CG080 – Metody v genomice a proteomice Analýza protein-proteinových interakcí doc. Jan Paleček jpalecek@sci.muni.cz rozšiřující přednáška: Struktura a funkce proteinových komplexů (CG030) Informační zdroje Golemis a Adams: Protein-protein interactions … … z praxe, nejnovější metody z odborné literatury … Database protein-proteinových interakcí: http://string-db.org/newstring_cgi ... http://www.ebi.ac.uk/intact/?conversationContext=1 Metody analýzy proteinových komplexů - ultracentrifugace, gelová filtrace, - TAP-tag (a jiné tagy) purifikace a MS analýza - ko-imunoprecipitace, pull-down, ko-purifikace … - cross-linking MS, (cryo) elektronová mikroskopie … Metody analýzy protein-proteinových interakcí - martix/beads-based: pull-down (in vitro), coIP … - hybridní: Y2H (kvasinkový 2-hybridní), BiFC … - MS-based: painting, H-exchange … - proximity-based: FRET, PLA … - ko-krystalizace, NMR analýza … - in silico metody (docking) - kvantitativní: SPR, ITC … … - databáze (interactom a komplexy …) - genetické metody (syntetická letalita, suprese) vúvodnípřednášce„Strukturaafunkce proteinovýchkomplexů“ mapováníbinárníchinterakcí Hybridní! Metody analýzy protein-proteinových interakcí - matrix/beads-based: - ko-imunoprecipitace - ko-purifikace – gelová filtrace - pull-down - analýza proteinových domén - analýza interakčních povrchů - použití peptidů - mapování interakcí - hybridní: Y2H (kvasinkový 2-hybridní), BiFC … - MS-based: painting, H-exchange … - proximity-based: FRET, PLA … - ko-krystalizace, NMR analýza … - in silico metody (docking) - kvantitativní: SPR, ITC … … - databáze (interactom a komplexy …) - genetické metody (syntetická letalita, suprese) mapováníbinárníchinterakcí Tagy (a protilátky): Myc, FLAG, V5, S-tag, Streptactin (biotin-streptavidin), < Western (anti-GST) Podobný princip jako při ko-purifikaci in vitro TNT (Transcription and Translation) systém methionin S35 (2 partneři) výhody: - není třeba proteiny purifikovat - není třeba protilátky k detekci - není toxický efekt pro buňky - lépe rozpustné … Charakterizace interakcí - domény Sergeant et al, MCB, 2005 Doyle et al, Mol Cell, 2010 Ubírat či přidávat SMC5= Spr18 MS spektrum celého proteinu (normální pokrytí sekvence) MS spektrum precipitátu (obohacená interakční část) P. Reichman (Diplomová práce) Další MS metody dále … Charakterizace interakcí – detailní mapování 1 2 3 4 1 2 3 4 Podobně jako při ELISA jamky jsou potažené streptavidinem peptidy se přes biotin ukotví Lze mapovat epitop pro protilátky (vazbu) Peptidy jsou na N-konci biotinylované Peptidové mapování Charakterizace interakcí – peptidové mapování Podobně jako při ELISA jamky jsou potažené streptavidinem peptidy se přes biotin ukotví Guerineau et al, PLoS One, 2012 Peptidové mapování Analýza Nse3-Nse4 interakce Délka: 25 AMK Posuv: 5 AMK Knihovna: 18 peptidů Nse4 peptidy 90 AMK Charakterizace interakcí – „alanin scan“ EID2 peptidy (paralog Nse4) Délka: 25 AMK Posuv: mutace po 1 AMK Knihovna: 20 peptidů A Guerineau et al, PLoS One, 2012 zmapována vazba šroubovice/string mutace (disrupce) ukáží, které AMK jsou důležité pro interakce (nebo strukturu) Jak je šroubovice orientována? Mohou mutace vylepšit interakčních schopnosti? Viz dále … Guerineau et al, PLoS One, 2012 Mutace - mapování interakcí - maleimidy reagují se sulfhydrylovou skupinou Cys (kovalentní - ve většíně proteinů je málo cysteinů – lze využít pro