METODY MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE Jan Šmarda, Jiří Doškář, Roman Pantůček, Vladislava Růžičková, Jana Koptiková Masarykova univerzita Metody molekulární biologie Jan Šmarda Jiří Doškář Roman Pantůček Vladislava Růžičková Jana Koptíková Brno 2005 3 Obsah Předmluva............................................................................................................................ 5 I. Purifíkace a separace nukleových kyselin (J, Doškář, V. Růžičková, R. Pantůček, J. Šmarda)....................................................................................................................... 7 1. Extrakce a purifíkace nukleových kyselin ............................................................ 7 2. Centrifugace ....................................................................................................... 10 3. Elektroforéza nukleových kyselin ...................................................................... 13 II. Manipulace s nukleovými kyselinami (J. Doškář a J. Šmarda) ................................. 17 1. Enzymy používané k úpravám nukleových kyselin............................................ 17 2. Hybridizace nukleových kyselin......................................................................... 20 III. Klonování DNA (J. Doškář)....................................................................................... 29 IV. Fyzikální mapováni DNA (genomu) (J. Doškář a R. Pantůček)...............................45 1. Konstrukce restrikčních map ..............................................................................45 2. Detekce polymorfizmu v genomech................................................................... 54 V. Stanovém sekvence DNA (sekvencování DNA) (R. Pantůček) .................................59 VI. Amplifíkace nukleových kyselin (R. Pantůček a J. Doškář) ..................................... 73 1. Polymerázová řetězová reakce (PCR) ................................................................ 73 2. Varianty a modifikace PCR................................................................................ 85 3. Amplifíkace nukleových kyselin za nepřítomnosti termoíllní DNA-polymerázy.............................................................................................. 104 4. Metody pro amplifikaci sondy.......................................................................... 106 VII. Transgenika (J. Šmarda)......................................................................................... 111 1. Transfekce přechodná a stabilní ....................................................................... 111 2. Cílené zásahy do genové exprese ..................................................................... 116 VIII. Analýza genové exprese (J. Šmarda) .................................................................... 121 1. Studium transkripce.......................................................................................... 121 2. Srovnání transkriptomů .................................................................................... 126 3. Analýza promotorů a interakcí protein - DNA................................................. 133 4. Analýza translace.............................................................................................. 137 5. Analýza meziproteinových interakci ................................................................ 148 IX. Metody molekulární virológie (V. Růžičková)....................................................... 151 X. Bioinformatika (R. Pantůček) ................................................................................... 161 1. Molekulárně biologické databáze ..................................................................... 162 2. Textové vyhledávání v databázích.................................................................... 163 3. Vyhledávám podobnosti sekvencí .................................................................... 167 4. Vyhledávání genů a funkčních oblasti.............................................................. 170 5. Klasifikace proteinů.......................................................................................... 170 Seznam anglických zkratek.............................................................................................. 173 Literatura.......................................................................................................................... 177 Rejstřík............................................................................................................................. 181 Předmluva Tato učebnice je určena studentům bakalářských a magisterských studijních programů přírodovědeckých, lékařských a veterinárních vysokých škol a laboratorním pracovníkům, kteří se zajímají o základní metodické přístupy současné molekulární biologie. Cílem autorů je poskytnout čtenářům přehled těchto metod, popsat jejich principy a vysvětlit možnosti jejich praktických aplikací. Současně s dynamickým vývojem celého oboru molekulární biologie se objevují a rychle rozšiřují nové technologie a metodické přístupy. Tato učebnice si neklade za cíl poskytnout celkový přehled a současném stavu v této oblasti, ale zaměřuje se na základní „klasické" metody, jejichž principů však často využívají i ty nejmodernější metody současnosti. Pro zvýšení názornosti jsme velkou pozornost věnovali obrázkům, ve kterých jsme se snažili schematicky znázornit principy popisovaných metod. Věříme, že učebnice věnovaná principům základních metod molekulární biologie pomůže odstranit citelnou mezeru v nabídce učebních textů tohoto typu. Autoři děkují sponzorům, nakladatelství Espero Publishing, s.r.o., za poskytnutí předloh k některým obrázkům a recenzentům za laskavé posouzení práce a cenné připomínky. V Brně, 10. 9. 2005 Jan Šmarda za autorský kolektiv I. Purifikace a separace nukleových kyselin 1. Extrakce a purifikace nukleových kyselin První fází většiny metod, které popisujeme v této knize, je extrakce DNA nebo RNA z buněk a jejich oddělení od ostatních buněčných složek. Kvalita izolovaného materiálu často rozhoduje o úspěšnosti navazujících postupů. Cílem purifikaČních procesů je získat nukleovou kyselinu v nativním stavu v dostatečném množství a čistotě. Metody izolace nukleových kyselin využívají (1) rozdílné rozpustností biologických makromolekul, (2) adsorpce na pevný podklad nebo (3) ultracentrifugace v gradientních roztocích. Výběr metody purifikace DNA nebo RNA závisí na způsobu její následné analýzy. NapF. DNA určená k hybridizaci musí být zbavena kontaminujících látek jakými jsou napF. glykogen, proteiny nebo ionty kovů, které by mohly bránit reasociaci DNA. Rovněž požadavky na množství a integritu izolované nukleové kyseliny se mohou u různých metod podstatně lišit. Napr. polymerázová řetězová reakce nevyžaduje velké množství vstupního materiálu, zatímco pro podrobné genetické analýzy je vhodné připravit nukleovou kyselinu v dostatečném zásobním množství. Jiné typy analýz jako pulzní gelová elektroforéza nebo štěpení BAL31 vyžadují zase vysokou integritu izolované DNA. LYŽE BUNĚK A TKÁNÍ. Existuje mnoho různých metod purifikace nukleových kyselin, ale jejich základní rysy jsou společné. Prvním předpokladem je dostupnost vstupního materiálu, kterým mohou být např. kultury bakteriálních nebo eukaryotických buněk, které je třeba oddělit od růstového média (obvykle centrifugací) nebo komplexnější vzorky tkání a pletiv, které musí být před lyží buněk homogenizovaný. Rostlinná pletiva se např. rozmělňují v tekutém dusíku nájemný prášek. Zdrojem DNA mohou být také buněčné orga-neíy nebo virové částice izolované centrifugací v hustotním gradientu (str. 12). Pokud je to možné, měl by být vstupní materiál čerstvý, zamražený nebo lyofilizovaný, aby se zabránilo degradaci nukleových kyselin enzymy přítomnými v buněčném extraktu. K uvolnění vnitřního obsahu buněk je nutné vyvolat lyži buněčné stěny. Výběr způsobu indukce lyže závisí na typu buňky. Stěny bakteriálních buněk se obvykle rozrušují lysozymem, tj. enzymem, který se přirozeně vyskytuje ve vaječném bílku a slzách. Současně s lysozymem se používají detergenty pro solubilizaci cytoplazmatické membrány (např. laurylsíran sodný) a chelatační činidla (např. EDTA), která jednak vážou dvoj mocné kationty a tím destabilizují vnější bakteriální membránu, jednak inhibují deoxyribonukleázy (DNázy). Stěny buněk rostlin a hub se od stěn buněk bakteriálních liší svým chemickým složením, a proto vyžadují jiné způsoby degradace. Často se využívá mechanické dezintegrace kombinované s působením degradačních enzymů, např. celuláz. Lyži živočišných buněk, které nemají buněčnou stěnu, lze indukovat jemnějšími metodami, např. slabými neiontovými