Hmotnostní spektrometrie v proteomice Základy proteomiky, C8202 Laboratoř funkční genomiky a proteomiky Národní centrum pro výzkum biomolekul Přírodovědecká fakulta MU CEITEC-MU Zbyněk Zdráhal Výzkumná skupina Proteomika, CEITEC-MU Centrální laboratoř-Proteomika, CEITEC-MU Laboratoř funkční genomiky a proteomiky, NCBR PřF zdrahal@sci.muni.cz Úvod 01 Úvod DNA protein funkční protein mRNA Posttranslační úpravy posttranslační modifikace (fosforylace, glykosylace aj.) Proteinové komplexy transkripce posttranskripční úpravy (alternativní sestřih aj.) translace Proteomika – disciplína zabývající se analýzou proteomu co se může stát co se opravdu děje * z každého genu může vzniknout několik proteinů, resp. jejich forem, které nelze indikovat na základě analýzy DNA resp. mRNA * neexistuje přímá korelace mezi obsahem mRNA a výsledným obsahem proteinů C8202 self-portrait-or-desperate-man-gustave-courbet The Desperate Man, Gustave Courbet, 1844-45 Analýza proteomu protein-X protein protein W-protein-Z X charakterizace všech proteinů včetně všech jejich forem v buňce (tkáni, organizmu) v daném čase za daných podmínek C8202 Úskalí analýzy proteomu * komplexita - proteinů je podstatně víc než genů lidský genom obsahuje ~21 000 genů, ale lidský proteom může obsahovat ~ 1 000 000 proteinů (včetně všech forem - izoformy, PTMs) (http://www.expasy.org/sprot/hpi/hpi_desc.html) ~ 10 000 proteinů v buňce v každém okamžiku * široký rozsah koncentrací proteinů (~ 10 řádů) nutnost účinné separace majoritních proteinů od minoritních, chybí obdoba PCR reakce používané pro amplifikaci DNA * široké spektrum fyzikálně-chemických vlastností * analýza komplexů pro úplné pochopení buněčných procesů mnohdy nestačí prostá identifikace jednotlivých proteinů, cca 80% je funkčních jako součást komplexů MM900282753[1] C8202 Aebersold R. et al, Nat. Chem. Biol., 14, 206–214 (2018) C8202 Komplexita proteomu Primární struktura (pořadí aminokyselin): …ALEEKYGGFLDKSHKSIVEDYTYFAKVCFDNFGDKVKNWLTFNEPQTFTSFSYGTGVFAPGRCSPGLDCAYPTGNSLVEPYTAGHNILLAHAEAVDLY N… Sekundární struktura (vodíkové můstky) Terciární struktura (skládání) Kvarterní struktura (asociace podjednotek) glu1 Struktura proteinů C8202 C8202 https://gold.jgi.doe.gov/ Nárůst znalosti genomů NCBInr 20081017 7 124 886 sequences ( 2 457 960 432 residues) NCBInr 20141130 53 183 920 sequences (19 144 578 223 residues) NCBInr 20160114 79 354 501 sequences (28 992 349 963 residues) NCBIprot 20180205 139 213 787 sequences (51 013 024 959 residues) Možnosti hmotnostní spektrometrie Základní úkoly MS v analýze proteinů: * Určení hmotnosti intaktních proteinů * Identifikace proteinů (proteinové komplexy) * Určení druhu a místa posttranslační modifikace * Kvantifikace proteinů * * MS imaging * * Studium prostorové struktury (komplementární k NMR) http://i-mass.com/jj2.gif Otec hmotnostní spektrometrie J.J. Thomson, Nobelova cena za fyziku, 1906 C8202 GIGO garbage in garbage out C8202 06 Základy hmotnostní spektrometrie Hmotnostní spektrometrie (MS) Princip metody: * měření poměru m/z iontů analyzované