cílený crosslink - cílené mutace na Cys - na SDS-PAGE lze detekovat XL Mapování interakcí - crosslinking více o crosslink ještě dále v MS metodách protein 1 crosslink protein 1 s proteinem 2 intenzita koreluje se vzdáleností Metody analýzy protein-proteinových interakcí - beads-based: pull-down (in vitro), coIP … - hybridní: - transkripční 2-hybridní systém - domény - reverzni systém – analýza PPI - více-hybridní systémy - inhibice PPI - membránový systém - pathway - komplementační systémy - fold - BiFC, DHFR - MS-based: painting, H-exchange … - proximity-based: FRET, PLA … - kvantitativní: SPR, ITC … - ko-krystalizace, NMR analýza … - genetické metody (syntetická letalita, suprese) - databáze (interactom a komplexy …) Literatura: Protein-protein interactions, Golemis & Adams, CSHL Press, 2005 Uetz and Finley, 2005 Traven et al.: EMBO Report, 2006 Při studiu mechanismů transkripce v kvasinkách S. cerevisiae byl vyvinut tzv. Y2H Na spínaní/regulaci metabolismu galaktosy se podílí transkripční faktor Gal4p – váže specifické sekvence v UAS genů (Gal enzymů) a aktivuje jejich transkripci Dvou-hybridní systémy (kvasinkové) Paleček: Biologie kvasinek (C9045), Str.& Fun. Prot komplexů (CG030) Gal4p Transkripční komplex Luban & Goff, CO Biotech, 1995 DB DB AD AD DB AD DB AD Y2H - DNA-vazebná doména (DB) bez aktivační domény (AD) není schopna aktivace transkripce Je možné propojit domény jakýmkoli linkerem a transkripci reaktivovat Gal4p DB AD DB AD Systém vhodný i pro pull-down Y2H myc Tag plasmid (TRP1) plasmid (LEU2) Transformace plasmidů do kvasinek MaV203 kmen navíc obsahuje URA3 reporter gen – lze tedy selektovat na uracilovou auxotrofii + reversní systém tj. mutanty disruptující interakce (na FOA) - Testuje se schopnost růstu kvasinek na médiu bez histidinu (nebo adeninu – červená/bílá) - lze použít i pro hledání proteinových interakčních partnerů (screen knihovny) Kvasinkový kmen kvantitativní auxotrofie (media bez …) FACSorting rezistence (media s aureob) Reportérové geny Stynen et al, Microbiol Mol Biol Rev, 2012 His3 His3 Nse3 Nse4 K. Bednarova (Diplomová práce) His3 His3 “alaninscan”konservovanýchAMKukázalhydrofobníkapsu “alanin scan” konzervovaných AMK ukázal hydrofobní kapsu na povrchu Nse3 … … do níž se váže hydrofobní šroubovice Nse4 proteinu Pomocí in silico (MD) analýzy byl vytvořen model dimeru Nse3-Nse4 (docking) Reversní systém (Y2H) - při použití URA3 reportéru lze použít toxickou 5-fluoro-orotátovou kyselinu (5-FOA) k negativní selekci tj. interakce povede k záhubě kvasinek, zatímco mutanty neschopné interakce na FOA plotnách porostou (mutanty nebo syntetické látky) TIBTECH (1999) p. 374 je vhodnější pozitivní selekce (screenovat na rostoucí kvasinky) Split-hybrid systém represor bez represoru YX Interakce vyžadující post-translační modifikace Reporter genminimálníGAL1 UAS transkripceDBD AD enzym Guo et al, Nat Biotech, 2004 - Některé protein-proteinové interakce jsou závislé na post-translačních modifikacích - v buňce jsou přítomny např. acetylasy i deacetylasy, ale nemusí docházet k acetylaci hybridního proteinu – řešením je „připojení“ příslušného enzymu k hybridu - konstitutivní modifikace a enzym ve stechiometrickém poměru k substrátu (nejsou nutné kofaktory regulující interakci/modifikaci) Uetz et al, Nature, 2000 Y X DBD AD Mat a buňky 8x12 jamek (96 na misku) Všechny ORF Mat buňky Kvasinkový, lidský … „INTERACTOM“ High-throughput – testovány knihovny 6000x6000 proteinů (kombinace pomocí párování místo transformace) Analýza vazby protein-RNA (Y3H) SenGupta et al, PNAS, 1996 Tři hybridní/fůzní konstrukty: 1. DB-Gal4 a RNA-vazebný protein (MS2 virový coat protein) 2. RNA molekula složená z TAR (HIV trans-activation response element) a MS2 sekvence 3. AD-Gal4 a trans-activation protein Tat (váže TAR) Vazba ligand-receptor (Y3H) FK506 Licitra & Liu, PNAS, 1996 dexamethasone glucocorticoid receptor - FKBP12 Tři fúzní (hybridní) makromolekuly (2x protein a 1x nízkomolekulární ligand) Metody analýzy protein-proteinových interakcí - beads-based: pull-down (in vitro), coIP … - hybridní: - transkripční 2-hybridní systém - domény - reverzni systém – analýza PPI - více-hybridní systémy - inhibice PPI - membránový systém - pathway - komplementační systémy - fold - BiFC, DHFR - MS-based: painting, H-exchange … - proximity-based: FRET, PLA … - kvantitativní: SPR, ITC … - ko-krystalizace, NMR analýza … - genetické metody (syntetická letalita, suprese) - databáze (interactom a komplexy …) Literatura: Protein-protein interactions, Golemis & Adams, CSHL Press, 2005 CytoTrap 2-hybridní systém Kvasinkový cdc25-2 ts mutant – lidský hSOS (guanine exchange factor) aktivuje RAS pokud je ukotven na membránu v jeho blízkosti - jeden partner je myristylován (signální sekvence) a ukotven na membránu a druhý (interakční) partner je fuzován k hSOS – spustí Ras dráhu (roste i na vyšší teplotě) Broder et al, Cur Biol, 1998 alternativní Ras hybridní systémy Stynen et al, Microbiol Mol Biol Rev, 2012 Kvasinkový cdc25-2 ts mutant – lidský hSOS (guanine exchange factor) aktivuje RAS pokud je ukotven na membránu v jeho blízkosti (A) - jeden partner je myristylován (signální sekvence) a ukotven na membránu a druhý (interakční) partner je fuzován k hSOS – spustí Ras dráhu (roste i na vyšší teplotě) (B) – savčí konstitutivně aktivní Ras protein (bez signální sekvence) je fůzován s proteinem, který interaguje s partnerem ukotveným v membráně (spustí se Ras dráha a cdc25-2 kvasinky rostou i na vyšší teplotě) Boder et al, Arch Bioch Biphys (2012) - analyzovaný protein je umístěn na povrchu buňky (kvasinkové, bakteriální/fág) – čím vyšší afinita tím větší pravděpodobnost „zachycení“ – lze vyselektovat nejlepší vazebné sekvence (při použití „knihovny“) množením buněk se nabohatí „nejlepší“ sekvence - opakovaný sorting „surface display“ – cílená in vitro evoluce selekce na kuličkách selekce fluorescenční Currin et al, CSR, 2015 cílená in vitro evoluce takto lze modifikovat interakční schopnosti proteinů a nalézt motivy s vyšší afinitou … Chevalieretal,Nature,2017 Hemaglutinin botulin(toxin) 5 topologií (dle známých inhibitorů) 40 AMK dlouhé (cca 200nt oligo) – lze syntetizovat peptidy (peptidy modifikovat) NGS FACSorting kvasinkový surface display Inhibice PPI - proteiny Metody analýzy protein-proteinových interakcí - beads-based: pull-down (in vitro), coIP … - hybridní: - transkripční 2-hybridní systém - domény - reverzni systém – analýza PPI - více-hybridní systémy - inhibice PPI - membránový systém - pathway - komplementační systémy - fold - BiFC, DHFR - MS-based: painting, H-exchange … - proximity-based: FRET, PLA … - kvantitativní: SPR, ITC … - ko-krystalizace, NMR analýza … - genetické metody (syntetická letalita, suprese) - databáze (interactom a komplexy …) Literatura: Protein-protein