— —cíl: stanovit množství DNA — — —Spektrofotometrická kvantifikace DNA —- určení množství veškeré DNA ve vzorku bez ohledu na to, z jakého zdroje tato DNA pochází. —- molekuly DNA silně absorbují elektormagnetické záření vlnové délky 260 nm (tj. ultrafialové záření) —- paprsek o 260 nm se nechá procházet roztokem DNA (např. izolátem) a změří se pokles intenzity záření – tím větší, čím je roztok DNA koncentrovanější — Po průchodu kyvetou poklesne intenzita světla (část je ho pohlcena roztokem v kyvetě) SVĚTELNÝ ZDROJ DĚLICÍ HRANOL SPEKTRÁLNÍ FILTR KYVETA S ROZTOKEM CCD DETEKTOR —Cíl: stanovit množství DNA? — — —Spektrofotometrická kvantifikace DNA -určení množství veškeré DNA ve vzorku bez ohledu na to, z jakého zdroje tato DNA pochází. - molekuly DNA silně absorbují elektormagnetické záření vlnové délky 260 nm (tj. ultrafialové záření) -paprsek o 260 nm se nechá procházet roztokem DNA (např. izolátem) a změří se pokles intenzity záření – tím větší, čím je roztok DNA koncentrovanější - — NESPECIFICKÁ A PRO FORENZNÍ ÚČELY NEVHODNÁ - — -chemické sloučeniny - barviva (např. EtBr, PicoGreen, OligoGreen) – vazba na/do DNA - změna jejich prostorového uspořádání; při dopadu světla určité vlnové délky fluorescenčně aktivní – vyzařování světla, jehož množství je měřeno fluorimetrem -„Množství vyzářeného světla je přímo úměrné množství navázaného barviva, a to je zase přímo úměrné množství DNA přítomné ve vzorku.“ — Na/do DNA se naváže fluorescenční barvivo CCD DETEKTOR SVĚTELNÝ ZDROJ Po excitaci laserem navázané fluorescenční barvivo září Čím více je DNA ve vzorku, tím více barviva se naváže a tím více vzorek září: -chemické sloučeniny - barviva (např. EtBr, PicoGreen, OligoGreen) – vazba na/do DNA - změna jejich prostorového uspořádání; při dopadu světla určité vlnové délky fluorescenčně aktivní – vyzařování světla, jehož množství je měřeno fluorimetrem -„Množství vyzářeného světla je přímo úměrné množství navázaného barviva, a to je zase přímo úměrné množství DNA přítomné ve vzorku.“ -relativně vysoká citlivost a přesnost měření, malé nároky na spotřebu vzorku, možnost měření automatizovat, nízká cena analýzy -nespecifita měření — — PRO FORENZNÍ ÚČELY NEVHODNÁ —testovací sondy nasedají na Alu sekvence —Alu sekvence – specifické pro lidskou DNA a vyšších primátů —hybridizace sondy - cíl iniciuje sérii enzymů - reakce, které končí oxidací luciferinu a produkcí světla —intenzita světla se odečítá pomocí luminometru a je úměrná množství DNA přítomnou ve vzorku —množství DNA ve vzorku se stanoví porovnáním na standardní křivku —rozsah 0,1 až 50 ng — —? VHODNÝ PARAMETR (délka cca 300 bp x degr. DNA, vypovídací hodnota o kvalitě, resp. kvantitě DNA) — —nepracuji se známým vzorkem x biologie potvrdila přítomnost lidského biol. materiálu (vyjma AluQuant kitu) —neznám přesnou historii vzniku stopy —čas vzniku stopy a doba uplynulá před zajištěním —neznám klimatické podmínky —nevím kolik osob se mi na vytvoření stopy podílelo —neznám strukturu podkladu/kontaminace, inhibitory Kvantifikace – stanovení množství DNA ve vzorku, resp. určit množství "amplifikovatelné" DNA - důležité pro vyladění PCR Potřebuji znát více parametrů: -množství lidské DNA -poměry XX a XY -degradaci - inhibici —- PCR a současně průběžně měřeno množství PCR produktů – podle toho, jakým způsobem během PCR toto množství rostlo, lze zpětně dovodit původní vstupní množství DNA ve vzorku (kalibrace pomocí vzorků známé koncentrace) -vysoce přesná, vysoce citlivá, přísně specifická (poskytuje pozitivní výsledek prakticky pouze u daného druhu respektive velmi blízce příbuzných druhů) -detekce