látky m - hmotnost iontu z – počet nábojů Pozn. Kromě vybraných typů ionizace, všechny kroky MS analýzy probíhají ve vakuu, aby bylo zamezeno nechtěným srážkám analyzovaných iontů po cestě ze zdroje do detektoru (střední volná dráha molekul) Výsledek: * hmotnostní spektrum - závislost intenzity iontů na jejich m/z takto určení hmotnosti iontů, v případě molekulárního iontu hmotnost celé molekuly 2955 m/z a.i. Základní operace: * ionizace molekul analyzované látky * separace iontů podle jejich m/z * detekce iontů Iontový zdroj Hmotnostní analyzátor Detektor vakuum vakuum C8202 Průlom v MS proteinů Nové „šetrné“ ionizační techniky (polovina 80. let 20. století) základní předpoklad pro široké využití MS pro analýzu biomolekul (Nobelova cena 2002) MALDI ionizace laserovou desorpcí za účasti matrice ESI ionizace elektrosprejem Koichi Tanaka Shimadzu Corp., Kyoto, Japan John B. Fenn Virginia Commonwealth University, Richmond, USA KARAS M., HILLENKAMP F. Laser Desorption Ionization of Proteins with Molecular Masses Exceeding 10000 Daltons Anal. Chem., 60 (20): 2299-2301 (1988) C8202 Hmotnostní spektrometrie proteinů v současnosti nejrozšířenější technika pro charakterizaci proteomu MALDI nejčastěji v kombinaci s průletovým hmotnostním analyzátorem – TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry) MALDI - TOF MS MALDI – TOF/TOF MS ESI standardně v kombinaci s iontovou pastí – IT/Orbitrap (electrospray ion trap mass spectrometry) ESI - IT MS QQQ, Q-TOF, Q-LIT, ICR…. C8202 MALDI-TOF MS analýza Příprava vzorku: * vzorek proteinu je smíchán s nadbytkem matrice * směs je nanesena na vzorkovací destičku a nechá se zaschnout * vzniknou směsné krystaly matrice se vzorkem * vlastní MS analýza matrice je nízkomolekulární látka schopná absorpce laserového záření např. kyselina dihydroxybenzoová (pro UV laser) Výsledek: Ø Šetrná ionizace bez fragmentace Ø Jednoduchá spektra Ø Uchování vzorku na vzorkovací desce H+ Laserový puls C8202 Vzorkovací destička pro MALDI-MS mikromakro 384 pozic vzorek s matricí připravený na analýzu C8202 Desorption-ionization process pictures by courtesy of Dr. Sauerland (Bruker) C8202 Průletový analyzátor (Time-of-Flight, TOF) Separuje ionty dle doby letu analyzátorem, čas je pak přepočten na hmotnost E= ½ mv2 V= s/t E – energie iontu m – hmotnost iontu v – rychlost iontu s – dráha letu t – doba letu iontu Iontům je po ionizaci udělena stejná kinetická energie; současně vstupují do trubice analyzátoru a měří se jejich čas dopadu na detektor MALDI zdroj Detektor Start Cíl m1< m2 < m3 1 2 3 C8202 MALDI - MS/MS MALDI-TOF/TOF hmotnostní spektrometr Ultraflex III (Bruker) C8202 IgG MALDI-MS spektrum IgG 1+ 2+ dimer 1+ C8202 BSA modified vs. std. BSA (cca 5 pmol) MALDI-MS 1+ 2+ dimer mass diff. cca 3 kDa mass resolution: cca 100 1+ C8202 PNI MALDI-MS spektrum peptidu (~fmol) [M+H]+ R ~ 18 000 [M+Na]+ C8202 BD18215_ Identifikace mikroorganizmů pomocí MALDI-MS kultivace extrakce peptidů/proteinů MALDI MS (3 – 20 kDa) PCA analýza databáze MALDI MS profilů identifikace mikroorganizmu taxonomie