detergenty. Po rozrušeni buněčné stěny a plazmatické membrány se v roztoku objeví jejich degradační produkty spolu se nitrobuněčnými složkami a vzniká komplexní směs DNA, RNA, proteinů, lipidů, sacharidů nízkomolekulámích látek a uhlovodíků. Lyže buňky obvykle vede k fragmentaci chromozómové DNA. Pokud se má izolovaná DNA zachovat intaktní, je nutné použít co nejjemnějších podmínek lyže, tj. udržovat lyzační směs v pufrovaném médiu a chladu. Důležité je rovněž vyhnout se fragmentaci DNA, ke které může dojít při pipetování lyzátu. PŘEČIŠŤOVACÍ ENZYMY. Odstraněni RNA z purifikované DNA lze snadno dosáhnout působením ribonukleázy (RNázy), Tento enzym je stabilní i při vysoké teplotě a proto je možné jej zahřátím na teplotu 65 °C zbavit stop nežádoucích deoxyribonukleáz, h; PUR1FIKACE A SEPARACE NUKLEOVÝCH KYSELIN které by DNA mohly poškodit. Odstranění DNA při purifikaci RNA bývalo obtížnější, protože vyžadovalo použití DNázy postrádající jakoukoliv RNázovou aktivitu. V současné době jsou však tyto enzymy komerčně dostupné. Přečištění purííikované nukleové kyseliny působením zmíněných enzymu se používá jen v některých postupech. Pokud určitá kontaminace nukleové kyseliny není vdaném postupu na závadu nebo k jejímu odstranění postačují následné puriťikační kroky, je možné tento krok vynechat. Pro odstranění proteinů z buněčných lyzátů se používají proteäzy, např. proteináza K nebo pronáza E. Odstraněni proteinů je při purifikaci nukleových kyselin velmi důležité, protože buňky obsahují jednak řadu enzymů, které nukleové kyseliny degradují, a dále proteiny, které se na DNA vážou a tak mohou omezovat účinnost následujících experimentů. EXTRAKCE SMĚSÍ FENOL-CHLOROFORM. Klasickým a stále hojně používaným postupem pro odstranění proteinů z buněčných lyzátů je extrakce pufrem ekvilibrova-ným fenolem nebo směsí fenolu a chloroformu. Tyto organické látky se nemísí s vodou, a proto po přidání do vodného prostředí buněčného lyzátů způsobí tvorbu dvou vrstev (fází). Když se směs důkladně promíchá, dojde k denaturaci proteinů a jejich vysrážení. Sraženinu proteinů lze centrifugací koncentrovat do fázového rozhraní, oddělujícího těžší organickou fázi od lehčí vodné fáze. Pokud se používá fenol ekvilibrovaný neutrálním nebo alkalickým pufrem, nukleové kyseliny (DNA i RNA) zůstávají ve vodné fázi. Pokud se k extrakci použije kyselý fenol, přechází DNA do organické fáze a ve vodné fázi zůstává pouze RNA. Této skutečnosti se využívá při izolaci RNA. Existují však i takové lyzační postupy, které s využitím solí zvýší hustotu vodné fáze natolik, že dojde k převrácení fází. SRÁŽENÍ NUKLEOVÝCH KYSELIN ALKOHOLEM. Po extrakci fenolem máme k dispozici vodný roztok nukleové kyseliny zbavený proteinů, který je však pravděpodobně příliš naředěný a navíc zřejmě obsahuje stopy fenolu a chloroformu. Obzvláště fenol má určitý stupeň rozpustnosti ve vodě a mohl by způsobit nežádoucí denaturaci enzymů při další práci s purifikovanou nukleovou kyselinou. Převedení nukleové kyseliny do malého objemu a její přečištění je možno zajistit srážením (precipitací) alkoholem, obvykle etanolem nebo izopropanolem. Za přítomnosti jednomocných iontů (Na+, K+ nebo NH4+) je možné nukleové kyseliny srážet do podoby agregátu, který při centrifugací sedimentuje na dno zkumavky. Účinnému srážení nukleových kyselin v nízkých koncentracích napomáhá snížení teploty na -70 °C a přidání solí (2M NaCl, 2M LiCl, 3M octan sodný nebo I0M octan amonný). Je-li naopak třeba zvýšit selektivitu sráženi pro DNA, tj. minimalizovat současnou precipitací RNA, provádí se srážení při laboratorní teplotě. Soli mohou být částečně sráženy spolu s nukleovou kyselinou a z precipitátu se odstraňují promytím 70% etanolem. Po odpaření etanolových par se DNA rozpustí ve vodném roztoku, který obvykle obsahuje pufr Tris-HC1 (pH 7,5-8,0) a inhibitor nukleáz, EDTA. Způsob uchování nukleové kyseliny závisí na její velikosti, konformaci a dalším využití. Roztok DNA se obvykle uchovává při 4 °C. Teplota -20 °C není vhodná pro lineární DNA o velikosti přesahující 20 kb, která je křehká a během zamrazování a rozmrazování se snadno láme. Pokud je třeba DNA skladovat dlouhodobě ve zmrazeném stavu, je vhodněji předem rozdělit do několika alikvotů. ALKALICKÁ DENATURACE. Tato metoda se běžně používá pro oddělení plazmidů od chromozómové DNA v extraktech bakteriálních buněk. Chromozómová DNA je v extraktech bakteriálních buněk přítomna v podobě lineárních fragmentů, které vznikají při částečné fragmentaci DNA v průběhu lyže buněk. Při zvýšení pH na hodnotu kolem 12 se přeruší vodíkové vazby mezi nukleotidy a dochází tak k odděleni lineárních řetězců - denaturaci DNA. Plazmidy běžných velikostí, které se používají při klonování DNA, jsou stabilnější a protože zůstávají v nadšroubovicové formě, nejsou během lyže buňky porušeny. I když vysoké pH způsobí přerušení vodíkových vazeb i v píazmidové DNA, její řetězce se nemohou fyzicky oddělit, a po následném snížení pH se snadno obnoví původní struktura PURIFIKACE A SEPARACE NUKLEOVÝCH KYSELIN izolace RNA plazmidu chromozómové DNA vínové RNA ^/ krev, buňky tkáně bakterie krev, buňky íkáně krev, sérum plazma lyže 1 dvouřetězcové DNA plazmidu. Naopak oddělené řetězce chromozómové DNA nemohou tak rychle renaturovat, agreguji v přítomnosti SDS, který je součástí lyzačního pufru a octanu draselného, který je použit k neutralizaci lyzátu s proteiny a dalšími složkami buněk (např. zbytky buněčných stěn) do nerozpustné hmoty, která může být odstraněna eentrifiigací. P lazmi do vá DNA, která v roztoku zůstává, je dostatečně čistá a použitelná pro mnoho aplikací, včetně restrikčního štěpení. Pokud je třeba provést další přečištění plazmidové DNA, je vhodné provést přesrážení octanem amonným a i zo propan o lem, afinitní c hrom ato grafit nebo centrifugaci v gradientu CsCl s etidi um brom idem. PURIFÍKACE NUKLEOVÝCH KYSELIN CHROMATOGRAF1Ĺ Při purifikaci nukleových kyselin na chromatografických koionkách, které jsou často vsazeny do centri-fugačních mikrozkumavek a kombinují tak chromatografii s centrifugaci („spin columns") se používají dva hlavní přístupy. Při gelové chromatografii se vzorek nanáší na kolonu, jejíž náplň je tvořena malými porézními zrnky nosiče. Malé molekuly, jako soli, volné nukleotidy, at& prostupují do porézní matrice a tím zpomalují svůj pohyb kolonou, zatímco velké molekuly nukleových kyselin zrnky matrice neprostupují a procházejí proto kolonou rychleji. Tento typ puriťíkace představuje účinnou alternativu k purifikaci DNA srážením alkoholem. Při afinitní chromatografii je zajištěna interakce mezi makromolekulami vzorku a náplní kolony. Může se jednat o interakci elektrické povahy, založené na afinitě k Sadně nabitých chemických skupin nosiče k negativně nabitým zbytkům kyseliny fosforečné v molekule DNA (iontoměničová chromatografie) nebo o více specifickou interakci např. mezi sekvencemi oligo-dT vázanými na zrnka nosiče a sekvencemi po by-A f které jsou přítomny na koncích molekul eukaryotické mRJMA. V obou případech se využije i mobilizace nukleových kyselin na nosiči a odmytí nežádoucích molekul, které kolonou volně procházejí. Následně, použitím jiného pufru se molekuly nukleových kyselin z nosiče uvolní. Nukleové kyseliny izolované prostřednictvím chromatografie kých technik mají vysoký stupeň čistoty. V současné době je k dispozici řada komerčních sestav uzpůsobených pro využití afinitní chromatografie pro izolaci DNA z nejrůznějších materiálů (obr. 1). Tyto komerční sestavy často používají afinitní membrány místo klasických sloupcových nosičů. nanášení vzorku nukleové kyseliny na kolonku zachyceni nukleové kyseliny na nosiči Odstředěni odstředěn vymytí nukleové kyseliny odstředěni V roztok čisté nukteové kyseli< Obr. 1 Izolace a purifikace nukleových kyselin na chromatografických kolonkách 10 PURIFIKACE A SEPARACE NUKLEOVÝCH KYSELIN PURIFIKACE RIBONUKLEOVÝCH KYSELIN. Vzhledem k tomu, že molekuly RNA jsou mnohem méně stabilní než molekuly DNA, izolace RNA je náročnější a vyžaduje přísnější podmínky, např. použití vody upravené inhibitorem RNázy (0,1 % dietylpyrokarbo-nátem) a výchozí materiál z živočišných tkání je homogenizován za přítomnosti antioxidač-ních činidel (p-merkaptoetanol, dithiotrettol). Proteiny se odstraní fenolem ekvilibrovanym vodou při 60 °C. Oddělení jednotlivých frakcí se provádí chlazenou centrifugací. Kontaminující DNA je odstraněna DNázou zbavenou RNáz. RNA se sráží etanolem za přítomnosti LiCl a uchovává v roztoku pufru při -70 °C. Získání neporušené velmi čisté RNA je základním předpokladem pro řadu důležitých experimentů, napr. pro northernový přenos, translaci in vitro, RT-PCR, zakládání knihoven cDNA, atd. DETEKCE A KVANTIFIKACE NUKLEOVÝCH KYSELIN. Pokud je purifiko-vaná DNA