta 2002, Sychrovský 2002),
Ramanova spektroskopie (Chraibi 2000), elektroforéza
(Hirao 1989, Yoshizawa 1994, 1997), CD (Hirao 1989), rtg
analýza (Sunami 2004), molekulová dynamika (Nakamura
1999, Padrta 2002), elektrochemie (Trnková 2004)
65
66
G - kvadruplexy
• Stabilizovány G - kvartety (4 molekuly guaninu vázané
Hoogsteenovými vodíkovými vazbami)
• Tvoří se především v přítomnosti Na+ a K+ iontů
• Strukturní polymorfismus
N
N
N
N
N
O
H
H
H
R
N
N
N N
N
O
H
H
H
R N
N
N
N
N
O
H
H
H
R
N
N
NN
N
O
H H
H
R
M+
N
N
N
N
N
O
H
H
H
R
N
N
N N
N
O
H
H
H
R N
N
N
N
N
O
H
H
H
R
N
N
NN
N
O
H H
H
R
M+
66
a) Čtyřřetězcový tetraplex
b) Dvouřetězcový intramolekulární tetraplex
c) Jednořetězcový intramolekulární tetraplex
67
I - motivy
• Hemiprotonizované C – C+ páry jako základní strukturní jednotka
• Tvoří se v slabě kyselém nebo neutrálním pH
• Diabetes mellitus a opakujícíc se tripletové sekvence spojené s
mnoha neurodegenerativními chorobami
• Strukturní polymorfismus
N
+
N
N
O
H
H H
R
N
N
N
O
HH
R
C+
C
N
+
N
N
O
H
H H
R
N
N
N
O
HH
R
C+
C
67
a) Dvouřetězcová struktura
b) Čtyřřetězcová struktura
c) Čtyřřetězcová struktura se značenými konci
Před více než 55 lety, Emil Paleček: DNA polarografie (1960)
Oscillopolarografie
• Hg elektroda: redoxní procesy A,C a G bází
• Uhlíkové elektrody: oxidace purinových a pyrimidinových bází
• Cu elektroda: oxidace cukerných zbytků v NA
Singhal, P.; Kuhr, W. G.: Anal. Chem. 1997, 69, 3552-3557; Anal. Chem. 1997, 69,
4828-4832.
Nukleové kyseliny jsou
elektroaktivní
Elektrochemie NA a ODNs
Paleček, E., Bartošík, M.:
Electrochemistry of Nucleic
Acids. Chem. Rew., 2012
d(GCGAAGC)
DNA
Elektrochemie purinu a purinových derivátů
• Typické elektroaktivní látky
• 1962 - Smith a Elving – první studie elektrochemické redukce purinu a
adeninu pomocí polarografie a coulometrie na Hg elektrodě (DME).
• Dvoukroková dvouelektronová redukce
71
N
1
2
6
N
3
5
4 8
N
7
N
H
9
+2H+
+ 2e-
N
N
N
N
H
H
H
H
+2H+
+ 2e-
N
N
N
N
H
H
H
H
H
H
H
purin 1,6 -dihydropurin
1,2,3,6 -tetrahydropurin
N
1
2
6
N
3
5
4 8
N
7
N
H
9
+2H+
+ 2e-
N
N
N
N
H
H
H
H
+2H+
+ 2e-
N
N
N
N
H
H
H
H
H
H
H
purin 1,6 -dihydropurin
1,2,3,6 -tetrahydropurin
Elektrochemická redukce adeninu
2,3 – dihydropurin (IV)
N
N
NH2
N
N
H
+2H+
+ 2e-
N
N
NH2
N
N
H
H
H +2H+
+ 2e-
N
N
H
NH2
N
N
H
H
H
H
H
-NH3 N
N
H
N
N
H
H
H
+2H+
+ 2e-
N
N
H
N
N
H
H
H
H
H
H
H2ON
N
N
N
H
H
H
H
H
OH
H
6-aminopurin (I)
1,6 – dihydro – 6 – aminopurin
(II)
1,2,3,6 – tetrahydro – 6 – aminopurin
(III)
1,2,3,6 – tetrahydropurin (V)(VI)
2,3 – dihydropurin (IV)
N
N
NH2
N
N
H
+2H+
+ 2e-
N
N
NH2
N
N
H
H
H +2H+
+ 2e-
N
N
H
NH2
N
N
H
H
H
H
H
-NH3 N
N
H
N
N
H
H
H
+2H+
+ 2e-
N
N
H
N
N
H
H
H
H
H
H
H2ON
N
N
N
H
H
H
H
H
OH
H
6-aminopurin (I)
1,6 – dihydro – 6 – aminopurin
(II)
1,2,3,6 – tetrahydro – 6 – aminopurin
(III)
1,2,3,6 – tetrahydropurin (V)(VI)
•Smith a Elving (1962)
•6 e- redukční proces je doprovázen
deaminačním procesem (př. coulometrie)
• Polarografická redukce je ukončena v
bodě III (tvorba 1,2,3,6-tetrahydro-6-
aminopurinu)
•Problém redukce adeninu při pH> 6
Elektrochemická redukce guaninu
guanine 7, 8 - dihydrogenguanine
d(GCGAAGC)
Cathodic part
Anodic part
N
NH
NH2
O
+H+
-H+
N
+
NH
NH2
O
H +2e-
-2e-
NH
NH
NH2
O
+H+
NH
NH
NH2
O
H
-NH3N
NHO
+H+
-H+
N
+
NHO
H
+e-
-e-
N
NHO
H
+H+
+e-
1/2
N
NHO
H
H
N