MALDI-MS profilování C8202 5000 7000 9000 11000 m/z 0 500 1000 1500 2000 2500 a.i. 5000 7000 9000 11000 m/z 0 500 1000 1500 2000 2500 a.i. Alcaligenes faecalis Sphingomonas paucimobilis Aeromonas hydrophila Pseudomonas aeruginosa MALDI-MS spektra (profily) vybraných bakterií již v klinické praxi úspěšnost druhové identifikace ~ 95% MALDI-MS profilování C8202 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Campylobacter fetus subsp fetus CCM 5683 CCM Campylobacter fetus subsp fetus CCM 6210 CCM Campylobacter fetus subsp fetus CCM 5682 CCM Campylobacter coli CCM 6211 CCM Campylobacter jejuni ssp jejuni CCM 6189 CCM Campylobacter jejuni ssp jejuni CCM 6191 CCM Campylobacter jejuni CCM 6214 CCM Campylobacter jejuni ssp jejuni CCM 7212 CCM Corynebacterium pilosum CCM 6140 CCM Corynebacterium urealyticum CCM 3975 CCM Corynebacterium urealyticum CCM 3976 CCM Corynebacterium urealyticum CCM 4186 CCM Finegoldia magna CCM 3785 CCM Streptococcus mitis CCM 7411 CCM Serratia rubidaea CCM 3412 CCM Peptostreptococcus anaerobius CCM 3790 CCM Staphylococcus epidermidis CCM 2124 CCM Staphylococcus epidermidis CCM 2446 CCM Staphylococcus epidermidis CCM 7221 CCM Staphylococcus saprophyticus CCM 3317 CCM Distance Level Grafické vyjádření podobnosti MALDI-MS profilů bakterií L. Tvrzová, A. Teshim, I. Sedláček, M. Lexa, A. Voráč, O. Šedo, A. Kostrzewa, T. Meier MALDI-MS profilování C8202 ESI ionizace Příprava vzorku: * vzorek je v roztoku * roztok je pak dávkován přes vstupní kapiláru do iontového zdroje Ionizace vzorku: * roztok vzorku je vstupní kapilárou zmlžován v komoře iontového zdroje za atmosferického tlaku * ionizace probíhá ve spreji působením vloženého elektrického napětí * vznikají nabité kapičky kapaliny, které během odpařování přechází na vicenásobně nabité ionty * ionty jsou pak vtaženy do vakuové části spektrometru přechodovou kapilárou a dále analyzovány Výsledek: Ø Šetrná ionizace bez fragmentace Ø vícenásobně nabité ionty Ø Snadné spojení se separačními technikami (LC, CE) LC - kapalinová chromatografie; CE - kapilární elektroforéza C8202 MS scan Měření hmotností resp. m/z analyzovaných iontů * zachycení iontů * postupné vypuzování iontů z pasti podle m/z * detekce iontů Iontová past MS/MS scan Analýza fragmentů vybraných iontů * zachycení iontů * vypuzení všech iontů z pasti mimo iontů s požadovaným m/z * excitace a fragmentace vybraných iontů * detekce fragmentů (dceřinných iontů) MM900285287[2] MM900285287[2] MM900285287[2] C8202 Linearni past, citlivost Pepbtb-5 ESI–MS spektrum proteinu + 21 + 12 transformace spektra myoglobin (MW 16 951) C8202 IonFragmentation MS/MS peptidů v peptidy jako polymerní látky jsou spojeny peptidovou vazbou v v při fragmentaci je peptid štěpen přednostně na peptidové vazbě a to tak, že v ideálním případě dojde k rozštěpení všech peptidových vazeb, takže vznikne soubor fragmentů s jednou, dvěma, třemi … aminokyselinami, z rozdílů v m/z (resp. hmotnosti) „sousedních fragmentů“ lze odvodit druh aminokyseliny v vznikají predikovatelné serie iontů (b – y, a – x, c – z), které