Hybridizace nukleových kyselin Tvorba dvouřetězcových hybridů za dvou jednořetězcových a komplementárních molekul Založena na schopnosti denaturace a renaturace DNA. Denaturace DNA • oddělení komplementárních vláken DNA působením vysoké teploty (90-100^oC), extrémních hodnot pH nebo denaturačních činidel (formamid, močovina) • změna v uspořádání bazí při denaturaci zvyšuje absorbci světla při vlnové délce 260 nm (hyperchromní efekt) Renaturace • opětná tvorba dvouřetězcových struktur z jednořetězcových polynukleotidů za vhodných připojovacích („annealing“) podmínek • nastává při pomalém ochlazování (65^oC) roztoku teplem denaturované DNA • nenastává při prudkém ochlazení roztoku DNA s vyšší teplotou než T[m] • při renaturaci se mohou tvořit hybridní molekuly DNA/DNA, RNA/RNA i DNA/RNA • rozsah renaturace odpovídá rozsahu komplementarity sekvencí Využití hybridizace nukleových kyselin • test komplementarity sekvencí (ve směsi mnoha molekul DNA budou hybridizovat jen ty, které jsou dostatečně komplementární) – z toho lze vyvozovat stupeň příbuznosti testovaných organismů • testy genové exprese (hybridizovat mnohou i molekuly DNA a RNA) • lokalizace genů na chromozomech • testy paternity, identifikace osob, atd. • amplifikace nukleových kyselin pomocí PCR (připojení primeru k templátu je rovněž typ hybridizační reakce) • vyhledávání klonů nesoucích rekombinantní DNA • čipové technologie („microarrays“) • spojování fragmentů při klonování • základem hybridizace je vždy značená sonda o známé nukleotidové sekvenci Uspořádání hybridizačního experimentu je rozmanité podle povahy prostředí, ve kterém probíhá Typy přenosu z gelu na membránu podle typu analyzovaných molekul • Southernův přenos - DNA • northernový přenos - RNA • westernový přenos - proteiny • southwesternový přenos - proteiny vázající DNA (sondou je DNA) • northwesternový přenos - proteiny vázající RNA (sondou je RNA) Typický hybridizační experiment - Southernův blot (přesávka) • technika vyvinuta E.M. Southernem • běžné použití při detekci přítomnosti určitých genů v buněčné DNA nebo při sledování evoluční příbuznosti vzorků DNA z různých organismů Southernův blot (přesávka) - postup • rozdělení restrikčních fragmentů DNA daného vzorku gelovou elektroforézou • denaturace DNA a přenos jednořetězcových fragmentů DNA na nylonový filtr („blotting“ - přesávka) • inkubace filtru se značenou jednořetězcovou sondou - dojde k hybridizaci sondy s komplementární sekvencí imobilizovanou filtru • odmytí nenavázané sondy • detekce navázané sondy - vizualizace hybridů (autoradiografie) Ukázky provedení hybridizace • SouthernHybridization.mov • hybrid2.mov • hybrid3.mov • hybrid4.mov Způsoby přesávky („blotingu“) • kapilární přenos • elektroforetický přenos • vakuový přenos Kapilární přenos Tečková hybridizace („dot blot“) Postup: • sonikace nebo restrikce genomové DNA; linearizace plazmidové DNA • denaturace • vzorky DNA naneseny na podložku v podobě teček • hybridizace se sondou • hodnocení hybridizace (vizuálně, denzitometrem, -spektrometrem) Typy sond • restrikční fragmenty dvouřetězcové DNA (cDNA) • mRNA izolovaná z buněk nebo tkání • RNA transkripty in vitro • syntetické oligonukleotidy (připravené podle sekvence aminokyselin) Způsoby značení sond • pomocí náhodných hexanukleotidů („random primer DNA labeling“) • posunem jednořetězcového zlomu („nick translation“) • koncové značení • značení vektoru s naklonovanou sondou • značení transkriptů in vitro (RNA) Značení konců DNA fragmentů Neradioaktivní značení sond • Digoxineninem • Biotinem • fluorescenčními značkami (fluorescein, rhodamin, kumarin) Neradioaktivní značení nukleových kyselin digoxigeninem Neradioaktivní značení nukleových kyselin biotinem Hybridizační postup • Prehybridizace - zabránění nespecifické vazbě sondy na membránu • Hybridizace - navázání sondy na komplementární sekvence (68^oC, 42^oC s formamidem) - lze volit různé podmínky hybridizace („stringence“) Hybridizační postup 3. Promývání - odstranění nenavázané sondy (účinnost je ovlivněna teplotou, koncentrací solí) 4. Detekce navázané sondy - autografie - imunologická reakce - barvení - luminiscence -fluoroscence Hybridizační postup 5. Rehybridizace - odmytí navázané sondy - aplikace další sondy Využití hybridizačních technik v praxi Hybridizace in situ Detekce DNA nebo RNA v intaktních buňkách radioaktivními nebo fluorescenčními sondami. Využití: • prostorová lokalizace nukleových kyselin v buňkách a tkáních (hybridizace buněčné RNA) • lokalizace genů (sekvencí) na chromozómech (hybridizace jaderné DNA) Obvyklá fluorescenční barviva • fluorescein (zelená fluorescence) • rhodamin (červená fluorescence) • kumarin (modrá fluorescence) Lokalizace specifických sekvencí v genomové DNA Southernova analýza potomků heterozygotních rodičů (RFLP) Ribotypizace bakterií