dostatečně čistá, tj. zbavená všech látek, které absorbují ultrafialové záření (např. RNA, volných nukleotidů, proteinů), lze odhadnout její koncentraci spektrofotometrickým měřením absorbance roztoku při vlnové délce 260 nm. Tento způsob stanovení koncentrace DNA je jednoduchý, ale ne příliš selektivní. Roztok dvouřetězcové DNA o koncentraci 50 ug/ml má absorbanci 1. Tuto hodnotu však pozmění přítomnost proteinů nebo fenolu v roztoku DNA. Navíc údaj o úrovni absorbance nepodává informaci o integritě molekuly DNA. Pro detekci a kvantifikaci nukleových kyselin se běžně používají barviva typu etidi-umbromidu, Etidiumbromid je fenantridinové barvivo, které má plochou kruhovou strukturu umožňující jeho vmezeření (interkalaci) mezi báze nukleových kyselin. Komplex DNA s navázaným barvivem pak může být detekován v červeno-oranžové části spektra vzhledem ke své fluorescenci po ozáření ultrafialovým světlem. Uvedený způsob se nejčastěji používá pro barvení molekul nukleových kyselin rozdělených ultracentrirugací (kapitola 2) nebo gelovou elektroforézou (kapitola 3) a může se rovněž použít pro stanovení koncentrace DNA nebo RNA ve vzorku, pokud je k dispozici referenční vzorek o známé koncentraci. Pro kvantifikaci jednovláknové DNA, např. oligonukleotidových příměrů se rovněž používá spektro-fotometrický přístup. Absorbance 1 roztoku jednovláknové DNA při vlnové délce 260 nm je v tomto případě ekvivalentní koncentraci 30 (ig/ml. Analogický přístup je vhodný pro kvantifikaci jednovláknové RNA. Absorbance 1 při stejné vlnové délce odpovídá koncentraci RNA 40 ng/ml. 2. Centrifugace Centrifugace patri k separačním metodám, které se v molekulární biologii používají k izolaci, purifikaci a charakterizaci biomakromolekul a buněčných struktur. Základním principem separace založené na centrifugačních technikách je pohyb částic v tekutém prostředí pod vlivem odstředivého pole, které vzniká otáčením rotoru centrifugy. Rychlost, s jakou částice sedimentuje, závisí na její velikosti, tvaru a hustotě a je ovlivňována rovněž vlastnostmi prostředí a podmínkami, při nichž centrifugace probíhá. Veličina, kterou lze rychlost pohybu částice při centrifugací charakterizovat, se označuje jako sedimentační koeficient nebo též hodnota S. STANOVENÍ SEDIMENTAČNÍHO KOEFICIENTU. Rychlost sedimentace částice při centrifugací lze vyjádřit obecným vztahem: dr/dt = S.a = s.úřr, kde r je vzdálenost částice od osy otáčení, t je doba centrifugace, PURIFIKACE A SEPARACE NUKLEOVÝCH KYSELIN 11 a je odstředivé zrychlení, S je sedimentační koeficient a ca je úhlová rychlost rotoru při otáčení, Po úpravě a integraci uvedeného vztahu získáme rovnici podle níž lze vypočítat hodnotu sedimentačního koeficientu analyzované částice, jestliže známe její polohy n a r2 v centrifugační zkumavce v příslušných časových intervalech tv a í2 a rychlost otáčení. Abychom mohli srovnat hodnoty S stanovené při různých podmínkách centrifugace, jsou získané hodnoty obvykle přepočítány na standardní podmínky. Tím získáme hodnoty standardních sedimentačních koeficientů ^o^, které charakterizují sedimentaci částic o koncentraci blízké nule ve vodě při 20 °C. Hodnoty koeficientů se pro většinu biomakromolekut a molekulárních komplexů pohybují v rozmezí řádů 10"M až l(T13 sekund. Vyjadřují se proto ve Svedbergových jednotkách (S), kde 1 S (Svedberg) - 10"13 sekundy. Hodnot sedimentačních koeficientů se využívá k popisu a charakterizaci biomak-romolekul, buněčných organel a jejich struktur. Příkladem je označování jednotlivých druhů ribozomových RNA (23S-rRNA, lóS-rRNA) nebo ribozomových podjednotek (30S, 50S). Pro jednotlivé typy biormkromotekul lze z hodnot sedimentačních koeficientů vypočítat pomocí empirických vztahů rovněž jejich moiární hmotností. DIFERENCIÁLNÍ CENTRIFUGACE. Jestliže se centrifugaci v homogenním roztoku podrobí směs částic podstatně se lišících svou velikostí, hmotností nebo hustotou, budou jednotlivé složky směsi sedimentovat různou rychlostí. Opakovanou centrifugaci při postupném zvyšování otáček tak lze z původní směsi získat jednotlivé složky nebo frakce ve formě sedimentu (obr. 2). Tento postup se označuje jako diferenciální centrifugace a využívá se nejčastěji jako výchozí krok pro hrubou separaci a izolaci složek z lyzátů buněk nebo homogenátů tkání, např. buněčných jader, ribozomů, mitochondrií, buněčných membrán, nukleových kyselin a proteinů. ZONÁLNÍ CENTRIFUGACE. Fyzikální vlastnosti jednotlivých komponent přítomných ve výchozí směsi a tím i rychlost jejich sedimentace nejsou vždy odlišné natolik, aby je bylo možné diferenciální centrifugaci účinně separovat. Příkladem mohou být různé typy nukleových kyselin, ribozomálních podjednotek, nebo jiné částice, vykazující podobné vlastnosti. Pro separací těchto látek se využívá zonáíní centri fugace, při níž je homogenní roztok v centrifugační zkumavce nahrazen roztokem, jehož koncentrace od povrchu ke dnu zkumavky narůstá. Takový roztok se označuje jako gradientní. K jeho přípravě se používají dobře rozpustné a vůči analyzovaným částicím inertní látky, jako je např. sacharóza nebo glycerol. Vzrůstající hustota a tím i viskozita gradientní ho roztoku eliminují ví i v vzrůstajícího odstředivého zrychlení směrem od osy otáčení, čímž brání nárůstu rychlosti sedimentace částic v průběhu centrifugace. Před zahájením centrifugace se vzorek obsahující směs Částic nanese v tenké vrstvě na povrch gradientního roztoku v centrifugační zkumavce. Jednotlivé složky výchozí směsi budou v závislosti na své velikosti, tvaru a hustotě při centrifugaci sedimentovat gradientní m roztokem různou rychlostí a vytvářet dobře oddělené zóny. Gradient roztoku zároveň zabraňuje vnitřnímu proudění roztoku ve zkumavce, tím udržuje stabilitu a ostrost vytvořených zón a umožňuje tak jejich následné odebrání. Volbou vhodných podmínek při zonální centrifugaci lze dosáhnout toho, aby rychlost sedimentace částic byla v průběhu centrifugace konstantní. Tento způsob centrifugace je označován jako izokinetická centrifugace a je využíván k podrobnější charakterizaci částic, 12 PURIFIKACE A SEPARACE NUKLEOVÝCH KYSELIN napr. k přesnému stanoveni jejich velikosti, Pfi analýze nukleových kysehn se např. používá 5-20% sacharózový gradient, v němž se koncentrace sacharózy lineárně mění od hladiny (5% roztok) ke dnu zkumavky (20% roztok). Pohyh vytvořených zón lze monitorovat bud' přímo během centrifugace pomocí speciálních zařízení, která jsou součástí analytických centrifug, nebo lze jej ich polohu stanovit po ukončeni centrifugace buď spektrofotometricky, nebo změřením radioaktivity jednotlivých frakcí (obr. 2). - diferenciální centrifugace směs látek v roztoku centri (uface pfi nízkých otáčkách [1 ODQgJ shromážděni sedimentu centrifugace supĚmalantu prfi středních ot^atíách Í20 QGOg) shromážděni sedimentu centrifugace supamatantu j&f) vysokýnh otéčkácti (80 000 g) \m> J _ izokinelická centrifugace íl o o vzorek nanesený na povrch 5 - 20 % sacharozověho gradientu centrifugace pomaleji sedimentujici Částice rychleji sedimentujici častice frakcionace obsahu zkumavky izopyknická centrifugace Q O roztok OSO fi obsahuji eí směii častíc centri fugacč J částice s niž!i hustotou částice s yyšäí hustotou. frakci o nace obsahu zkumavky UUUU UUUU sběr frakcí Obr. 2 Základní typy centrifugace IZOPVKNICKA CENTRIFUGACE, Při této metodě -centrifugace, označované též jako hustotní centrifugace nebo centrifugace do rovnováhy, se částice separují podle své hustoty. NejjednodušŠí provedení této metody spočívá v přípravě homogenní směsí analyzovaných částic ve vhodném mediu a následné centríŕugaci. Během centrifugace tato media sama vytvoří koncentrační a tím i hustotní gradient, v němž se částice analyzovaných látek pohybují oběma směry tak dlouho, dokud nedosáhnou polohy, v níž je hustota roztoku shodná s hustotou částic (obr. 2). Takto stanovená hustota se označuje jako vznášivá hustota. Její hodnoty jsou ovlivněny interakcí částic s ionty ro2toku a jsou obvykle vyšší než je hustota částic v buňkách. Při jiném postupu se gradient připravuje v centrifugaČní zkumavce předem postupným navrstvováním roztoků o různé koncentraci a vzorek je pak nanesen na jeho povrch. Gradienty tohoto typu mohou být kontinuální nebo diskontinuální, podle toho, zda se koncentrace roztoku mění plynule nebo stupňovitě. V obou případech jsou po ukončení centrifugace Částice příslušného druhu zkoncentrovány do úzkých pruhů, které lze detekovat a izolovat stejným způsobem jako při zonální centrífugaci. K přípravě hustotních gradientů se používají látky, které se vyznačují vysokou rozpustností. Běžně používanými látkami jsou chlorid česný nebo sacharóza. Rozdíly hustot, které lze dosáhnout, se pohybují v rozmezí 1,0-1,3 g/ml u sacharózy a 1,0-1,9 g/ml u CsCl, což