lze snadno ze známé sekvence peptidu odvodit Schema fragmentace tripeptidu C8202 + + + + b1 b2 b3 b4 b- ion serie + + + + y1 y2 y3 y4 y- ion serie MS peptidů fragmentační mapy pro jednotlivé peptidy MS vs MS/MS [M+H]+ MS/MS peptidů C-terminus N-terminus + DM AA C8202 ESI-MS a MS/MS peptidu (MW 1148.5) MS analýza lze určit hmotnost MS/MS analýza lze určit aminokyselinové složení, jejich pořadí Dvojnásobně nabitý ion peptidu vybrán pro fragmentaci N E V T E C8202 04 LC MS on-line LC-MS/MS ESI-QTOF hmotnostní spektrometr Impact II (Bruker) spojený s kapalinovým chromatografem Ultimate 3000 RSLCnano (Dionex) MS nanoESI HPLC systém C8202 Protein mix digesce 2D - RP 1D - SCX frakcionace step by step 2-D LC MudPit MS/MS MS/MS 1D - RP Protein or mix digesce 1-D LC separace 2-D GE C8202 Krevní plazma (3500 – 9000 proteinů ??) IEF (liq) 20 frakcí 1. rozměr LC (RP) 1600 frakcí 2. rozměr GE (1D/2D) ∞ frakcí 3/4. rozměr from H. Wang, Molecular & Cellular Proteomics, 2005, 4, 618–625. 0. rozměr deplece 2 frakce C8202 21 Metody identifikace proteinů pomocí MS bottom up Identifikace proteinů hmotnostní spektrometrií top down protein (směs) separace digesce (specifickou proteázou) protein (směs) MS MS/MS směsi peptidů separace MS/MS fragmentace Identifikace (DB prohledávání, de novo) C8202 Identifikace proteinů pomocí MS bottom up Standardní postupy: Specifické proteolytické štěpení MS peptidů Srovnání peptidové mapy s databázemi sekvencí Specifické proteolytické štěpení MS/MS peptidů Srovnání fragmentů jednotlivých peptidů s databázemi sekvencí Separace naštěpených peptidů Separace proteinů MALDI-TOF MS Gelová elektroforéza Kapalinová chromatografie ESI-IT MS Kapalinová chromatografie Kapilární elektroforéza peptidové mapování MS/MS Ion Search C8202 Příklad identifikace proteinu pomocí peptidového mapování (peptide mass fingerprinting, peptide mapping) Modrá varianta C8202 A10-2jpg Separace proteinové směsi pomocí dvojrozměrné gelové elektroforézy 1. rozměr Isoelektrický bod Separace proteinů C8202 Proteolytické štěpení (digesce) enzymatické štěpení proteinu na soubor peptidů specifickou proteázou Trypsin štěpí vždy za lysinem (K) a argininem (R), pokud není následující aminokyselina prolin QNGVQMLSPSEIPQRDWFPSDFTFGAATSAYQIEGAWNEDGKGESNWDHFCHNHPERILD GSNSDIGANSYHMYKTDVRLLKEMGMDAYRFSISWPRILPKGTKEGGINPDGIKYYRNLI NLLLENGIEP QNGVQMLSPSEIPQR 1-15 1683.848 Da DWFPSDFTFGAATSAYQIEGAWNEDGK 16-42 3010.317 Da GESNWDHFCHNHPER 43-57 1864.757 Da ILDGSNSDIGANSYHMYK 58-75 1984.907 Da TDVR 76-79 490.262 Da ... Soubor hmotností takto vzniklých peptidů (peptidová mapa) je charakteristický pro daný protein podobně jako otisk palce pro člověka Specifické proteolytické štěpení C8202 MALDI - TOF MS peptidů po digesci proteinu MS spektrum obsahuje hmotnosti peptidů vzniklých digescí vybraného proteinu MS peptidů C8202 Srovnání peptidové mapy s databázemi sekvencí Identifikace proteinu – peptidové mapování databázové prohledávání Naměřená peptidová mapa (soubor hmotností peptidů vzniklých digescí analyzovaného proteinu) je prohledávána proti