NH O
H
H
N
NHO
H
H
H
(I) (II) (III)
(IV)(V)
(IX)
(VI)
(VII) (VIII)
N
NH
NH2
O
+H+
-H+
N
+
NH
NH2
O
H +2e-
-2e-
NH
NH
NH2
O
+H+
NH
NH
NH2
O
H
-NH3N
NHO
+H+
-H+
N
+
NHO
H
+e-
-e-
N
NHO
H
+H+
+e-
1/2
N
NHO
H
H
N
NH O
H
H
N
NHO
H
H
H
(I) (II) (III)
(IV)(V)
(IX)
(VI)
(VII) (VIII)
Elektrochemická redukce cytosinu
•Elving (1972)
•Redukce je započatá rychlou protonizací
cytosinu (I) v N-3 poloze na elektroaktivní formu
(II). Dvouelektronová redukce N-3=C-4 následuje
a tvoří se karbanion (III)
•Redukce v polarografii a voltametrii je ukončena
tvorbou 4-amino-3,4-dihydrogenpyrimidine-2-on
(IV)
•Jiné meziprodukty lze získat s využitím
elektrolýzy nebo coulometrie
-2.00
-1.80
-1.60
-1.40
-1.20
-1.00
-0.80
-0.60
-0.40
-0.20
0.00
-1500 -1400 -1300 -1200 -1100 -1000
I/mA
E /mV
pH 1.55
pH 1.84
pH 2.15
pH 2.72
pH 3.22
pH 4.24
pH 4.85
pH 5.61
pH 6.14
pH 7.2
Elektrochemická oxidace adeninu
N
N
N
N
H
NH2
+H2O
-2H+
- 2e-
N
N
H
N
N
H
NH2
O
+H2O -2H+
- 2e-
N
N
H
NH
N
H
NH2
O O
N
N
H
N
N
NH2
O O
-2H+
- 2eadenin
2 – oxyadenin
2,8 – dioxyadenindiimin
N
N
N
N
H
NH2
+H2O
-2H+
- 2e-
N
N
H
N
N
H
NH2
O
+H2O -2H+
- 2e-
N
N
H
NH
N
H
NH2
O O
N
N
H
N
N
NH2
O O
-2H+
- 2eadenin
2 – oxyadenin
2,8 – dioxyadenindiimin
0
10
20
30
40
50
60
700 800 900 1000 1100 1200 1300
I/µA
E/mV
3,14 3,29
3,67 4,16
4,55 5,10
5,35 5,80
6,80 7,54
•Dryhurst, Compton
•6e- and 6 H+ elektrodový proces
76
(V.Sharma, F. Jelen and L. Trnkova: Sensors, 2015, 15(1), 1564-1600)
77
The complex formation and its oxidation can be described by the following scheme:
1. Cu(II) + e- → Cu(I) (at a deposition potential of 0.15 V)
2. Cu(I) + purine → [Cu(I)-purine] (in the reaction layer on PeGE surface)
3. [Cu(I)-purine] → [Cu(I)-purine]ads (adsorption of the complex)
4. [Cu(I)-purine]ads – e- → [Cu(II)-purine]ads (oxidative stripping, peak OxCom)
5. [Cu(II)-purine]ads – e- → purineox + Cu(II) (oxidative stripping, peak Ox)
Figure 6: Concentration dependence of 1-mXan in the solution with constant concentration
of Cu(II) ions, cCu = 20 µM , reference scan rate 400 mV/s; phosphate-acetatebuffer pH 5.1
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
I[µA]
E[mV]
Formation of the complex Cu(I)-1-mXan
0 µM
0.5 µM
1 µM
2 µM
3 µM
5 µM
7.5 µM
10 µM
15 µM
20 µM
40 µM
0
40
80
120
160
0 10 20 30 40
I[µA]
c[μM]
Elektrochemická oxidace guaninu
NH
NNH2
O
N
N
H
+H2O
-2H+
- 2e-
NH
NNH2
O
NH
N
H
O
-2H+
- 2e-
2H+
+ 2e-
NH
NNH2
O
N
N O
guanin 8 – oxyguanin
diimin
NH
NNH2
O
N
N
H
+H2O
-2H+
- 2e-
NH
NNH2
O
NH
N
H
O
-2H+
- 2e-
2H+
+ 2e-
NH
NNH2
O
N
N O
guanin 8 – oxyguanin
diimin
• Dryhurst
•4e- a 4 H+ elektrodový proces
0
10
20
30
40
50
60
70
500 700 900 1100 1300
I/µA
E/mV
G pH 3.12 G pH 3.3 G pH 3.71
G pH 4.12 G pH 4.64 G pH 5.06
G pH 5.35 G pH 5.7 G pH 6.81
G pH 7.54
Proteiny
Proteiny jsou elektroaktivní
• První biomakromolekuly studované pomocí elektrochemických metod
• Herles a Vančura – polarografická studie lidských tělních tekutin (krevní sérum,
moč). „Prenatriová vlna“ – Katodická vlna vyskytující se při potenciálu
pozitivnějším (300 mV) než je potenciál redukce sodných iontů. Předběžně je tato
vlna přiřazována proteinům
• Heyrovský a Babička – albumin v přítomnosti amonných iontů tvoří v dc
polarografii tzv. „prenatriovou vlnu“ (H peak), způsobenou katalytickým
vylučováním vodíku
