Analýza obrazu
Gabriela Lochmanová
StudijníM
ateriály
2
?• Stanovení cíle
experimentu
Definice jasně stanovených otázek – cílů
• potvrzení hypotézy
• soustředění se na úzce vymezený problém
Stanovení počtu a typu replikátů
• umožňují statistické zpracování experimentálních
údajů
Způsob detekce
Postup zpracování vzorku,
kontrolní vzorky, standard
Biologické
• Zahrnutí biologické diverzity
- replikáty prezentovány různými vzorky téhož typu
X rostlinek Arabidopsis,
X různých pacientů se stejným typem nádoru apod.
Technické
• Zahrnutí chyb metody
(reprodukovatelnost)
- stejný vzorek v několika replikátech
StudijníM
ateriály
3
Biologické replikáty
Technické replikáty
StudijníM
ateriály
4
?
Experiment
• Stanovení cíle
experimentu
• Příprava vzorku • 2 DE
• DetekceStudijníM
ateriály
5
• Detekce Obecné požadavky na vizualizaci proteinů
• široký lineární rozsah závislosti
intenzity barvičky na množství
proteinu v gelu
• kompatibilita s následnými
analýzami
(např. stříbro - glutaraldehyd!)
• vysoká citlivost
Dynamický rozsah
= graf závislosti intenzity barvičky (osa y)
na koncentraci proteinu (osa x)
Barvení stříbrem
– lineární závislost pouze v rozmezí
do 100 ng proteinu.
Při vyšších množstvích odklon od linearity.
• kvantitativní barvení
• end-point
• trvanlivost
(např. zhášení fluorescenčních
barviček!)
StudijníM
ateriály
6
• Detekce Typy detekce
• fosforylace: Pro-Q Diamond (pSer, pThr, pTyr), Pierce
phosphoprotein staining kit (pSer, pThr)
glykosylace: Pro-Q Emerald, Pierce glycoprotein staining kit
• Radioaktivní značení
Značení před analýzou (DIGE – CyDye, radioaktivní značení)
Barvení po analýze
Specifické barvení: posttranslační modifikace (PTM)
Nespecifické barvení: všechny proteiny
• Viditelné barvení: Coomassie brilliant blue (R250, G250), stříbro (kyselá x amoniakální varianta)
• Fluorescenční barvení: Sypro Ruby (Ex/Em = 280, 450/610 nm), Lucy (Ex/Em = 506/520 nm),
Flamingo Pink (Ex/Em = 512/535 nm), Oriole (Ex/Em = 270/604 nm), Krypton (Ex/Em = 520/580),
Deep Purple (Ex/Em = 365, 520/610 nm), Lumitein (Ex/Em = 280, 450/610 nm)
Proteinový patern dán typem barvení, protokolem, ak sekvencí
CCB ( G250)
1 2
StudijníM
ateriály
7
POZADÍ – 3D náhled
Koloidní CCB
Stříbro
SYPRO Ruby
• Detekce
StudijníM
ateriály
8
Při analýze obrazu pracujeme s
denzitou barvičky.
• Detekce
Proteinový spot – 3D náhled
Koloidní CCB
Stříbro
SYPRO Ruby
StudijníM
ateriály
9
?
Experiment
• Stanovení cíle
experimentu
• Příprava vzorku • 2 DE
• Detekce
• Snímání obrazu
StudijníM
ateriály
10
• Snímání obrazu
Signály z biologických vzorků jsou konvertovány do
digitálních dat v odstínech šedé barvy
• formát TIFF, vysoké rozlišení
Přístroje pro snímání obrazu
Volba přístroje dle použitého typu detekce proteinů
• Viditelné barvičky : denzitometry
• Fluorescenční barvičky: fluorescenční skenery, kamery
Ex/Em spektrum se musí shodovat s Ex/Em charakteristikami přístroje
PharosFX™ and PharosFX Plus Systems
Molecular Imager GS-800
Fuji FLA-3000
Typhoon 9200 Imager
Image Scanner III
S. Ruby: Ex/Em: 280, 450/610 nm
StudijníM
ateriály
11
?
Experiment
• Stanovení cíle
experimentu
• Příprava vzorku • 2 DE
• Barvení
• Snímání obrazu
• Analýza obrazu
StudijníM
ateriály
12
• Analýza obrazu
Analýza pomocí speciálního SW
• Porovnání a vyhodnocení 2D gelů
(vizuální vyhodnocení 2D gelů není možné)
•Lidské oko dokáže rozlišit
500 stupňů šedi
10 milionů barev
Pouze viditelné světlo o vlnové délce
380–760 nm vyvolává v lidských očích zrakový vjem.
Skoro ½ lidského mozku se podílí na
řízení zraku a vidění.
StudijníM
ateriály
13
• Analýza obrazu Analýza pomocí speciálního SW
Kvalitativní vyhodnocení Kvantitativní vyhodnocení / Statistická analýza
StudijníM
ateriály
14
• Analýza obrazu
• Kvantita spotu
= celková intenzita definovaného spotu v daném zobrazení gelu
(pro výpočet se používá gaussovské zobrazení)
- koresponduje s množstvím proteinu v aktuálním spotu
StudijníM
ateriály
15
• Analýza obrazu Přístup dle předem stanoveného cíle
• Výběr pouze několika cílových proteinových spotů• Výběr všech spotů, které se významně liší podle
daného „designu“ experimentu
– detekce „up and down“ regulovaných proteinů – kvantitativní změny v profilu určitých spotů
• ovlivněný vzorek x kontrola
• projev určitého zásahu v čase
• sekvenční izoformy
• posttranslační modifikace
1DE
Kvalita obrazové analýzy je přímo odvislá od kvality separace.