databázi proteinových sekvencí. Prohledávací program si vytváří teoretickou peptidovou mapu od každé proteinové sekvence v databázi (dle použité proteázy) a postupně je srovnává s experimentálně naměřenou peptidovou mapou našeho analyzovaného proteinu. Výsledkem prohledávání je žebříček proteinů s nejpodobnějšími peptidovými mapami. Míra shodnosti je vyjádřena tvz. skore, všechny proteiny s hodnotou skore vyšší než limitní jsou programem považovány za identifikované. C8202 CAYYVZNB Mascot Search Results 1. S18600 Mass: 47780 Total score: 165 Peptides matched: 12 glutamate-ammonia ligase (EC 6.3.1.2) precursor, chloroplast (clone lambdaAtgsl1) - Arabidopsis thaliana 2. S32228 Mass: 47714 Total score: 76 Peptides matched: 7 glutamate-ammonia ligase (EC 6.3.1.2) precursor - rape - Brassica napus Database : MSDB 20021127 (1019653 sequences) Timestamp : 26 Jan 2003 at 10:36:50 GMT Top Score : 165 for S18600, glutamate-ammonia ligase .... Sequence Coverage: 44% 1 MAQILAASPT CQMRVPKHSS VIASSSKLWS SVVLKQKKQS NNKVRGFRVL 51 ALQSDNSTVN RVETLLNLDT KPYSDRIIAE YIWIGGSGID LRSKSRTIEK 101 PVEDPSELPK WNYDGSSTGQ APGEDSEVIL YPQAIFRDPF RGGNNILVIC 151 DTWTPAGEPI PTNKRAKAAE IFSNKKVSGE VPWFGIEQEY TLLQQNVKWP 201 LGWPVGAFPG PQGPYYCGVG ADKIWGRDIS DAHYKACLYA GINISGTNGE 251 VMPGQWEFQV GPSVGIDAGD HVWCARYLLE RITEQAGVVL TLDPKPIEGD 301 WNGAGCHTNY STKSMREEGG FEVIKKAILN LSLRHKEHIS AYGEGNERRL 351 TGKHETASID QFSWGVANRG CSIRVGRDTE AKGKGYLEDR RPASNMDPYI 401 VTSLLAETTL LWEPTLEAEA LAAQKLSLNV www.matrixscience.com Výsledek databázového prohledávání peptidové mapování Srovnání peptidové mapy s databázemi sekvencí Skore Limitní skore = 58 Červeně jsou vyznačeny úseky sekvence odpovídající přiřazeným peptidům z naměřené peptidové mapy C8202 1799.96 1675.87 1287.59 2539.17 1458.85 1502.76 1117.50 1877.89 1012.50 1576.71 2161.02 3156.32 2638.21 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 4 x10 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 3000 m/z MALDI MS – peptidová mapa MALDI MS/MS – fragmentační mapa peptidu o [M+H]+ 1675.9 Identifikace na základě MS dat vs MS/MS C8202 Příklad identifikace proteinu pomocí LC-MS/MS Zelená varianta C8202 Specifické proteolytické štěpení Proteolytické štěpení Na rozdíl od „modré varianty“ tentokrát je enzymaticky štěpena celá směs proteinů najednou, opět za použití specifické proteázy (obvykle trypsin). Takto vzniklá směs peptidů je pak separována a podrobena MS/MS analýze. C8202 Separace peptidů tryptického digestu směsi proteinů Separace naštěpených peptidů Digest vzorku lidské plazmy separovaný kapalinovou chromatografií spojenou s hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS) C8202 MS/MS spektrum tryptického peptidu (m/z 608.3, 2+) MS/MS peptidů MS/MS spektrum obsahuje fragmenty peptidu vzniklé kolizní disociací v iontové pasti. Fragmenty nesou specifickou informaci o sekvenci peptidu. C8202 Identifikace proteinu – MS/MS databázové prohledávání Naměřené fragmentační mapy (soubory hmotností fragmentů vzniklých při kolizní disociaci jednotlivých peptidů) jsou prohledávány proti databázi