• „Prenatriová vlna“ není vhodná pro analytické účely
Polarographic catalytic waves of human serum. (2) the
“presodium” catalytic wave in 0.1 M ammonia/ammonium
chloride
Brdičkova katalytická reakce (BCR)
•1933 – Brdičkova katalytická reakce – polarografická dvojvlna proteinů obsahujících Cys
zbytky v pufrovaných roztocích kobaltu (Brdičkova soluce – amonný pufr NH4OH + NH4Cl a
komplex kobaltu [Co(NH3)6]Cl3)
•Původně navržená pro detekci látek bohatých na síru, jako jsou organické látky
(2- mercaptopropionic acid, 2-diethylaminoethanethiol hydrochloridum), aminokyseliny
(cystein, cystin) a bílkoviny (albumin)
•Aplikace Brdičkovy katalytické reakce v klinické medicíně a farmakologii (diagnostika
rakoviny)
•Mechanismus elektrodového procesu Brdičkovy reakce není detailně znám, ale
předpokládá se, že komplex Co(II) s –NH2 and –SH skupinami hraje klíčovou roli
Polarographic catalytic waves of human serum.
(4) the catalytic double-wave in Brdička
solution
Co je katalytické vylučování
vodíku (CHER)?
2PH(surf) + 2e- → 2P(surf)
+ H2(g)
P(surf)
+ BH(aq)↔ PH(surf) + B-(aq)
PH a P-: protonizovaná/deprotonizovaná forma AMK zbytků v molekule proteinu
BH je kyselá složka pufru; B- je její konjugovaná báze
• Reakce naznačují, že katalyzátorem je protein ukotvený na povrchu elektrody
• Cys, Lys, Arg a His zbytky v molekule proteinu jsou schopny katalyzovat vylučování vodíku
na Hg elektrodě
•Elektrochemický jev způsobený katalyzátorem, v jehož přítomnosti se vodík vyvíjí na
katodě polarizované do méně negativních potenciálů, než v nepřítomnosti katalyzátoru
•Vyvíjení vodíku je produkováno katodickým katalytickým proudem
•Intenzita proudu závisí na koncentraci katalyzátoru a na jeho kinetické katalytické
účinnosti
H pík
• V posledních letech – tzv. „prenatriová vlna“ (J. Heyrovský) v kombinaci s CPSA
(chronopotenciometrická stripping analýza) na stacionární a chemicky modifikované
Hg elektrodě (zahrnuty amalgámové elektrody) – vhodný nástroj pro analýzu proteinů
• Katalytický signál - H pík (objevený díky CHER; pojmenovaný podle J. Heyrovského) –
je citlivý na strukturní a konformační změny proteinů
• H pík (pro proteiny) využitý pro sledování denaturace, agregace, interakce s
nízkomolekulárními ligandy DNA; strukturní změny jako výsledek mutace a redoxního
stavu
CPSA – chronopotenciometrická
stripping analýza
)(Ef
dt
dE

Elektrochemická oxidace proteinů
• Volné AMK (Cys, His, Met, Tyr a Trp) se oxidují na uhlíkových elektrodách
• Proteiny jsou oxidovány na uhlíkových elektrodách (CPSA)
• Tyr a Trp zbytky v molekule proteinu poskytují oxidační signál na uhlíkových
elektrodách→ studium DNA-protein interakce, rozlišení fosforylované a
nefosforylované formy, membránové Na/K pumpy, stanovení inzulinu a α-synukleinu
(důležité pro Parkinsonovu chorobu)
OH
NH2
O
OH -2e, -2H+
NH2
O
OH
O
Tyrosin
-2e, -2H+
N
H
NH2
OH
O
N NH2
OH
O
Tryptofan
Tyr
Trp
Bartošík M., Paleček E., Vojtěšek B.: Klin Onkol, 2014, 27 (Suppl 1), S53-S60
Proteiny jsou elektroaktivní
•Externí značení proteinů (citlivá detekce specifických proteinů ve směsi jiných molekul)
Immunoassays (ELISA)
•Nanotechnologie – nanočástice, nanotrubičky
•Aptamery
Bartošík M., Paleček E., Vojtěšek B.: Klin
Onkol, 2014, 27 (Suppl 1), S53-S60
Bartošík M., Paleček E., Vojtěšek B.: Klin
Onkol, 2014, 27 (Suppl 1), S53-S60