umožňuje separovat a izolovat např. buněčná jádra, mitochondrie, nukleové kyseliny atd. o vysoké čistotě. PURIF1KACE A SEPARACE NUKLEOVÝCH KYSELÍN 13 Separace částic na základě odlišné hustoty se využívá nejen k jejich izolaci, ale může být využita rovněž k podrobnější charakterizaci. Je známo, že vznášivá hustota dvouretězco-vé DNA je významně ovlivněna zastoupenim jednotlivých typů párů nukleotidových bází, čehož lze využít ke stanovení podílu GC-párů v DNA. Platí, že %(G+C) = {p- 1,660/0,098) x 100, kde p = vznášivá hustota vzorku dvouřetězcové DNA. Speciálním případem využití izopyknické centrifugace je separace odlišných strukturních typů DNA v gradientech CsCl za přítomnosti etidiumbromidu. Po navázáni etidium-bromidu na DNA se její vznášivá hustota významně snižuje, přičemž množství navázaného etidiumbromidu a tím i pokles hustoty DNA závisí na jejím strukturním typu. To umožňuje vzájemně separovat a izolovat různé formy DNA, např. kovalentně uzavřené kružnice plazmidových DNA od otevřených a lineárních molekul plazmidové a chromozómové DNA. Každý z uvedených typů centrifugačních technik lze využít jak k preparativním účelům, jejichž cílem je izolace jednotlivých složek směsi, tak i k účelům analytickým, kde je cílem stanovení vlastnosti zkoumaných látek, např, velikosti nebo hustoty. Hovoří se pak o preparativní a analytické centrifugaci. 3. Elektroforéza nukleových kyselin HJC=CH-C-NH2 O H H i i 1 II * II 1 O O NrW-metylerbisakrylam id Elektroforéza patří v molekulární biologii k nej používanějším separačním technikám při izolaci a analýze nukleových kyselin a bílkovin. Principem elektroforetické separace je pohyb nabitých molekul v elektrickém poli. Hlavním nositelem náboje nukleových kyselin jsou negativně nabité fosfátové skupiny, a proto nukleové kyseliny v elektrickém poli pohybují k opačně nabité elektrodě - anodě. GELOVÁ ELEKTROFORÉZA. Z praktických důvodů se elektroforéza neprovádí přímo v roztoku, ale ve vhodném nosiči. Tím bývá obvykle gel. Elektroforetické gely používané pro separaci nukleových kyselin jsou nejčastěji tvořeny polya-kryíamidem (obr. 3) nebo agarózou (obr. 4), které vytvářejí složitou síťovou strukturu polymerních molekul s póry, jejichž velikost lze ovlivnit složením roztoku a koncentrací polymeru. Agarózové gely jsou vhodné pro separaci molekul nukleových kyselín o velikosti od 100 bp až po zhruba 50 kb, polyakrylamidové gely se používají pro separaci menších molekul (10 až 1000 bp). Podle polohy gelu v elektroforetické aparatuře rozlišujeme horizontální a vertikální gelovou elektroforézu, které mají deskové uspořádání a dále kapilární elektroforézu, u níž je gel uvnitř kapiláry. —CHrCHf CHj-CH-^CH^-CHfcHrCH^CH,- NH2 NH C=0 c-o I NH, -CHrCH-(-CHrCH-fnCHrCH-[-CHrCH^CH!- r r NU, NH NH, c=o c=o I í 1 1 Obr. 3 Polyakrylamidové gely jsou tvořeny kopo-lymerem akryl amidu (propen amidu) a jV.jY-metylen-bisakrylamidu 14 PURIFIKACE A SEPARACE NUKLEOVÝCH KYSELIN Rychlost pohybu molekul DNA v gelu označovaná jako elektroforetická pohyblivost je nepřímo úměrná logaritmu jejich velikosti. Při posuzování etektrofore-tické pohyblivosti dané molekuly DNA není třeba brát v úvahu velikost náboje, protože nukleové kyseliny mají náboj rov-Obr.4 Struktura agarózy. Agaróza je lineární nomérně rozložen a jeho velikost je na polysacharid tvořený P-D-galaktopyra- jednotku délky molekuly stejná. Velikost nózou a 3,6-anhydro-P-L-galaktopyranó- molekuly DNA nebo jejího fragmentu zou, které jsou spojeny glykozidovými 0 neznámé velikosti lze proto stanovit vazbami srovnáním jejich eíektroforerické pohybli- vosti s elektroforetickou pohyblivostí molekul nebo fragmentů DNA o známé velikosti, které se označují jako standardy velikosti nebo hmotnostní standardy. Těmi bývají většinou reštrikční fragmenty plazmidových molekul nebo genomu bakteríofágů, jejichž přesná velí* kost byla stanovena sek věncování m DNA. Po dokončení elektroforézy je třeba identifikovat polohy separovaných molekul, které nejsou pouhým okem viditelné. Molekuly DNA lze snadno zviditelnit obarvením vhodným barvivem Nejčastěji je používán etidiumbromid, který se vmezeřuje mezi sousední páry bází v DNA a vytváří s ní komplex, který po osvětlení ultrafialovým světlem červeně fluoreskuje, Molekuly DNA o stejné velikosti jsou pak na gelu patrné jako proužky, jejichž intenzita je úměrná koncentraci DNA. Etidiumbromid lze použít rovněž pro barvení RNA, intenzita jejího zbarvení je však nižší. Namísto etidiumbromidu může být pro barvení nukleových kyselin použita také skupina fluorescenčních kyaninových barviv s komerčním označením SYBR. Pro detekci molekul DNA separovaných v polyakrylamídových gelech se rovněž používá barvení stříbrem. Pokud jsou molekuly nukleových kyselin radioaktivně označeny, znázorní se polohy proužků na gelu autoradiograficky. K detekci poloh fragmentů DNA lze využít rovněž hybridizace se značenou sondou. Gelová elektroforéza může být využita rovněž pro separaci a studium molekul DNA nacházejících se v různých molekulárních typech (konformacích). Lze tak odlišit kovalentně uzavření- kružnicové molekuly DNA od molekul lineárních nebo od otevřených kružnic. Nadšroubovicová (superhelikální) forma, otevřená kruhová forma a lineární forma DNA téže molekulové hmotnosti se pohybuje agarozovým gelem různou rychlostí, Relativní pohyblivost těchto tří forem závisí na podmínkách elektToforézy. Geíová elektroforéza je rovněž vhodným prostředkem pro studium interakcí mezi nukleovými kyselinami a proteiny, zejména těmi, které se vážou na specifické sekvence DNA (transkripční faktory, represory ap.). Metoda se označuje jako gelová zpomalovací analýza (retardační analýza, EMSA) (str. 135). Vychází z poznatku, že elektroforetická pohyblivost DNA se po vazbě proteinů snižuje. PULZNÍ GELOVÁ ELEKTROFORÉZA (PFGE). Při konvenční gelové elektiofo-réze se molekuly DNA pohybují přímočaře a plynule od katody k anodě a rychlost pohybuje úměrná jejich velikostí. Separace je podmíněna rychlejším průchodem menších molekul pórovitou strukturou gelu. Tento princip separace se uplatňuje u molekul DNA do velikosti přibližně 50 kb; molekuly větší velikosti se pohybuji stejnou rychlostí, aíe nerozdělí se, protože uvíznou v síťovité struktuře gelu. K jejich separaci se proto využívá pulzní gelová elektroforéza. Při PFGE je gel vystaven elektrickému poli, jehož směr se pod určitým úhlem (90-180°) v časových intervalech periodicky mění. Aby se molekuly DNA mohly pohybovat ve směru změněného elektrického pole, musí nejdříve změnit svou orientaci. Tento proces se PURIF1KACE A SEPARACE NUKLEOVÝCH KYSELIN 15 buňky na ředěné na požadovanou koncentraci ^zalití buněk do agarózy lyže a de p rote in a ce p-j r~J r~j j™j agarózové bločky štěpení vzácně štěpící j re stri kón i endonukieázau* nazývá reorientaee a doba nutná k jejímu uskutečnění se označuje jako reorientační čas. Větší molekuly DNA spotřebují na svou reorientaci víee času než molekuly menší a jejich výsledný přímočarý pohyb je proto pomalejší. Mezi rozhodující parametry při PFGE tedy patří kromě napětí, teploty a koncentrace elektroforetického pufru, které jsou významné i u konvenční elektroforézy, navíc i pulzní čas, který je možno udržovat v průběhu separace buď na konstantní úrovni nebo jej spojitě nebo nespojitě zvyšovat. Tím lze regulovat velikost molekul, které se za daných podmínek ještě pohybují, protože jejich reorientační čas je nižší než doba pulzu. Molekuly, které zvoleného limitu daného rozmezím pulzních časů nedosáhnou, zůstávají po elektroforéze nahromaděny v tzv. zóně komprese poblíž startu. Technika pulzní elektroforézy se využívá k separaci intaktních molekul DNA {např. chromozomů bakterií nebo kvasinek) nebo restrikčních fragmentů DNA o velikosti desítek kilo bází až několika megabází. Molekuly DNA, které se mají analyzovat pulzní gelovou elektrofo-rézou, nelze izolovat standardními metodami (např. fenolovou extrakcí nebo ad-sorbcí na chromatografíckých kolonách), při kterých dochází k jejích poškození. Pro izolaci se používá speciální postup (obr. 5), který zahrnuje kultivaci buněk do přesně stanovené hustoty a jejich smíchání s roztavenou agarózou s nízkým bodem tání. Buněčná suspenze se následně přenese do malé formičky. Lyže buněk a depro-teinace DNA pak probíhá v takto vytvořených agarózových bločcích, kde je DNA chráněna před nespecifickou fragmentací střižnými sílami při pipetování. Po depro-teinaci je třeba bločky několikrát promýt od proteinázy, aby se předešlo degradaci restrikčních enzymů a proteinázu nevratně inhibovat použitím 0,1-0,2 mM PMSF fťenylmetylsulťonylťluoridu). Při restrik-Čním štěpení umožňuje agaróza dobrou difúzi enzymů k DNA a agarózové bločky s naštěpenou DNA se mohou přímo nanášet na gel. Jako hmotnostní standardy se při pulzní gelové elektroforéze používají konkatemery plazmidů, koňkatemery DNA fága lambda, makrorestrikění fragmenty sgenomovou ONA pulzní geiová elektroforéza matrice agarózy Obr. 5 Schematický postup jednotlivých kroků při makrorestríkční analýze genomové DNA pulzní gelovou elektroforézou. Princip pohybu molekul v agarózovem gelu j c znázorněn v dolní Části obrázku; (A) Molekuly DNA o luzných velikostech v prostředí bez elektrického pole. (B) Separace molekul při konvenční gelové elektroforéze {molekuly o velikosti 50-500 kb se pohybují stejnou rychlostí). (C) Při pulzní elektroforéze je elektrické pole El přerušeno a nahrazeno polem E2 v jiném směru. Aby se DNA mohla pohybovat v novém směru, musí se nejdříve reorientovat. Větší molekuly pro svou reorientaci vyžadují delší dobu a proto dochází ke zpomalení jejich pohybu gelem. 