proteinových sekvencí. Prohledávací program si vytváří teoretickou peptidovou mapu proteinové sekvence v databázi, po té si od každého peptidu příslušné peptidové mapy připraví teoretickou fragmentační mapu a postupně je srovnává s experimentálně naměřenými fragmentačními mapami analyzovaných peptidů. Takto to provede pro každou proteinovou sekvencí v databázi. Pro každý přiřazený peptid (MS/MS spektrum) je spočítáno individuální skore, hodnota skore vyšší než limitní určuje signifikantní shodu mezi teoretickou a naměřenou fragmentační mapou. Míra shodnosti proteinu je vyjádřena celkovým skore, které je odvozeno z individuálních skore peptidů přiřazených danému proteinu. Srovnání fragmentů jednotlivých peptidů s databázemi sekvencí C8202 Database : SwissProt 51.2 (243975 sequences; 89639744 residues) Taxonomy : Homo sapiens (human) (15175 sequences) Timestamp : 16 Dec 2006 at 16:05:59 GMT Significant hits: AACT_HUMAN Alpha-1-antichymotrypsin precursor (ACT) – Homo sapiens Score Distribution 1. AACT_HUMAN Mass: 47621 Score: 99 Queries matched: 1 Alpha-1-antichymotrypsin precursor (ACT) Homo sapiens (Human) Query Observed Mr(expt) Mr(calc) Delta Miss Score Expect Rank Peptide 1 608.3000 1214.5854 1214.7234 -0.1380 0 99 2.2e-08 1 K.ITLLSALVETR.T Peptide Summary Report Výsledek databázového prohledávání MS/MS Mascot Search Results Limitní skore = 35 Celkové skore Díky variabilitě primární struktury proteinů lze určit jejich “identitu” na základě fragmentace (MS/MS spektra) jediného peptidu. Srovnání fragmentů jednotlivých peptidů s databázemi sekvencí Individuální skore peptidu C8202 Vyhodnocené MS/MS spektrum Z rozdílů m/z (resp. hmotnosti) mezi sousedními ionty příslušné serie (b, y) lze zjistit identitu jednotlivých aminokyselin i jejich pořadí. Pořadí aminokyselin odvozené z fragmentů y-serie C8202 Identifikace proteinu – databázové prohledávání m/z MS srovnání s databázemi + neznámý protein (sekvence není k dispozici, sekvenace de novo) protein je identifikován (protein se sekvencí v databázi) - C8202 43 Charakterizace posttranslačních modifikací Druhy modifikací: * mutace (izoformy proteinů) * * chemické (oxidace, adukty farmak aj.) * * posttranslační (fosforylace, glykosylace aj.) Užitečný přehled modifikací: DeltaMass http://www.abrf.org/index.cfm/dm.home ExPASy - http://www.expasy.ch/ Charakterizace modifikací proteinů Možnosti MS při analýze modifikací proteinů * druh modifikace * vazebné místo * úroveň (zastoupení modifikace na daném místě) * úprava vzorků (frakcionace, enzym. odbourávání aj.) * speciální MS/MS techniky C8202 ESI-MS 165.0 226.8 285.1 334.7 380.1 408.2 447.7 495.0 538.3 569.3 640.4 668.3 873.5 916.9 1076.4 200 400 600 800 1000 1200 m/z 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 7 x10 Intens. 