J. Vondráček Buněčný metabolismus Téma přednášky BUNĚČNÝ METABOLISMUS základní dráhy energetického metabolismu buňky a dynamická podstata jejich regulací – glykolýza, citrátový cyklus a oxidativní fosforylace, pentózový cyklus, glukoneogeneze mitochondriální metabolismus a jeho regulace na úrovni buňky a mitochondrií; struktura a dynamika mitochondrií; Makroergické sloučeniny živočišná buňka potřebuje energii skladovat, přenášet a zapojovat do chemických reakcí syntetizujících potřebné sloučeniny; sloučeniny (meziprodukty) s vysokým obsahem energie – ta je z nich většinou uvolněna jednoduchým štěpením chemické vazby – makroergické sloučeniny ; nejběžnějším typem ve všech organismech – adenosintrifosfát (ATP); ATP → ADP + Pi (ΔG = −30,5 kJ/mol); ΔG = standardní volná energie Makroergické sloučeniny štěpení ATP (exergonická reakce) je spřažena s dalšími energeticky nepříznivými reakcemi (endergonickými) reakcemi – fosfátový zbytek je přenášen na substrát – vzniká reakční intermediát s vyšší energií; př. syntéza glutaminu z kys. glutamové a amoniaku: ATP je základní zdroj energie pro syntézu makromolekul – cukrů, nukleových kyselin i proteinů; Makroergické sloučeniny další typy nukleosid trifosfátů jsou méně univerzální a používají se pro specializované reakce – UTP – aktivace sacharidů před vstupem do metabolických drah; GTP - zdroj energie při translaci; enolfosfáty obsahují skupinu −OH, jež se estericky váže na fosfát. fosfoenolpyruvát makroergická sloučeninou s ΔG (až −61,9 kJ/mol) – hydrolýza fosfoenolpyruvátu je využita pro regeneraci ATP; acylfosfáty – 1,3-bisfosfoglycerát (meziprodukt glykolýzy); fosfoguanidiny - fosfokreatin (kreatinfosfát) - zdroj energie v kosterní svalovině; nízkoenergetické fosfáty (při štěpení uvolňují méně než 20 kJ/mol) - např. glukóza-6-fosfát, fruktóza-6-fosfát; Biochemistry. 5th edition. Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L. New York: W H Freeman; 2002. Přenašeče elektronů – NADH, NADPH sloučeniny podílející se na redoxních reakcích, součást spřažených reakcí v buňce; při jejich redukci přijímají 2 elektrony a 1 proton – hydridový ion (naváže se na nikotinamidový kruh) – snadno je odevzdá pro redukční reakci – přenos redukčního ekvivalentu; nikotinamidadenindinukleotidfosfát (NADP+) a nikotinamidadenindinukleotid (NAD+); Přenašeče elektronů – NADH, NADPH nikotinamidadenindinukleotidfosfát (NADP+) a nikotinamidadenindinukleotid (NAD+) – odlišný tvar – to umožňuje rozdílnou vazbu těchto molekul na specifické enzymy; NADPH – kofaktor enzymů katalyzujících anabolické reakce – důležitý pro syntetické reakce; NADH – specifická úloha v katabolických reakcích vedoucích k oxidaci substrátu a tvorbě ATP; uvnitř buňky – vysoký poměr NAD+/NADH a nízký poměr NADP+/NADPH Další typy přenašečů další typy molekul účastnící se chemických reakcí – obsahují skupinu vázanou vazbou jejíž štěpení uvolní energii nezbytnou pro další reakci; acetylkoenzym A (acetyl-CoA) – vzniká např. štěpením mastných kyselin (βoxidace), biosyntéza lipidů – přenos 2 uhlíků (acetyl); Další typy přenašečů flavinadenindinukleotid (FAD+) – koenzym, který je jako prostetická skupina součástí flavoproteinů; redukovaná forma FADH2 vzniká v Krebsově cyklu a zapojuje se do dýchacího řetězce; Základní dráhy energetického metabolismu živočišné buňky využívají jako zdroj energie hlavně cukry a tuky, pouze v nepříznivých podmínkách další typy molekul; glykolýza – základní dráha pro