16 PURIFIKACE A SEPARACE NUKLEOVÝCH KYSELIN bakteriálních genomů, chromozomy kvasinek Saccharomyces cerevisiae (240-2200 Kb) a Schizosaccharomyces pombe (3,5-5,7 Mb), chromozomy Dictyostelium discodium (3,6 až 9,0 Mb) nebo chromozomy Neurospora crrassa (4,0-10,3 Mb). DENATURAČNÍ GRADIENTOVA GELOVÁ ELEKTROFORÉZA (DGGE). Rozdíly v sekvenci (např. bodové mutace) v krátkých molekulách DNA o stejné délce mohou být detekovány denarurační gradientovou gelovou elektroforézou, která využívá rozdílné elektroforetické mobility u částečně denaturované DNA a DNA v nedenaturovaném stavu. Fragmenty DNA obsahující sekvenční polymorfizmus jsou obvykle připravené polymerázo-vou řetězovou reakcí. Vzorky DNA o velikosti 150-1200 bp se analyzují v polyakrylamido-vém gelu s lineárním de nátura Čním gradientem zajištěným vzrůstající teplotou nebo vzrůstající koncentrací denaturačního činidla (formamidu nebo močoviny). Dvouřetězcová DNA během elektroforézy zvolna denaturuje a vytváří větvené struktury s lokálními jednořetězco-vými oblastmi. Stejně dlouhé molekuly dvouřetězcové DNA s odlišnou sekvencí vytvářejí při denaturaci rozdílné struktury s odlišnou elektroforetickou mobilitou. Zvýšení rozlišovací schopnosti se dosáhne připojením GC-svorek na konce analyzovaných fragmentů, které zamezí úplné denaturaci až do jednořetězcové formy. Pokud jsou vhodně zvoleny podmínky gradientu, DGGE umožní sekvenčně specifickou separací směsi molekul stejné délky lišících se jedinou bází. ELEKTROFORÉZA NUKLEOVÝCH KYSELIN PRO STANOVENÍ JEJICH SEKVENCE. Jednořetězcové oligonukleotidy o délce několika desítek až stovek bází, které jsou výsledkem reakcí používaných při sekvencování DNA, lze účinně separovat v denatu-račních polyakrylamidových gelech. Podmínky elektroforézy musí být takové, aby pohyblivost závisela pouze na délce jednovláknových fragmentů DNA, tedy je třeba zabránit vytváření lokálních dvouřetězcových struktur, jejichž přítomnost by mohla ovlivnit pohyblivost fragmentů a znemožnit přesné stanovení jejich velikosti. Proto se používají gely s vysokou koncentrací denaíurujících látek (např. močoviny) a elektroforéza se provádí při teplotě 50-60 ĎC. Kombinace těchto dvou faktorů znemožňuje renaturaci. II. Manipulace s nukleovými kyselinami Manipulaci s puri fikovanými nukleovými kyselinami podstatně usnadňuje (1) existence enzymů, které umožňují specifický zásah do jejich struktury, (2) použití vektorů, které umožňují klonováni studovaných fragmentů nukleových kyselin (kapitola III), (3) využití schopnosti hybridizace jejich řetězců při identifikaci specifických nukleotidových sekvencí. 1. Enzymy používané k úpravám nukleových kyselin ROZDĚLENI ENZYMŮ PODLE SUBSTRÁTOVÉ SPECIFITY. Většina metod molekulární biologie je závislá na využití enzymů, jejichž substrátem jsou nukleové kyseliny. Předností enzymových reakcí je jejich přísná specifičnost a možnost pracovat s velmi malým množstvím materiálu. Enzymy, používané při analýze a úpravách nukleových kyselin lze klasifikovat podle několika kritérií. Podle substrátové specifity se tyto enzymy dělí na dvě základní skupiny: • enzymy, jejichž substrátem je DNA, • enzymy, j ej i chž substrátem j e RNA, Substrátová specifita je obvykle absolutní, i když rozlišeni mezi oběma druhy nukleových kyselin je podmíněno pouze přítomností nebo absencí 2'-OH skupiny ribózy. ROZDĚLENÍ ENZYMŮ PODLE TYPU REAKCÍ. Podle typu reakcí, které kata-lyzují, lze enzymy obou výše uvedených skupin dále dělit na: • enzymy syntetizující nukleové kyseliny (polymerázy), • enzymy modifikující nukleové kyseliny (fosfatázy, metylázy, kinázy), • enzymy spojující nukleotidové řetězce (ligázy), • enzymy odbourávající nukleové kyseliny (nukleázy). Podle substrátové specifity se enzymy jednotlivých skupin dále dělí, např. na DNA-polymerázy, RNA-polymerázy atd. Základní typy úprav dvouřetězcové DNA zprostředkované enzymy příslušných skupin jsou schematicky znázorněny na obr. 6. Z tohoto schématu zřejmé, že molekulu DNA lze in vitro upravit téměř libovolně. V následujícím přehledu jsou uvedeny některé enzymy, které jsou běžně používány při analýze a úpravách nukleových kyselin in vitro. U každého enzymu je uveden jeho původní zdroj. Řada enzymů jev současné době získávána expresí odpovídajících kódujících sekvenci nakloňovaných v jiných organizmech. Některé z nich byly upraveny metodami genového inženýrství. DNA-polymeráza I (DNA-pol I) {Escherichia coli) katalyzuje tři odlišné reakce, jejichž rychlost je ovlivněna stavem DNA a koncentrací deoxyribonukleosidtrifosfátů (dNTP) v reakční směsi. Za vhodných podmínek degraduje polynukleotidový řetězec DNA ve směru 5' —> 3' a současně degradovaný řetězec nahrazuje polymerační reakcí. Této vlastnosti se využívá ke značení DNA metodou tzv. posunu j ednořetězcového zlomu (str. 23). Klenowův fragment DNA-pol I (označovaný též jako Klenowův enzym, nebo velký fragment DNA-polI). Jedná se o větší ze dvou peptidových fragmentů, které vznikají při štěpení DNA-pol I subtilizinem. Klenowův fragment se vyznačuje 5' -> 3' polymerázovou a 3" -» 5T exonukleázovou aktivitou, postrádá však 5' -> 3'exonukleázovou aktivitu. Používá se MANIPULACE S NUKLEOVÝMI KYSELINAMI pri syntéze DNA, kdy nesmí docházet k odbourávání primerů, např, při enzymové metodě sekvencování nebo při značení DNA prodloužením příměru. Terminálni deoxyribonukieotidyl-transferáza (telecí brzlík). Katalyzuje připojování nukleotidů k 3'-koncům DNA. Na rozdíl od DNA-polymerázy nevyžaduje matrici ani primer. Enzym je využíván k připojování polydeoxyribonukleotidových úseků (tzv. homopolymerních konců) k fragmentům DNA a vektorovým molekulám se zarovnanými konci pro vytvoření komplementárních úseků, které umožní jejich spojení. Lze jej využít rovněž při koncovém značení nukleových kyselin. Zpětná transkriptáza (retro viry, např, virus ptačí myeloblastózy). Je využíván především k přípravě cDNA z mRNA. Zpětných transkriptů se využívá též k sekvencování RNA a jako sond pro hybridi-zaci. Obr. 6 Enzymové úpravy DNA Alkalická fosfatáza (telecí střevo, bakterie). Enzym odstraňuje fosfátové skupiny z 5'-konců DNA, RNA a oligonukleottdů. Toho se využívá při koncovém značení molekul, při němž se na defosforylováný konec přenese enzymem polynukleotidkinázou značený fosfát. Odstranění fosfátových skupin na 5-koncích se využívá také pro zvýšení frekvence vzniku rekombinantních molekul při začleňování cizorodé DNA do vektoru. Jestliže se odstraní fosfátové skupiny z konců linearizované molekuly vektoru, zabrání se jak její recirku-larizaci, tak i vzniku dámerů. Kružnicová molekula se pak může vytvořit jen inzercí cizorodé DNA, která poskytne fosfátové skupiny pro vytvořeni jedné fosťodiesterové vazby na každém ze spojovaných konců. Jednořetězeový zlom, který zůstává na druhém řetězci, je pak opraven reparačními mechanizmy hostitelské buňky, do niž se rekombinantní molekula přenese transformací. T4-poly nukleotid kináza (buňky E. coli infikované bakteriofágem T4). Enzym kata-1 y zuj e přenos terminál ní fosfátové skupiny z ATP na 5'-OH skupinu DNA nebo RNA. Může však katalyzovat i výměnu fosfátových skupin na 5'-korici, Obou reakcí se využívá ke značení fragmentů nukleových kyselin na 5'-koncích pomocí 32P. T4-DNA-iigáza (buňky E. coli infikované bakteriofágem T4). Katalyzuje tvorbu ťos-fodiesterové vazby mezi 5'- fosfátovou skupinou a 3'-OH skupinou sousedního nukleotidu. Používá se k vzájemnému spojení dvou molekul DNA zakončených komplementárními konci, k připojení spojek a adaptorů a cirkularizaci lineárních molekul DNA. Na rozdíl od DNA-ligázy z E. coli, která má podobné vlastnosti, lze pomocí tohoto enzymu spojovat i fragmenty se zarovnanými konci. terminálni transféráza dNTP 5 P_3'OH 3'QH-5'P DNMigáza^^laiKal'cKá fosfatáza 3'OH *6'P A I — exonukleázy D NA-polyme rázy-^T ťJNTP-| T 5'P —3'OH 3'OH- -5P DNáza t mono- a oiigonukleotídy MANIPULACE S NUKLEOVÝMI KYSELINAMI 19 Endonukleázy se děli