40 Da 165.0 221.9 325.7 408.0 487.7 528.2 578.3 615.6 661.3 920.9 1155.4 200 400 600 800 1000 1200 m/z 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 7 x10 Intens. Fosforylace 1070 1120 1170 m/z 500 1000 1500 2000 2500 a.i. 80 Da MALDI-MS S m/z D m/z = 87 Sphos m/z D m/z = 167 ESI-MS/MS C8202 Glykosylace patatinu C8202 35000 40000 45000 50000 m/z 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 a.i. Daver = 1.2 kDa MALDI-MS celých proteinů C8202 P5_all_zz MALDI-MS tryptických digestů * rozdílový peptid * stejný protein C8202 2900 3100 3300 3500 3700 3900 m/z 100 150 200 250 300 350 400 450 500 a.i. Detail spekter digestů proteinu před a po deglykosylaci PNGase A peptid 3966 zmizel objevil se peptid 2797, vedle peptidu 2795 * N-glykosylace * Daver = 1169 Da číselné hodnoty ve spektru odpovídají [M+H]+ jednotlivých peptidů C8202 2770 2790 2810 m/z 100 150 200 250 300 350 400 450 500 a.i. Detail spekter digestů proteinu před a po deglykosylaci číselné hodnoty ve spektru odpovídají [M+H]+ jednotlivých peptidů C8202 tryptický peptid - 2796 Da …PHIFDYSGS… , kde D vzniká z N po deglykosylaci PNGasou A původní sekvence je tedy …PHIFNYSGS… (hmotnost nemodifikovaného peptidu - 2795 Da) Peptid potvrzen také LCMS/MS analýzou (v glykosylovaném vzorku digestu nebyl nalezen) Hmotnost glykanu 1170 Da odpovídá xylose+fucose+3*mannose+2*N-acetylglukosamin (U. Sonnewald et al., Planta 179 (1989) 171-180) Nebyl dále potvrzen MSMS technikami Shrnutí výsledků C8202 bez inhibitoru deacetyláz H4 e d c b a e d c b a H2B H3 H3 H2A H2A H1 H1 2D gelová elektroforéza (AUT-AU) histonových extraktů s inhibitorem deacetyláz H4 H2B C8202 A A B B C C D D E Histon H4 – detail gelu bez inhibitoru deacetyláz s inhibitorem deacetyláz 4x Ac 3x Ac 2x Ac 1x Ac 0 ?? 1 MSGRGKGGKG LGKGGAKRHR KVLRDNIQGI TKPAIRRLAR RGGVKRISGL 51 IYEETRGVLK VFLENVIRDA VTYTEHAKRK TVTAMDVVYA LKRQGRTLYG 101 FGG LC-MS/MS analýza C8202 Výřez MS/MS (ETD) spektra peptidu GKGGKG LGKGGAKR (3x Ac) 128 128+42 C8202 09 Kvantifikace proteinů Kvantifikace proteinů pomocí MS metody s využitím izotopicky značených sloučenin * absolutní kvantifikace (přídavek interního standardu o známé koncentraci) * * relativní kvantifikace (porovnání změny exprese proteinu ve dvou či více vzorcích pomocí značek o různé hmotnosti) Značky jsou většinou izotopicky značené sloučeniny, které jsou navázány na analyzované proteiny, resp. digestované peptidy nebo jsou do proteinů zabudovány během buněčného růstu. metody založené na statistickém zpracování dat (label free) C8202 Flow_01 Ø AQUA Peptide Selection Ø Order selected peptide isotopically labeled (15N, 13C) Ø Adding labeled peptide to protein mix Ø Digest Ø Analyze by LC-MS/MS to quantitate protein of interest Select an optimal tryptic peptide and stable isotope amino acid from the sequence of your protein of interest Optimize LC-MS/MS separation protocol for quantitation AQUA jen pro vybraný protein Schéma kvantifikačního experimentu absolutní kvantifikace C8202 C8202 Proteinový vzorek B Společná digesce smíchaných vzorků Stejný peptid, odlišen kvantifikační značkou 100% Proteinový vzorek A SILAC, in-vivo LC-MS LC-MS/MS (iTRAQ) ICAT, ICPL, iTRAQ Oddělená digesce vzorků iTRAQ, 16O/ 18O Stejné peptidy v MS modu neodlišeny MS/MS Schéma kvantifikačního experimentu metody relativní kvantifikace 07 A to je konec