syntézu ATP (2x), NADH (2x) a pyruvátu (2x); nevyžaduje kyslík – elektrony jsou odebírány za tvorby NADH; pyruvát je transportován do mitochondrií – tvorba CO2 a acetyl-CoA – posléze vzniká CO2 a H2O; jen výjimečně – např. ve svalech (málo kyslíku) NADH a pyruvát zůstávají v cytosolu – tvorba laktátu a NAD+ (udržuje glykolýzu v anaerobních podmínkách); Základní dráhy energetického metabolismu klíčové kroky vedoucí k syntéze ATP a tvorbě NADH; důležité je aby štěpení vazby poskytlo více energie než je třeba k jejich syntéze; Uchovávání energie pro buňky je klíčové udržovat vysoký poměr ATP/ADP – vzhledem k tomu, že potravu přijímají živočichové potravu jen občas – nutnost uchování energie; forma triglyceridů – tukové kapénky v cytoplazmě – vznikají z ER a jsou ohraničeny jednoduchou membránou; množství a velikost závisí na metabolickém stavu buňky a typu; dlouhodobé uchovávání energie; Uchovávání energie krátkodobé uchovávání energie – ve formě glykogenu; ten je přítomen ve formě granulí, zejména v buňkách zapojených do metabolismu (hepatocyty) nebo spotřebovávajících velké množství energie (svaly); při nedostatku energie je z glykogenu syntetizován glukóza-6-fosfát; nevýhodný pro dlouhodobé uchovávání energie – menší obsah energie, váže velké množství vody; průměrná lidská buňka – zásoby na 1 den (triglyceridy na 1 měsíc); Uvonění energie z triglyceridů při nedostatku potravy (energie) dochází k hydrolýze triglyceridů v tuk. kapénkách nebo ve specializovaných buňkách - adipocytech – mastné kyseliny jsou transportovány do mitochondrií; zpracování mastných kyselin β-oxidací pro tvorbu ATP probíhá v mitochondriích, přestože se na metabolismu mastných kyselin podílejí i peroxizómy (ty ale převážně metabolizují velmi dlouhé mastné kyseliny, větvené mastné kyseliny, produkty metabolismu mastných kyselin – zapojení do anabolických procesů); Konečný cíl mastných kyselin i cukrů - mitochondrie transport pyruvátu do mitochondrií – pyruvát dehydrogenáza – tvorba acetylCoA (1x), NADH (1x) a CO2; mastné kyseliny – 1 cyklus β-oxidace produkuje acetyl-CoA (1x), NADH (1x) a FADH2 (1x); + GTP základní zdroj tvorby ATP – Krebsův cyklus (cyklus kyseliny citrónové) v matrix mitochondrií – zpracování acetyl-CoA; reprezentuje cca 2/3 oxidací uhlíkových sloučenin v buňce; hlavním produktem je CO2 a elektrony s vysokou energií (hlavně v NADH); Tuky jsou energeticky mnohem bohatší substrát Krebsův cyklus a dýchací řetězec produkuje 3 typy energeticky významných molekul: NADH (3x), FADH2 (1x) a GTP (1x); GTP reaguje s ADP za tvorby ATP (1x); elektrony v NADH a FADH2 – následně využity pro tvorbu ATP oxidativní fosforylací; do dýchacího řetězce ve vnitřní membráně mitochondrií; Meziprodukty energetického metabolismu – syntéza malých molekul i buněčných makromolekul reakce glykolýzy a Krebsova cyklu zároveň slouží k syntéze mastných kyselin, cukrů, nukleotidů a aminokyselin; součástí syntézy a degradace těchto sloučenin jsou i reakce zahrnující přeměny molekul obsahujících N a S; Meziprodukty energetického metabolismu – syntéza malých molekul i buněčných makromolekul reakce se často odehrávají na úrovni různých buněk a tkání – příklad: Coriho cyklus, alanin-pyruvátový cyklus – spolupráce hepatocytů a svalových buněk; glykolýza – centrální dráha propojená se všemi úrovněmi buněčného metabolismu; BMC Systems Biology 2011, 5:180 Ústřední organela energetického metabolismu - mitochondrie NADH předává elektrony s