na sekvenčne specifické (reštrikční endonukleázy), které Stepí v místech výskytu určitých sekvencí, a sekvenčně nespecifické, štěpící náhodně. Exonukieáza 111 (E. coli). Tento enzym působí ve směru 31 -> 5' a na dvouřetězcové DNA odstraňuje od jejího 3'-konce jedno vlákno. Působí pouze na DNA, jejíž konce mají přesahující 5'-konec nebo jsou zarovnány, jednořetězce s přesahujícím 3'-koncem nejsou Štěpeny, Lze ji proto s výhodou využít k vytváření jednosměrných delecí. Druhý řetězec je pak odstraněn nukleázou SI. Exonukieáza Bal3l {Akeromonas espejianá). Štěpí lineární dvouřetězcovou DNA od obou konců za vzniku zkrácených fragmentů DNA se zarovnanými konci. Je používána k přípravě obousměrných delecí nebo k průkazu koncové lokalizace určité sekvence na chromozomu. Nukleáza SI {Aspergillus oryzaé). Je endonukleáza specifická pro jednořetězcovou DNA. Používá se k odstraňování jednořetězcových úseků na dsDNA, smyček na cDNA vznikajících při její syntéze, mapování intronů analýzou hybridních molekul DNA-mRNA. Po štěpení SI-nukleázou jsou konce DNA často heterogenní a chybějící úseky musí být zaplněny polymerázou. Deoxyribonukieázy a ribonukleázy, DNáza I (hovězí pankreas). Vytváří na DNA jednořetězcové zlomy, od nichž pak DNA dále degraduje na mono- a oligonukíeotídy. Není sekvenčně specifická. Za přítomnosti Mg2+ vytváří na obou řetězcích náhodné zlomy, za přítomnosti Mn2+ dochází ke vzniku zlomů v protilehlých místech. Limitované štěpení nízkými koncentracemi enzymu umožňuje zavádět do DNA jednotlivé zlomy, které lze využít např. pro značení DNA nebo zavádění mutací. Ve větších koncentracích se používá k odstranění DNA při izolaci RNA. Mezi RNázamj existuje řada sekvenčně specifických enzymů (např. ribonukleáza TI), které se využívají při analýze a sekvencování RNA. K odstranění RNA z roztoků DNA je používána ribonukleáza A z hovězího pankreatu. REŠTRIKČNÍ ENDONUKLEÁZY. Reštrikční endonukleázy jsou sekvenčně spéci-fické endonukleázy, produkované kmeny většiny bakteriálních druhů. Jejich přirozenou funkcí je degradace cizorodé DNA, která se do bakteriálních buněk dostává např. při infekci bakteriofágem. V současné době je charakterizováno několik typů reštrikční ch enzymů, z nichž nej významnější jsou reštrikční endonukleázy II. typu (II. třídy). Uvedená charakteristika se proto bude týkat těchto enzymů. Rozpoznávací (cílové) místo restrtkčních enzymů je tvořeno krátkou, obvykle 4 až 8nukleotidovou sekvencí dvouřetězcových molekul DNA, která má velmi často charakter palřndromů. K rozštěpení molekuly DNA dochází hydrolýzou fosfodiesterových vazeb obou řetězců v restríkčním místě neboli místě štěpení, které se nachází uvnitř rozpoznávacího místa nebo těsně vedle něho. Produktem štěpení jsou úseky DNA o definované délce označované jako reštrikční fragmenty. V závislosti na způsobu, jakým je místo štěpení rozštěpeno, vznikají reštrikční fragmenty, které mohou být zakončeny: • tupými (zarovnanými) konci, • 5 -jednořetězcovými přesahuj ícími konci, • S'-jednoretezcovýrni přesahujícími konci. V současné době je známo více než 3 500 reštrikční c h endonukleáz II. typu rozpoznávajících zhruba 160 různých sekvencí. Reštrikční endonukleázy se stejným rozpoznávacím místem se označují jako izosc h izoméry; štěpení DNA však může probíhat v odlišných místech, případně se mohou lišit citlivostí k metylaci. Názvy restrikčních endonukleáz jsou odvozeny z počátečního písmene rodového a prvních dvou písmen druhového jména organizmu, z něhož byly izolovány. V některých 20 MANIPULACE S NUKLEOVÝMI KYSELINAMI případech je součástí názvu i zkrácené označení konkrétního kmene nebo sérotypu příslušného organizmu. Pokud určitý kmen produkuje dvě nebo více různých restrikčních endonukle-áz, odlišují se navzájem římskými číslicemi. Příklady některých restrikčních enzymů jsou uvedeny v tabulce 1. Některé reštrikční endonukleázy se vyznačují tzv, relaxovanou (uvolněnou) specifitou (tzv. hvězdičkovou aktivitou), která se projevuje schopností enzymu štěpit za určitých reakčních podmínek blízce příbuzné sekvence. Příkladem enzymu s touto vlastností je EcoHl, která může vedle sekvence GAATTC štěpit i sekvence GGATTC, GGATTT a AGATTT. Další důležitou charakteristikou restrikčních endonukleáz je jejich citlivost k metyla-ci bází v rozpoznávacím místě. Izoschizomerů, které se vzájemně liší v citlivosti k metylaci, lze s výhodou využít např. při studiu metylace nukleotídových sekvencí. Tabulka 1 Příklady některých restrikčních endonukleáz II. třídy Označení enzymu Producent enzymu Rozpoznávací místo na sekvencí dna 5'-» 3' 3'4-5' HaelU Haemophilus aegypticus GGlCC CCTGG EcoK\ Escherichia coli RY13 GlAATTC cttaaťg SaulM Staphylococcus aureus 3 A Igatc CTAGŤ Pst\ Providentia stuartii ctgcaíg GtACGTC Srna] Serratia marcescens CCCÍGGG GGGŤCCC Pozn.: Místa štěpení jsou vyznačena svislými šipkami. 2. Hybridizace nukleových kyselin Jako hybridizaci nukleových kyselin označujeme proces vytváření dvouřetězcových molekul z jednořetězců DNA nebo RNA za předpokladu, že se jejich sekvence vyznačují úplnou nebo částečnou komplementaritou bází (na rozdíl od renaturace však nedochází ke spojování jednořetězců, které původně byly součástí téže molekuly). Této schopnosti je široce využíváno k vyhledávání a charakterizaci specifických nukleotídových sekvencí v genových knihovnách, v cytologických preparátech, při mapování genomu atd. Principem hybridizace je odlišná pevnost kovalentních vazeb cukr-fosfátové kostry řetězce DNA a mnohem slabších vodíkových můstků, které vážou oba řetězce dvoušroubo-vice DNA prostřednictvím párováním bází. Proto je možné nastavit takové podmínky, při kterých se oba řetězce oddělí, ale neohrozí stabilitu kovalentních vazeb žádného z nich. Tento proces se označuje jako denaturace DNA a na rozdíl od denaturace většiny proteinů je reverzibílní. Vzhledem k existenci komplementarity bází je možné řetězce opět spojit a rena-turovat Denaturaci DNA lze snadno vyvolat zahřátím a proto se tento proces rovněž často označuje jako tání a to dokonce i když je vyvolán jinými způsoby - např. enzymaticky (DNA-polymerázou) nebo chemicky (NaOH) (obr. 7). Změny v uspořádání řetězců při MANIPULACE S NUKLEOVÝMI KYSELINAMI 21 Obr. 7 Zmeny absorbance roztoku DNA pri teplotní denaturaci a renaíurací postupným ochlazováním denaturaci a renaturaci způsobují podstatné změny fyzikálních vlastností DNA, jako např. jejich optické hustoty pri vlnové délce 260 nm. Během tání DNA se optická hustota roztoku DNA podstatně zvyšuje a to během krátkého teplotního intervalu a stabilizuje se, jakmile jsou řetězce zcela odděleny. Střední bod tohoto teplotního intervalu se označuje jako bod táni (Tm, „melting temperature"). Za fyziologických podmínek se bod tání pohybuje v intervalu 85-95 °C (podle složení bází). V laboratorních podmínkách lze bod tání snížit, např. změnou koncentrace solí. Bod tání závisí na složení bází v molekule DNA proto, že páry guanin-cytozm jsou spojeny třemi vodíkovými vazbami, zatímco páry adenm-tymin pouze dvěma. Proto je podle bodu tání možné odhadnout složení bází dané DNA a naopak podle známého složení DNA lze odhadnout její teplotu tání. Kromě vodíkových vazeb je dvouřetězcová struktura DNA stabilizována hydrofob-nimi interakcemi a to mezi bázemi protějších řetězců dvoušroubovice i mezi bázemi téhož řetězce. Hydrofobní povaha bází způsobuje, že v jednořetězcové podobě, při které jsou vystaveny vodnému prostředí, jsou báze nestabilní, Vzájemné párování umožňuje bázím omezit interakci s okolním vodným prostředím. Hydrofobní interakce jsou relativně nespecifické a proto mají řetězce nukleových kyselin tendenci se k sobě přibližovat i bez specifického párováni bází. Specifitu interakcí lze zvýšit chemickými látkami, které hydrofobní interakce snižují (např. formamidem). Jednořetězcové molekuly nukleových kyselin (např. RNA) omezuji interakci bází s vodným prostředím tvorbou sekundárních struktur. Proto se tyto molekuly často skládají do sekundárních struktur s částečně dvouřetězcovými úseky. Dalším faktorem, který se uplatňuje pří hybridizaci nukleových kyselin je existence negativního náboje fosfátových skupin. Elektrostatické síly plynoucí z odpuzování stejně nabitých cukr-fosfátových koster dvou řetězců proto působí proti vodíkovým vazbám a hyd-rofobním interakcím. Za přítomnosti solí, které molekuly DNA obklopují a neutralizují negativní náboj fosfátových skupin, je však míra odpuzování řetězců podstatně omezena. Pokud je koncentrace solí snížena, bude každá slabá interakce mezi řetězci znemožněna elektrosta- 22 MANIPULACE S NUKLEOVÝMI KYSELINAMI tickou repulzí. Sníženi koncentrace solí je proto jedním z často používaných způsobů jak zvýšit specifitu hybridizace. Pokud se smísí dva podobné, ale ne shodné fragmenty