Prefrakcionace
StudijníM
ateriály
1-DE
16
• Analýza obrazu
Přístup dle předem stanoveného cíle
2-DE
sekvenční izoformy
(záměna 1ak v sekvenci)
různý stupeň PTM
-
+
StudijníM
ateriály
17
• Analýza obrazu Vyhodnocování pomocí PDQuest
Přiřazení spotů („matching“) a jejich porovnání
• Sejmutí obrazu - velké rozlišení (tiff), všechny srovnávané gely musí mít stejnou velikost
Úprava obrazu – velikost, orientace
Identifikace spotů
Normalizace
Analýza dat
Report
StudijníM
ateriály
18
• Analýza obrazu Vyhodnocování pomocí PDQuest
• Spot detection wizard
– průvodce nastavením parametrů pro vyhledání
spotů a odfiltrování pozadí
• Různé gely – různé parametry nastavení
Sejmutí obrazu
Úprava obrazu
Identifikace spotů
Přiřazení spotů („matching“) a jejich porovnání
Normalizace
Analýza dat
Report
StudijníM
ateriály
19
šum
(„noise“)
proužky
(„streaking“)
rozostření
(„fuzzy spots“)
nízkoabundantní spoty
(„low-abundant spots“)
• Analýza obrazu Běžné anomálie 2D separace
Goez et al. 2017 (upraveno)
saturace
(„saturated spot“)
překryv
(„spot overlap“)
StudijníM
ateriály
20
Saturace Překry spotů Proužky
Rozostření Nízkoabundantní spoty Šum
StudijníM
ateriály
21
• Analýza obrazu Vyhodnocování pomocí PDQuest
Detekce spotů a filtrace pozadí
• Scanset
= soubor obrazů, které vycházejí z jednoho
základního gelu (3 zobrazení každého gelu)
Filtered GaussianRaw 2D image
Pozadí se lokálně mění dle intenzity přítomných proteinových spotů
(intenzivnější spoty ~ vyšší pozadí) chyby v detekci.
StudijníM
ateriály
22
• Analýza obrazu Vyhodnocování pomocí PDQuest
• Zásadní problém analýzy obrazu: rozdíly v pozici spotu mezi gely – třeba provést „alignment“
Sejmutí obrazu
Úprava obrazu
Identifikace spotů
Přiřazení spotů („matching“) a jejich porovnání
Normalizace
Analýza dat
Report
•Matchset = soubor gelů porovnávaných
navzájem v rámci experimentu
• Master gel = uměle vytvořený gel, zahrnuje
spoty ze všech srovnávaných gelů
StudijníM
ateriály
23
• Analýza obrazu Vyhodnocování pomocí PDQuest
• Normalizace = kompenzace rozdílů ve velikosti a intenzitě spotů mezi gely,
které nesouvisí s expresí
• nutná podmínka pro správné porovnání kvantity spotů
• Variace způsobené různými faktory:
- chyby pipetování během přípravy vzorku
- chyby při přípravě a zpracování vzorku
- ztráta vzorku během přenosu na gel (precipitace)
- nekonzistence v barvení/značení
- nekonzistence při snímání obrazu
- …..
• Normalizační faktor (dle zvolené metody)
• Total quantity in analysis set
• Total quantity in valid spots
• Total density in gel image
• Specified value
• Mean of log ratios
• Local regresion model
Sejmutí obrazu
Úprava obrazu
Identifikace spotů
Přiřazení spotů („matching“) a jejich porovnání
Normalizace
Analýza dat
Report
StudijníM
ateriály
24
• Analýza obrazu
• Report
Image report Quantity Table report Quantity Graph report
Vyhodnocování pomocí PDQuest
StudijníM
ateriály
25
?
Experiment
• Stanovení cíle
experimentu
• Příprava vzorku • 2 DE
• Barvení
• Snímání obrazu
• Analýza obrazu
• Vyřezání spotů
StudijníM
ateriály
26
CZ.1.07/2.3.00/30.0009
Employment of Newly Graduated Doctors of Science for Scientific Excellence
Manuálně (skalpel, spot picker)
• viditelné barvičky
• fluorescenční barvičky
- transiluminátor
Automaticky
• Spot cutter
• Vyřezání spotů
OneTouch Plus spot picker
Exquest
UV-transilluminator
(Ex: 302, 365 nm)
Ettan Spot picker
Dark Reader
(Ex: 490 nm)
Xcise
StudijníM
ateriály
27
?• Stanovení cíle
experimentu
• Příprava vzorku • 2 DE
• Barvení
• Snímání obrazu
• Analýza obrazu
• Vyřezání spotů • Digesce • Identifikace
• Cíl experimentu
??
StudijníM
ateriály
28
2-DE
• Nejlepší metoda vizualizace proteinů v podobě spotu, který může být charakterizován svojí
abundancí, polohou, přítomností / absencí.
• Nejčastější abnormality ovlivňující obrazovou analýzu:
vertikální a horizontální proužkování, rozostření spotů, saturace spotů, spoty o nízké intenzitě,
překryv spotů, šum pozadí.
• Laboratorní a časová náročnost, omezená reprodukovatelnost, omezené rozlišení (1 spot = 1 protein!).
StudijníM
ateriály
Děkuji za pozornost.
Central European Institute of Technology
c/o Masaryk University
Žerotínovo nám. 9
601 77 Brno, Czech Republic
www.ceitec.eu | info@ceitec.cz
StudijníM
ateriály