vysokou energií komplexům dýchacího řetězce – finální krok je vznik H2O; tato energie je využita k transportu H+ protonovými pumpami vzniklý protonový gradient pohání ATP syntázu; mitochondrie – velikost, tvar i množství se liší ~ typ buňky, intenzita metabolismu, apod.; typicky cca 20 % objemu cytoplasmy; jsou to vysoce dynamické organely – neustále mění tvar, dělí se fúzují, apod.; liší se pohyblivostí; Struktura mitochondrií vnitřní mitochondriální membrána obklopuje matrix, vytváří invaginace – kristy (cristae) – obsahují proteiny vytvářející komplexy dýchacího řetězce; mezimembránový prostor je obklopen vnější mitochondriální membránou – permeabilní pro ionty a malé molekuly (< 5000 Da) – prostřednictvím porinů je mezimembránový prostor spojen s cytoplasmou; výsledkem je, že v mezimembránovém prostoru je stejné pH a iontové složení jako v cytoplasmě – elektrochemický gradient vzniká na vnitřní mitochondriální membráně; Funkční kompartmentalizace mitochondrií vnitřní mitochondriální membrána se dělí na funkčně odlišné oblasti: - hraniční (boundary) membrána – import proteinů, inzerce membrány, sestavování komplexů dýchacího řetězce; - memrána krist – obsahuje ATP syntázu a komplexy dýchacího řetězce – až 75% tvoří proteiny; kristy zvětšují povrch dostupný pro oxidativní fosforylaci – v kardiocytech je tak např. povrch mitochondriálních krist 20x větší než plazmatická membrána (v lidském těle cca 1 fotbalové hřiště); - tyto dvě oblasti jsou odděleny – spoje krist (cristae junctions) – speciální proteiny vytvářejí bariéru a zároveň udržují strukturu krist; Funkční kompartmentalizace mitochondrií matrix – Krebsův cyklus (citrátový cyklus); obsahuje také mtDNA a mitochondriální ribozómy; většina genů kódujících mitochondriální proteiny je na jaderné DNA; specifika transkripce a translace v mitochondriích- mtDNA neobsahuje téměř žádné nekódující oblasti, specifické využití kodonů, menší množství tRNA; mutace mtDNA – velmi závažné dědičné metabolické poruchy – přenášeny z matky na dcery; poškození (zejména oxidativní) a kumulace změn v mtDNA – souvisí se stárnutím organismu; proč mají mitochondrie stále ještě oddělený genom? – syntéza vysoce hydrofobních proteinů (obtížný transport), stále probíhající evoluce? Tvorba komplexů dýchacího řetězce mtDNA - 13 proteinů (+ 22 tRNA a 2 rRNA); jaderná DNA - většina proteinů dýchacího řetězce, proteiny regulující expresi a údržbu mtDNA a všechny proteiny mitochondriálních ribozómů; Mitochondrie – vysoce dynamické organely procesy dělení a fúze kontrolují tvar a pohyblivost mitochondrií v různých buňkách; změny souvisejí nejen s metabolismem, ale i se stárnutím mitochondrií a jejich signalizační úlohou v buňce; Variabilita mitochondrií se dynamicky mění vlivem vnějšího prostředí (např. parciální tlak O2, množství živin), onemocnění, ve speciálních typech buněk apod. – např. kompaktní vs. retikulární (vláknité) mitochondrie: Milo et al., Cell Biology by the Numbers, New York, Garland Science, 2016 J. Comp. Neurology, 2005, 492:50 – 65 část dendritu nervové buňky potkana Interakce mitochondrií s ER mitochondrie úzce interagují s ER – výměna lipidů mezi membránami; kontakty ER a mitochondrií startují procesy fúzování a dělení mitochondrií; Esenciální role mitochondrií v buněčném metabolismu vedle dýchacího řetězce a Krebsova cyklu hrají mitochondrie i další významnou úlohu v buněčném metabolismu: - udržování redoxní rovnováhy v cytoplasmě – regenerace