Izolace nukleových kyselin Materiál pro izolaci nukleových kyselin •Výchozím materiálem mohou být: –Jednotlivé buňky (např. prokaryotických organizmů, kvasinek, leukocyty) •Celková genomová DNA •Plazmidová DNA bakterií •DNA z organel (mitochondrií, chloroplastů) –Tkáně a orgány eukaryot, které jsou nejdříve homogenizovány –Virové částice purifikované centrifugačními technikami –Postupy pro přečištění nukleových kyseliny v elektroforetických gelech nebo po enzymatických reakcích Požadavky na izolaci nukleových kyselin •V nativním stavu z přirozeného materiálu –v dostatečném množství –požadované čistotě. •Nukleové kyseliny je třeba zbavit všech látek, které se po lyzi buněk nebo virových částic stávají součástí hrubých lyzátů a jejichž přítomnost by bránila účinnému a specifickému působení enzymů používaných k jejich analýze a úpravám –přečišťovací enzymy Metodické principy využívané při izolaci nukleových kyselin •Rozrušení buněčných stěn nebo virových nukleokapsidů působením –Enzymů (lysozym a celulázy) –Detergentů (dodecylsulfát sodný) –Mechanicky (lyzační matrice, FastPrep) •Enzymatické kroky pro odstranění kontaminant –Proteináza K nebo pronáza E –RNáza nebo DNáza •Purifikace FastPrep Kity •Izolace z neznámých a těžce zpracovatelných vzorků –tkáně – rostlinný materiál – gram + bakterie – sediment – kosti Typy metod pro izolaci nukleových kyselin 1.Metody využívající rozdílné rozpustnosti •Zahrnují fenolové extrakce a etanolové nebo izopropanolové precipitace (srážení) •Obecně rozšířené, široké aplikace •Vhodné pro vysokomolekulární genomové NK 2.Metody adsorpční •DNA se váže na křemičité povrchy v přítomnosti chaotropní látky •Vhodné zejména pro rychlou purifikaci malých množství 3.Centrifugace v hustotním gradientu •Izopyknické centrifugace v gradientu CsCl •Vhodné při velkém množství a pro vysokou čistotu •Možnost frakcionace podle velikosti v sacharózových gradientech Základní složky roztoků •NaCl – iontová síla •Tris hydrochlorid – pufrovací činidlo •EDTA – chelatační činidlo (ochrana před působením nukleáz) Typická fenolová extrakce •Promíchání lyzátu buněk s roztokem fenolu, případně se směsí fenolu a chloroformu. Fenol je organické rozpouštědlo používané k oddělení proteinů od nukleových kyselin. Proteiny jsou hydrofobní a zůstávají v organické fázi, zatímco NK jsou vysoce nabité a přecházejí do vodné fáze. Chloroform denaturuje proteiny, rozpouští tuky a napomáhá oddělení jednotlivých fází získaných v následujícím kroku. •Centrifugace, při níž dojde k oddělení spodní organické fáze, tvořené fenolem (případně směsí fenolu a chloroformu), mezifáze, tvořené denaturovanými proteiny a zbytky buněk, a horní vodné fáze, v níž jsou rozpuštěny nukleové kyseliny. •Vysrážení nukleových kyselin etanolem, případně izopropanolem. Účinnému vysrážení nukleových kyselin přítomných v nízkých koncentracích se napomáhá snížením teploty a přídavkem solí. •Shromáždění precipitátu nukleových kyselin centrifugací a rozpuštění získaného sedimentu ve vhodném roztoku. • ethanop precip principy izolace DNA II4 copy Izolace plazmidové DNA •Plazmidy jsou využívány pro tvorbu konstruktů v genovém inženýrství •Výskyt u bakterií •Topologie molekuly –Dvouřetězcová DNA –Kružnicový tvar a nadšroubovicová hustota –Malá velikost –Více kopií v buňce •Metody založené na denaturaci a renaturaci –Alkalická lyze –Lyze varem Alkalická lyze pro izolaci plazmidové DNA 1.Kultivace buněk v přítomnosti antibiotika 2.Šetrné odstranění buněčné stěny (lysozym) 3.Přídavek roztoku s NaOH •Denaturace bakteriálního chromozomu •ČÁSTEČNÁ DENATURACE PLAZMIDU 4.Přídavek neutralizačního roztoku •Vysrážení chromozomální DNA s proteiny •RENATURACE PLAZMIDOVÉ DNA 5.Odstranění bakteriální DNA centrifugací 6.Purifikace plazmidové DNA Izolace RNA •Izolace RNA fenolovou extrakcí je podobná izolaci DNA s následujícími rozdíly: –Inhibitory RNáz, sterilní boxy, DEPC-H2O, rukavice! –Extrakce v guanidinových solích –Fenolové extrakce při pH 5-6 –Extrakce trizolem –Odstranění DNA DNázami bez RNáz –Selektivní srážení RNA pomocí LiCl –Afinitní chromatografie na olido-dT kolonách pro izolaci mRNA RNA separovaná na bioanalyzátoru Agilent • Vzorek RNA izolovaný TRIzolem po ošetření DNázou, RIN = 8,8 23S rRNA mRNA 16S rRNA marker 2100-bioanalyzer-laptop-open-rnajpgjpg Izolace mRNA •mRNA tvoří pouze malý podíl z celkové RNA, proto je její izolace obtížná •Pro izolaci se využívají –Tradiční metody, kdy se nejprve izoluje celková RNA, která je následně separovaná na mRNA, rRNA a tRNA –Metody využívající afinitu poly(A) konce u mRNA a biotinem značené oligo(dT) sondy •Sonda se v lyzátu selektivně váže na mRNA, aniž by interagovala s DNA nebo jinými RNA •Hybridní molekuly biotinylované dT-A mRNA jsou imobilizovány na pevném podkladu pokrytém streptavidinem •Streptavidinem pokryté mikrozkumavky • •Streptavidinem pokryté magnetické částice • prod13b prod14c Adsorpční metody •Využívají schopnost nukleových kyselin adsorbovat se na povrchy z oxidu křemičitého (kolonky do centrifugačních mikrozkumavek) v přítomnosti chaotropní soli (Vogelstein and Gillespie, 1979) –guanidin thiokyanát –guanidin hydrochlorid –jodid sodný (NaI) •Síla vazby závisí na –Typu nukleové kyseliny (DNA nebo RNA) –Iontové síle –pH roztoku •Promývání pro odstranění proteinů a dalších kontaminant •Eluce DNA pufrem s nízkou koncentrací solí nebo H2O •Rychlá metoda, vysoký výtěžek (malé fragmenty), vysoká čistota Mechanismus interakce DNA s oxidem křemičitým ksgrafik.gif (18005 Byte) 2_15 Analýza a kvantifikace •SPEKTROFOTOMETRICKÁ METODA –Nukleové kyseliny absorbují UV záření s maximem absorbance v oblasti vlnové délky okolo 260 nm –Koncentraci stanovujeme na základě empirie: – – – – – –Vhodná metoda pro měření vzorků, které jsou •V dostatečné koncentraci •Dostatečně čisté bez významného množství kontaminant principy izolace DNA II6 copy images (1) images