DNA, provede se denaturace a renaturace, vzniknou hybridní molekuly dvou typů: jednak se obnoví komplexy párovaním původních zcela komplementárních řetězců a jednak párováním částečně komplementárních řetězců vzniknou heteroduplexy, které budou obsahovat nespárované úseky (,,mismatches"), které budou snižovat stabilitu hybridu. Nižší stabilita hybridu se projeví např. snížením bodu tání. V laboratoři lze však nastavit různé podmínky přísnosti („stringence4') hybridizace, které jsou do různé míry tolerantní k přítomnosti nespárovaných úseků v molekulách hybridů. Uspořádání hybridizačních experimentů může být různé (obr. 8). Provádí se např. hybridizace v roztoku, v gelu, na filtrech, čipech nebo in $itu. Ve všech třech případech však musí být k dispozici specifický fragment označené nukleové kyseliny, tzv.sonda, která slouží pro lokalizaci cíle - komplementárního řetězce DNA v daném vzorku. hybridizace nukleových kysettn na filtrech .7v kolonii a plak J tečková J mikroíi . přesávky z gelu V Southemův přenos - DNA northernový přenos - RNA Obr. 8 Možnosti experimentálního provedení hybridizace nukleových kyselin PŘÍPRAVA SONDY. Výchozím krokem pro hybridizaci je příprava molekulární nebo též hybridizační sondy. Molekulární sondy jsou jednořetězcové, radioaktivně nebo chemicky značené nukleotidové sekvence DNA nebo RNA. Vážou se na cílovou sekvenci, kterou lze pak podle značky sondy snadno identifikovat. Jako sondu lze použít jakoukoliv vhodně označenou molekulu DNA nebo RNA. Nejčastěji se pro jejich přípravu používají: • sekvence genomové DNA nebo cDNA klonované ve vektoru nebo amplifikované poly-merázovou řetězovou reakcí, • uměle syntetizované oíígonukleotidy o délce 15-70 bází. Jejich sekvence bývá často odvozena ze sekvence aminokyselin proteinu, jehož kódující oblast na DNA vyhledáváme, • sekvence genů příbuzných organizmů, u nichž existuje vysoká pravděpodobnost, že připravená sonda rozezná rovněž sekvenci homologních genů. PRINCIP ZNAČENÍ SOND A JEJICH DETEKCE. Při radioaktivním značení jsou do sekvence sondy začleněny nukleotidy, obsahující některý z radioaktivních izotopů, nejčastěji 32P, 33P, 35S nebo 3H. Signálem sondy je radioaktivní záření, které lze detekovat např. autoradiograficky na vrstvě fotografického filmu, papíru nebo emulze. MANIPULACE S NUKLEOVÝMI KYSELINAMI 23 lineární denaturovaná DMA náhodné hexanukäeotidy ■ " " ■ mm M M I I dATP, dCTP. dGTP, dTTP -+ Dig-dUTP y Dig-dUTP <\ IIIllllT» Klenowova polymeráza syntéza značené ONA I I t I I I i 1 I I I" I I I i I I I I I I I» I I ! 1 í ! 1 i I I I I I 1 i I I M I I I 1 1 H hybridizace na filtru I detekce navázané sondy 0 0^ l konjugal Obr. 9 Neradioaktivni značení nukleových kyselin digoxigeninem a jejich použití jako sond Pri neradioaktivním způsobu značení jsou do sekvence sondy zabudovány chemicky modifikované nukleotidy nesoucí reportérskou molekulu, která umožňuje přímou nebo nepřímou detekci sondy. Řada systému neradioaktivního značení využívá jako reportérskych molekul biotinu nebo digoxigeninu navázaných na dUTP, který se do DNA začleňuje místo tyminu. V případě digoxigeninu je sonda detekována protilátkou specifickou pro digoxigenin, na kterou je navázán buď enzym (alkalická fosfatáza, peroxidáza nebo luciferáza), a nebo fluorescenční barvivo (fluorescein, rodamin). Po přidání substrátu katalyzuje příslušný enzym reakci, jejímž výsledkem je podle povahy substrátu změna jeho barvy nebo rozpustnosti, emise světla atd. (obr. 9). V druhém případě lze sondu detekovat přímo na základě fluorescence. Analogicky se postupuje při detekci sond označených biotinem, kdy se používá buď protilátka proti biotinu, častěji však avidin nebo streptavidin, které k němu vykazují vyšší afinitu. Způsob detekce je shodný jako u sond značených digoxigeninem. METODY ZNAČENÍ SOND. Sondy se značí buď po celé délce nebo na jejím konci značenými nukleotidy, které se přidávají do reakční směsi. Nejčastěji jsou používány následující metody: 1. Metoda posunu jednořetězcového zlomu (..nic k t ran station") (obr. 10). Na dvouřetězcové DNA se vytvoří DNázou 1 náhodné jednofetězcové zlomy. Ty jsou substrátem pro působení DNA-polymerázy I, která odstraňuje svou exonukleázovou aktivitou nukleotidy od místa zlomu ve směru 5'-»3' a současně ve stejném směru připojuje nukleotidy k 3-konci zlomu. 2. Metoda prodlužování primeru (obr. 11), při níž je výchozí molekula DNA denaturovaná a k jednořetězcům se přidá směs synteticky připravených oligonukleotidů, jejichž sekvence je náhodná. Tyto oligonukleotidy se proto připojují k různým místům jednořetězců a uplatní se jako primery pro syntézu komplementárního řetězce DN A-polymerázou. Aby se zabránilo odbourávání primerů je třeba pro polymerační reakci zvolit takovou DNA polyme-rázu, která postrádá 5' -» 3' exonukleázovou aktivitu. Z toho důvodu se nejčastěji využívá Klenowův fragment DNA-pol 1 nebo zpětná transkřiptáza. 24 MANIPULACE S NUKLEOVÝMI KYSELINAMI 5' 3' 5' Í' ds DNA M H 1 I M I I I 1 I I 1 I I I I I M I I 3' II } i I U I H I I í I H i I I I I I I i 5. DNáza I + Mg+ * vytvorení jednořetězcových zlomú n-m 111111111111 m 1111111 3' I I t U 1 I I I I I I I I.....I I M I I I s. N DNA-pol I + q^PhJNTP (N) (nebo neradiaaktivni > ^- N | značení) 5 TTTTTT M 11 11 M I I N I I I I I I I 3 3- 11 i 11 m i i i m i i m h 1 m i i i I i 6- posun zlomil, náhrada odstraněných nukleotidů ▼ značená DNA I I I U M I I 11 I I I i M I I I i I M 11 3 3- I I M H 1 I I I I ! I I 11 M 11 i J II M 5- spojeni T4-DNA-ligázou 5 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3 3 t M M í I 1111 I I M i I M Í J 11 H ľs- Obr. 10 Značení DNA posunem jednofetězco-vého zlomu ds DNA 5' iniiiimniininimm 3' 3- iniinuiiii.....iiiniii. 5- denaturace pripojení náhodných hexanukleotidů 3 1IIIIMI IIIIMIH1 IIM li 11 J II I I M TTTTTT TTTTTT 3. m......«i ll l 111 I I I 111 1111 &. Klenowova polymeráza + a32P-cfNTP 3 III H NIMI II III M II II II M 3' «, MIM U 1 i I I MlinilHI* llltlllllll* 3- n 11111 m 1111111» n n n n i 5- využiti naznačené DNA j ako hybndizačních sond Obr. 11 Značení DNA metodou prodlužování primerů s využitím náhodných oligonukleotidů 3. Polymerázová řetězová reakce $ využitím primerů o známé sekvenci. Jako matrice slouží nakloňované fragmenty DNA nebo celková genomová DNA. Polymerázovou řetězovou reakcí tak lze získat sondu z přesně definovaného úseku DNA, vymezeného místy připojení primerů. K polymeraci se používá Taq DNA-polymeráza. 4. Značení transkripcí in vitro, při níž se jako sonda použije RNA-transkript dané sekvence DNA, vzniklý za přítomnosti ribonukleotidů. 5. Koncové značení řetězců DNA, které se používá zejména pro značení synteticky připravených oligonukleotidů nebo restrikčních fragmentů. 5-konce DNA se nejčastěji značí radioaktivním fosfátem prostřednictvím polynukleotidkinázy. 3-konce DNA lze označit metodou doplnění konců, kdy jsou k přesahujícím jednořetězcům na koncích fragmentů vytvořených působením restrikčních enzymů dosyntetizovány DNA-polymerázou komplementární označené nukleotidy. Druhý způsob je založen na působení terminálni transferázy, která k 3'-koncům připojí značené nukleotidy. 6. Pro přípravu hybridizačních sond může být použita také peptidová nukleová kyselina (PNA), tj. uměle připravená molekula analogická deoxyribonukleové kyselině, jejíž kostru tvoří opakující se N-(2-aminoetyI)-glycinové jednotky spojené peptidovou vazbou. Purinové a pyrimidinové báze se na kostru vážou mety len-karbony lovými vazbami (obr. 12). PNA napodobuje chování DNA a při hybridizaci s komplementární DNA nebo RNA se řídí Watson-Crickovými pravidly o párování bází. Protože pseudopeptidová kostra PNA nese na rozdíl od cukr-fosfátové kostry DNA neutrální náboj, sondy z ní připravené mají řadu vhodných vlastností jako je vysoká specifita, afinita k DNA a rychlý průběh hybridizace. Tento typ sondy umožňuje účinnou hybridizaci i s cílovými sekvencemi, vyznačujícími se složitou sekundární strukturou nebo v podmínkách in situ. Interakce PNA:DNA je více selektivní než MANIPULACE S NUKLEOVÝMI KYSELINAMI 25 DNA:DNA nebo RNA:RNA a může ji i při nízké teplotě (20 °C) destabilizovat pouhý jeden chybný pár bází. Sondy tohoto typu jsou proto vhodné také pro detekci jednonukle-otidových polymorfizmu. Sondy jsou zpravidla značeny asymetrickým kyaninovým barvivem, které po vazbě sondy na DNA fluoreskuje až 50x intenzivněji než u nenavázané sondy a signál je proto viditelný i pouhým okem. FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ STABILITU HYBRIDŮ. Vznik hybridních molekul a jejich stabilita je ovhV něna celou řadou faktorů, k nimž patří zejména: • teplota, • délka hybridizujících molekul, -Báze • stupeň vzájemné komplementarity bází, • zastoupení GC a AT párů, • koncentrace solí v roztoku, • pH roztoku, • přítomnost