NAD+ využitého pro tvorbu 1,3-bisfosfoglycerátu v glykolýze; vnitřní mitochondriální membrána nepropustná pro vznikající NADH – prostřednictvím malých molekul jsou elektrony přeneseny na NAD+ v matrix; - mitochondrie mohou poskytovat citrát – např. syntéza acetyl CoA – syntéza mastných kyselin a sterolů pro stavbu buněčných membrán; - močovinový cyklus – přeměna NH4 + (vznikající při odbourávání aminokyselin) na močovinu probíhá částečně v mitochondriích; - při hladovění jsou aminokyseliny ze štěpených proteinů transportovány do mitochondrií a tam oxidovány za vzniku ATP; - biosyntéza hemu; - tvorba fosfolipidů; - přebírání Ca2+ z ER; - syntéza steroidů; Chemiosmotická teorie energie vznikající metabolismem je uložena ve formě energeticky bohatých molekul, které přenášejí elektrony do dýchacího řetězce; sérií reakcí, jejichž konečným produktem je H2O, vzniká elektrochemický gradient pohánějící tvorbu ATP – oxidativní fosforylaci; Přenos elektronů z NADH (a FADH2) na kyslík se odehrává prostřednictvím velkých enzymatických komplexů 3 komplexy – protonové pumpy poháněné transportem elektronů: - komplex I - NADH-ubichinonreduktáza - komplex III - ubichinol-cytochrom c-reduktáza - komplex IV - cytochrom c-oxidáza + - komplex II - sukcinát-ubichinonreduktáza (vstup FADH2) – nefunguje jako protonová pumpa, pouze předává elektrony z FADH2 Jednotlivé komplexy nejsou oddělené – vytvářejí tzv. superkomplex dýchcího řetězce jednotlivé komplexy vytvářejí superkomplex (velikost 1-2 MDa) – jeho tvorba a stabilita záleží na přítomnosti kardiolipinů (specifické fosfolipidy mitochondriálních membrán); Energie uvolněná oxidací je uložena v podobě elektrochemického gradientu elektrochemický gradient – kombinuje dva typy gradientů - pH gradient a membránový potenciál: elektrochemický gradient respirující mitochondrie ~ 180 mV – ∆V cca 150 mV, pH gradient 0,5 - 0,6 jednotek pH (∆pH 1 pH – cca 60 mV); generuje protonmotivní sílu; gradient pohání jak syntézu ATP, tak transport přes vnitřnímit. membránu (např. proteinů matrix, dalších malých molekul); ATP syntáza proteinový komplex jehož aktivita je klíčová pro vznik energeticky bohatého substrátu – ATP; glykolýza – na 1 molekulu glukózy – 2 molekuly ATP; kompletní oxidace 1 molekuly glukózy – glykolýza po oxidativní fosforylaci – cca 30 molekul ATP; • nanostroj – rotační katalýza: • 23 podjednotek, 600 kDa; • tok protonů do matrix pohání rychlostí cca 8000 ot./min; • 1 otáčka = 3 ATP; • 400 ATP/s ADP/ATP translokáza (carrier protein) tvorba ATP vyžaduje rychlý transport ADP do matrix a zároveň transport vzniklého ATP do cytoplazmy; ADP/ATP translokáza; součást rodiny cca 20 proteinů rodiny mitochondriálních přenašečů/transportérů – transportují významné metabolity, vč. fosfátu pro syntézu ATP; součástí této rodiny je i uncoupling protein (thermogenin, UCP-1) – v hnědé tukové tkáni umožňuje přenos protonů za současného uvolňování tepla (bez syntézy ATP); Další dráhy energetického metabolismu glukoneogeneze – syntéza glukózy a glykogenu; pentózový cyklus; Glukoneogeneze v případě energetického nadbytku, nebo dalších potřeb organismu mohou živočišné buňky syntetizovat glukózu; základním substrátem je pyruvát (jeho zdrojem může být laktát), ale stejně mohou sloužit i meziprodukty Krebsova cyklu (prostřednictvím přeměny na oxaloacetát), aminokyseliny (s výjimkou Lys a Leu) a glycerol; většina reakcí je opakem glykolýzy, ale glukoneogeneze není obrácená glykolýza!!! reakce, katalyzované glukóza- 6-fosfatázou, fruktóza-1,6bisfosfatázou, pyruvát karboxylázou a PEP karboxykinázou jsou unikátní; Glukoneogeneze pyruvát karboxyláza – mitochondriální protein, ostatní reakce probíhají v cytoplazmě; ve většině tkání není výsledným produktem glukóza, ale glukózo-6-fosfát (zůstává v buňce); pokud je třeba produkovat glukózu – např. udržování hladiny v krvi – probíhá její tvorba v ER; Biochemistry. 