interactions, Golemis & Adams, CSHL Press, 2005 Protein-fragment complementation Shekhat & Ghosh, CO in ChB, 2011 Bimolecular fluorescence complementation - BiFC Kodama & Hu, Biotechniques, 2012 Bimolecular fluorescence complementation - BiFC Propojuje se zpět fold/struktura nikoli 2 domény jako u Y2H (lokalizace proteinů do tkání, buněčných kompartmentů …) Pekarova et al, Plant J., 2011 Bruckner et al, IJMS, 2009 Přehled kvasinkových PPI biotechnologií Metody analýzy protein-proteinových interakcí - beads-based: pull-down (in vitro), coIP … - hybridní: Y2H (kvasinkový 2-hybridní), BiFC … - MS-based: - H-exchange … - protein painting - crosslinking - proximity-based: FRET, PLA … - kvantitativní: SPR, ITC … - ko-krystalizace, NMR analýza … - genetické metody (syntetická letalita, suprese) - databáze (interactom a komplexy …) Literatura: Protein-protein interactions, Golemis & Adams, CSHL Press, 2005 Přednáška doc. Zdráhala … Hydrogen/Deuterium Exchange (HDX) (P. Muller, MOU) Trcka et al, JBC, 2014 Protein painting Luchini et al, Nat Comun, 2014 Luchini et al, Nat Comun, 2014 Protein painting AO50 Pro kvalitní interpretaci dat je třeba znát 3D strukturu proteinů přednáška doc. Marka příště … Luchini et al, Nat Comun, 2014 - estery reagují s Lys (-amin) a amino-koncem - homofunkční spojí proteiny dohromady v jednom kroku (velmi komplexní vzorky pro MS) - intra- (struktura) nebo intermolekulární (PPI) Crosslinking A. ester Sinz, MS Reviews, 2006 Paramelle et al, Proteomics, 2013 B. Metody analýzy protein-proteinových interakcí - beads-based: pull-down (in vitro), coIP … - hybridní: Y2H (kvasinkový 2-hybridní), BiFC … - MS-based: painting, H-exchange … - proximity-based - FRET - PLA - kvantitativní: SPR, ITC … - ko-krystalizace, NMR analýza … - genetické metody (syntetická letalita, suprese) - databáze (interactom a komplexy …) Literatura: Protein-protein interactions, Golemis & Adams, CSHL Press, 2005 FRET (Forster/fluorescence resonance energy transfer) - fluorescence prvního (CFP) proteinu o vhodné vlnové délce excituje druhý protein - (pokud je dostatečně blízko) - druhý protein emituje (YFP, fluorescence) záření detekované v mikroskopu Hybridní! Bruckner et al, IJMS, 2009 test • 1. Alanine scan spočívá v: – A. postupném nahrazování (mutagenesi) AMK alaninem? – B. postupném nahrazování (mutagenesi) alaninu bazickými AMK ? – C. hledání alaninu v sekvencích interakčních partnerů? – D. specifickém „scanning“ proteomických dat? • 2. Klasický kvasinkový dvou-hybridní systém využívá principu: – A. reaktivace fluorescence GFP proteinu? – B. reaktivace transkripčního faktoru (většinou Gal4)? – C. reaktivace enzymu DHFR? – D. reaktivace signální dráhy Ras? • 3. Při cíleném „crosslink“ proteinů pomocí BMOE: – A. se kovalentně spojí SH skupiny cysteinů a vznikne disulfidický můstek? – B. se kovalentně spojí SH skupiny cysteinů s crosslinkerem? – C. se kovalentně spojí NH2 skupiny lysinů s crosslinkerem? – D. se nekovalentně spojí opačně nabité AMK? • 4. Metoda FRET využívá principu: – A. reaktivace transkripčního faktoru Gal4? – B. reaktivace fluorescence GFP (komplementací jeho fragmentů)? – C. přiblížení fluoroforu (např. CFP), který emituje světlo o vlnové délce odpovídající absorpčnímu spektru druhého fluoroforu (např. YFP)? – D. fluorescenční resonance etanu? • testy předat příště přednášejícímu nebo poslat na můj E-mail: jpalecek@sci.muni.cz