případné přítomnosti PCR inhibitorů a rozsah DNA fragmentace -detekce pomoci SYBR Green -FRET sondy („fluorescent resonance energy transfer“) – TaqMan, „molecular beacon“ („molekulární maják“) — — —- PCR a současně průběžně měřeno množství PCR produktů – podle toho, jakým způsobem během PCR toto množství rostlo, lze zpětně dovodit původní vstupní množství DNA ve vzorku (kalibrace pomocí vzorků známé koncentrace) -vysoce přesná, vysoce citlivá, přísně specifická (poskytuje pozitivní výsledek prakticky pouze u daného druhu respektive velmi blízce příbuzných druhů) -detekce případné přítomnosti PCR inhibitorů a rozsah DNA fragmentace -detekce pomoci SYBR Green -FRET sondy („fluorescent resonance energy transfer“) – TaqMan, „molecular beacon“ („molekulární maják“) — — —Taq Man sondy — —Quantifiler (AB) – Q Duo a Q Trio - — —Plexor HY, PowerQuant (Promega) — — —Investigator Quantiplex Pro RGQ Kit (Qiagen) — — — — — — Q – 1 target o délce 63 bp Q Duo - Q Trio - [USEMAP] —délka amplikonu „autosomal DNA“: 84 bp (robustní x inhibitorům) —Y chromozóm: amplikony 81 bp a 136 bp —degradace: 294 bp —IPC: 435 bp - inhibice — [USEMAP] —detekce : TaqMan probes - QuantiNova DNA Polymerase —koncentrace DNA: 200 ng/µl až 0.5 pg/µl, s citlivostí menší než 0.1 pg/µl —citlivost zachycení mužské DNA ve vzorku s výrazně vyšší koncentrací ženskou DNA (400,000 : 1) —DNA Degradation Control (DC) - detekce degradace jak „male“ DNA tak i „total human“ DNA —IC (internal control) je citlivější k inhibitorům — —Polymerázová řetězová reakce —Princip obou metod/kroků stejný — — — — —Denaturace - DNA se po dobu 20–30 sekund zahřívá na teplotu 94-98 °C. Při této teplotě dochází k rozrušení vodíkových můstků v molekule DNA a k rozvolnění dvoušroubovice. Vzniká tak jednovláknová DNA, na kterou mohou v dalším kroku nasednout primery. —Nasednutí primerů – teplota se sníží na 50-65 °C, což umožňuje nasednutí primerů na specifická místa DNA. Na dvouvláknové úseky DNA-primer se váže DNA polymeráza. —Syntéza DNA - teplota použitá v této fázi závisí na použité DNA polymeráze. Nejběžnější Taq polymeráza má optimum aktivity na 75-80 °C. V tomto kroku dochází k samotné syntéze DNA. Ve směru od 5' konce ke 3' konci přirůstá vlákno DNA komplementární k původní molekule DNA. — — volné nukleotidy enzym polymeráza primerový pár F R 96°C cílové místo primeru F cílové místo primeru R start PCR —Polymerázová řetězová reakce —Princip obou metod/kroků stejný — — — — —Denaturace - DNA se po dobu 20–30 sekund zahřívá na teplotu 94-98 °C. Při této teplotě dochází k rozrušení vodíkových můstků v molekule DNA a k rozvolnění dvoušroubovice. Vzniká tak jednovláknová DNA, na kterou mohou v dalším kroku nasednout primery. —Nasednutí primerů – teplota se sníží na 50-65 °C, což umožňuje nasednutí primerů na specifická místa DNA. Na dvouvláknové úseky DNA-primer se váže DNA polymeráza. —Syntéza DNA - teplota použitá v této fázi závisí na použité DNA polymeráze. Nejběžnější Taq polymeráza má optimum aktivity na 75-80 °C. V tomto kroku dochází k samotné syntéze DNA. Ve směru od 5' konce ke 3' konci přirůstá vlákno DNA komplementární k původní molekule DNA. — — cílové místo s navázaným primerem R cílové místo s navázaným primerem F 72°C 95°C —Polymerázová řetězová reakce —Princip obou metod/kroků stejný — — — — —Denaturace - DNA se po dobu 20–30 sekund zahřívá na teplotu 94-98 °C. Při této teplotě dochází k rozrušení vodíkových můstků v molekule DNA a k rozvolnění dvoušroubovice. Vzniká tak jednovláknová DNA, na kterou mohou v dalším kroku nasednout primery. —Nasednutí primerů – teplota se sníží na 50-65 °C, což umožňuje nasednutí primerů na specifická místa DNA. Na dvouvláknové úseky DNA-primer se váže DNA polymeráza. —Syntéza DNA - teplota použitá v této fázi závisí na použité DNA polymeráze. Nejběžnější Taq polymeráza má optimum aktivity na 75-80 °C. V tomto kroku dochází k samotné syntéze DNA. Ve směru od 5' konce ke 3' konci přirůstá vlákno DNA komplementární k původní molekule DNA. — — cílové místo s navázaným primerem R cílové místo s navázaným primerem F 72°C 95°C [USEMAP] ü PCR inhibitory ü nesprávné složení PCR reakční směsi – nedostatečná koncentrace dNTPs, Mg2+, primerů či DNA polymerázy; příliš vysoká koncentrace Mg2+ ü vyšší než optimální hybridizační teplota – ani specifické primery se „neudrží“ ü vstupní množství templátové DNA ü nesprávné nasednutí primerů, nesprávné složení PCR reakční směsi, příliš nízká anelační teplota - snížení specifity reakce ü chyby při činnosti polymerázy – zařazení nesprávného nukleotidu, prokluz polymerázy („stutter“) — ünamnožení zájmových lokusů před provedením dalších analýz (SNP lokusů, HVR mtDNA apod.) üjeden z více kroků nějaké analýzy (mono- či multiplexová PCR jako součást analýzy STR lokusů, asymetrická PCR jako součást sekvenace HVR mtDNA apod.) ü ümonoplexová PCR – amplifikace pouze jediného lokusu v jedné reakci s použitím jednoho páru primerů ümultiplexová PCR - amplifikace více lokusů v jedné reakci s použitím většího počtu páru primerů (duplexová, triplexová PCR apod.) ü üsymetrická PCR – oba primery v rámci primerového páru přidány do reakce ve stejném množství ünesymetrická PCR – preference kopírování v jednom směru přidání jednoho primeru ve větším množství — http://www.distribio.com/img/instruments/abi9700_1.jpg — —DNA: struktura a funkce —marker /znak– lokus - alela — autozóm x gonozóm, počet chromozómů a jejich struktura —mitózou a meiózou – rekombinace, mutace —rozdíl mezi sekvenčním a délkovým polymorfismem — — —polymorfismus délky restrikčních fragmentů —štěpení restrikční endonukleázou EcoRI —pokud místo obsahuje — rozpoznávací sekvenci dojde — ke vzniku fragmentu — extrakce DNA — štěpení pomocí restrikčních endonukleáz — separace pomocí elektroforézy — Southernův přenos – přenos fragmentů z gelu na nylonovou membránu —hybridizace komplementárních radioaktivně nebo chemoluminiscenčně značených sond ke specifickým sekvencím DNA — hodnocení radioaktivního filmu —použity v původní Jeffreysově metodě —jedna sonda se váže k mnoha lokusům obsahující VNTR polymorfizmy —vzniká obraz připomínající čárkový kód. —umožnění personální identifikace, ale v případě směsných vzorků velmi špatná interpretace —minisatelity: 10 - 100 bp —marker D1S80 — - délka 16 bp opakování 16 -41 x — —!!!Ne každý minisatelit je VNTR — — —https://www.youtube.com/watch?v=5S_GBfxvymI —detekovány pouze jedna (homozygot) nebo dvě (heterozygot) alely — —https://www.youtube.com/watch?v=9bEAJYnVVBA —mikrosatelity: 2 – 5 bp dlouhé úseky —opakování: 5 – 50 x —nekódující oblasti DNA nebo v intronech — — — — —D16S539 —D: DNA —16: chromosome 16 —S: single copy sequence —539: 539th locus described on chromosome 16 [USEMAP] — ESI 17 (Promega) PowerPlex® Fusion Systém 24 lokusový kit [USEMAP] —ESS lokusy, SE33, DYS391 a Amelogenin, s Quality Sensor —bodové mutace s výskytem v populaci max. 95% stejné varianty, min. 1% musí být nositelem —teoreticky 4 varianty, reálně 2 —s výskytem 1 SNP na 1000 bází v kódující i nekódující sekvencích —+ v genomu velmi početné, méně podléhají mutacím než mikrosatelity, relativně rovnoměrná distribuce po genomu, relativně snadná detekce —- poměně nákladné získávání, polymorfismus omezený —