5th edition. Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L. New York: W H Freeman; 2002. Glukoneogeneze glukoneogeneze a glykolýza jsou koordinovány – v rámci buňky je aktivní jen jedna dráha; kontrola aktivity specifických enzymů; koncentrace laktátu (a dalších prekurzorů) a glukózy; Biochemistry. 5th edition. Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L. New York: W H Freeman; 2002. Pentózový cyklus buňky udržují nízký poměr NADP+/NADPH – redukce substrátů – anabolické reakce; zdrojem NADPH je glukózo-6-fosfát - pentózový cyklus (hexózomonofosfátová odbočka); 1. fáze – oxidační reakce (vznik NADPH) a 2. neoxidační fáze – přeměny cukrů (zdroj pro syntézu nukleotidů) a tvorba meziproduktů glykolýzy; 1. fáze – oxidační reakce - na 1 molekulu G6P vznikají dvě NADPH Biochemistry. 5th edition. Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L. New York: W H Freeman; 2002. Pentózový cyklus vzniklý ribulózo-5-fosfát – zdroj pro syntézu nukleových kyselin; ale buňka produkuje velké množství tohoto meziproduktu (potřebuje velké množství NADPH); působením transketoláz a transaldoláz vznikají meziprodukty glykolýzy, které jsou dále využity v glykolýze – fruktózo-6-fosfát a glyceraldehyd-3-fosfát; Biochemistry. 5th edition. Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L. New York: W H Freeman; 2002. Aerobní glykolýza rychle proliferující buňky vyžadují nejen energii, ale i velké množství substrátů pro anabolické reakce; přestože je aerobní glykolýza nevýhodná energeticky, v podmínkách dostatečného přísunu glukózy produkuje ATP dokonce rychleji než oxidativní fosforylace; hlavní funkcí je ale pravděpodobně podpora syntézy buněčných makromolekul, kofaktorů apod. – koplexní přestavba buněčného metabolismu; Science, 2009, 324:1029 - 1033 Aerobní glykolýza meziprodukty glykolýzy jsou významným zdrojem pro biosyntézu lipidů, nukleotidů i proteinů; Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2011, 27:441-464 K zamyšlení Jakým způsobem buňky využívají sloučeniny s vysokoenergetickými vazbami jako systém pro přenos energie – co jsou makroergní sloučeniny? Proč jsou pro buňky důležité sloučeniny umožňující přenos redukčních ekvivalentů – kontrola oxidační a redukční reakce? Jak probíhá v buňce základní energetický metabolismus – glykolýza (cytoplazma) vs. Krebsův cyklus + oxidativní fosforylace (mitochondrie)? Jaké látky umožňují v buňce krátkodobé a dlouhodobé skladování energie? Jako roli hrají mitochondrie v buňce? Co to je a proč je důležitá funkční kompartmentalizace mitochondrií; Jak mohou buňky různých orgánů spolupracovat na energetickém metabolismu? K zamyšlení Jak probíhá glukoneogeneze a jaký je její význam? Co to je pentózový cyklus a jaký je jeho význam pro buňku? Jak mohou být využívány meziprodukty reakcí energetického metabolismu jako substráty pro syntézu dalších biomolekul – příklady? Buňky dynamicky mění metabolismus v závislosti na okolním prostředí i na proliferaci/diferenciaci – jaký je význam aerobní glykolýzy?