látek destabilizujících vodíkové vazby mezi -Báze řetězci (např. některá denaturační činidla, jako je for- mamid nebo močovina). Pokud není sekvence sondy plně komplementární k vyhledávané sekvenci (např. při použití sondy odvozené ze sekvence aminokyselin v proteinech nebo při vyhledává-Obr. 12 Struktura peptidové příbuzných sekvencí), provádí se hybridizace za málo nukleové kyseliny přísných podmínek. Těch se dosáhne např. snížením teploty hybridizace na hodnoty pohybující se přibližně 40 °C pod hodnotou Tm. Naopak přísné podmínky umožňují vytvoření duplexů z jednořetězců, jejíchž sekvence jsou zcela komplementární nebo mají vysoký stupeň podobnosti. Teplota, při níž hybridizace probíhá, se pohybuje kolem hodnoty o 5 °C nižší než je Tm. Tvorba dvouřetězců je ovlivněna rovněž tím, zda vzájemně hybridizují molekuly DNA nebo RNA. Stabilita hybridů klesá v pořadí: RNA-RNA, RNA-DNA, DNA-DNA. Hybridizační reakce nukleových kyselin se provádějí (1) v roztoku, (2) na pevných podkladech, (3) v preparátech chromozomů, buněk a tkání (in situ). HYBRIDIZACE NA PEVNÝCH PODKLADECH je v současné době jednou z nejčastěji používaných variant hybridízačních technik. Denaturovaná DNA nebo RNA se přenáší na pevný podklad, kterým je obvykle nitrocelulózový filtr nebo nylonová membrána. Podle způsobu přenosu nukleových kyselin rozlišujeme tři základní typy hybridizace na pevných podkladech; • hybridizaci kolonií nebo plak (obr. 13), kdy se na membránu přenáší nukleové kyseliny bezprostředně uvolněné z bakteriálních kolonií nebo plak bakteriofágů vyrostlých na živných médiích, např. agarových plotnách, • tečkovou (kapkovou) hybridizaci, při níž je vzorek testované nukleové kyseliny na membránu nanášen ve formě roztoku (kapek), • zpětnou (reverzní) hybridizaci, při níž je soubor neznačených sond imobilizován na pevném podkladu, k nimž hybridizuje vzorek obsahující testovanou značenou DNA, MANIPULACE S NUKLEOVÝMI KYSELINAMI jjij^nj lyže bakterií poloha značených piiky tokmi! a de"3'1^^ DNA koíonii detekovaná autora diografii Obr. 13 Hybridizace kolonií pro vyhledám klonu obsahujícího specifický fragment klonované DNA • přenos po elektroforetické separaci nukleových kyselin v agarózových nebo polyakry-lamidových gelech. Podle toho, jakým způsobem k přenosu dochází, rozlišujeme: 1. Kapilární přenos, při němž jsou nukleové kyseliny unášeny pufrem prostupujícím gelem a hybridizační membránou. Pohyb pufru je zajištěn kapilárními silami, které vyvolá savý materiál navrstvený na membránu (obr. 14). 2. Elektroforetický přenos podmíněný vlivem elektrického pole. Používá se zejména při přenosu nukleových kyselin a proteinů z polyakrylamidových gelů. 3. Vakuový přenos, kdy je gel je položen na membTánu umístěnou na pórovité podložce a přelit roztokem, který je pak nasáván pumpou. Výhodou tohoto způsobuje zejména rychlost přenosu. Ve všech případech jsou nukleové kyseliny zachyceny na membráně v místech, odpovídajících jejich polohám v gelu po elektroforéze. Podobně lze přenášet rovněž proteiny. Podle typu přenášených molekul se proto rozlišuje: • přenos DNA neboli Sout hernu v přenos (podle E. M. Southerna, který zavedl kapilární přenos), obr. 14, • přenos RNA neboli northernový přenos (název je slovní hříčka použitá jako protiklad k přenosu DNA), • přenos proteinů neboli westernový přenos (název je opět slovní hříčka analogická předchozí). Po přenosu jsou nukleové kyseliny ireverzibilně navázány na membránu ve stavu jed-nořetězců přístupných sondě. Další postup hybridizace se sondou je jednotný a zahrnuje následující kroky: • prehybridizaci, při níž se přídavkem vhodných látek (heterologní DNA, tRNA, proteiny) obsadí volná místa na membráně a zabrání tak nespecifickému navázání sondy, • vlastni hybridizaci, k niž dochází po ponoření membrány do roztoku obsahujícího jedno-řetězcovou sondu. Nastavením teploty lze navodit přísné nebo méně přísné podmínky, MANIPULACE S NUKLEOVÝMI KYSELINAMI 27 Reštrikční fragmenty DNA separované elektroforéřOu 1_ _ ^ Přenos na membránu. tf ™- vrstva filtračního papíru — membrána — agarózový gel q— filtrační papír j— roztok Fragmenty DNA přenesené na membránu. Hybridizace se sondou {zde značenou radioaktivně). autoradiogram Fragmenty, k nimž sonda hybridízovala. • promývání, kterým se nenavázaná sonda z membrány odmyje, • detekce navázané sondy, podle způsobu jejího označení: autoradiograficky (radioaktivní značení) nebo imunoehemicky (neradioaktivní značení). Vzorky na membráně lze po odmytí sondy podrobit opakované hybridizaci s dalšími sondami. Tento postup se označuje jako rehybridizace. HYBRIDIZACE IN SITU. Hybridizace in situ umožňuje detekovat přítomnost specifických sekvencí nukleových kyselin v cytologických preparátech chromozomů, buněk nebo řezech tkání a s vysokou přesností stanovit jejich prostorovou lokalizaci. Metoda je používána pro detekci genů DNA na polyténních chromozomech hmyzu nebo metafázních chromozomech savců a rostlin a pro detekci specifických molekul RNA uvnitř buněk a tkání. Původně byly sondy pro hybridizaci in situ značeny radioaktivně a jejich detekce byla prováděna autoradiograficky. V současné době převládá chemické značení sond a jejich detekce se provádí lluorescenčně značenou protilátkou nebojsou sondy přímo značeny fluorescenčně značenými nukleotidy. Tato metoda se označuje jako fluorescenční hybridizace in situ (FISH). Vizualizace navázaných sond se provádí fluorescenční mikroskopií. Použitím sekvenčně specifických sond označených různými fluoreskuj íčími látkami lze např. na jednom chromozomu identifikovat polohy několika genů současně (obr. 15). K znázornění dalších morfologických struktur se preparát obarví běžnými barvivy používanými v cytologii. Obr. 14 Hybridizace restrikčních fragmentů DNA přenesených na membránu (Southemův přenos) 28 MANIPULACE S NUKLEOVÝMI KYSELINAMI III. Klonování DNA TERMINOLOGIE KLONOVÁNÍ. Jako klonování se obecně označuje proces tvorby klonů. Klon je soubor identických buněk (příp. organizmů) odvozených ze společného předka mitózou u eukaryot a prostým dělením u prokaryot. Klonováním DNA (klonová-ním genů, molekulárním klonováním) se rozumí tvorba klonů DNA. Klon DNA nebo též molekulární klon je soubor identických molekul, fragmentů nebo úseků DNA, připravených např. množením rekombinantních molekul DNA v hostitelské buňce (in vivo) nebo polyme-rázovou řetězovou reakcí (kapitola VI) in vitro. Jako rekombinantní molekula DNA se označuje molekula DNA vytvořená in vitro spojením cizorodé DNA s klonovacím vektorem. Klonovacím vektorem (přenašečem) je molekula DNA, která má schopnost přijmout cizorodou DNA, spojit se s ní a autonomně se replikovat v hostitelské buňce. Cizorodou DNA je jakýkoliv úsek DNA vložený do klonovaciho vektoru, Jelikož se cizorodá DNA vkládá do klonovacího vektoru za účelem jejího klonování, označuje se též jako klonovaná DNA nebo též jako inzert. Klonování DNA patří ke stěžejním metodám molekulární biologie. Jeho hlavni přínos spočívá především v tom, že umožňuje izolovat z komplexního genomu jeho dílčí úseky (např. geny), ty ve formě rekombinantních molekul mnohonásobně zmnožit a zpřístupnit je tak studiu dalšími metodami. Hlavní oblasti využití klonování jsou: • izolace genů, smdium jejich struktury a funkce, • smdium regulačních oblastí, které řídí expresi genů, • fyzikální a genetická analýza genomů, • exprese cizích genů v nepříbuzných hostitelích (heterologní exprese) a získávání jejich produktů ve větším měřítku; zde je cílem připravit látky, které by mohly být využitelné v průmyslu (enzymy), zdravotnictví a farmacií (hormony, krevní faktory, vakcíny) aj. Příprava rekombinantních molekul DNA a klonování DNA je základem genového inženýrství, které se zabývá přípravou umělých (nepřirozených) kombinací genů nebo vytvářením pozměněných nebo zcela nových genů a jejich zaváděním do genomu organizmů s cílem rekonstruovat (upravit nebo doplnit) jejich genetickou výbavu. Lze tak připravit transgenní organizmy, obsahující cizorodé geny a vyznačující se novými vlastnostmi (např. rostliny odolné vůči hmyzím a virovým škůdcům nebo herbicidům, mikroorganizmy produkující pozměněné proteiny a průmyslově významné látky). Klonování zahrnuje tři základní kroky: 1. Přípravu rekombinantní molekuly DNA. 2. Přenos rekombinantni molekuly do hostitelské buňky. 3. Selekci klonů obsahujících rekombinantní DNA. Ke klonování lze použít molekuly DNA různého původu: • genomovou DNA izolovanou z donorového organizmu, • komplementární DNA (cDNA) připravenou zpětnou transkripcí z mRNA, • DNA připravenou uměle chemickou syntézou, • molekuly DNA připravené polymerázovou řetězovou reakcí. 30 KLONOVÁNÍ DNA Aby mohla být cizorodá DNA začleněna do klonovacího vektoru, je třeba každý z uvedených typů molekul DNA vhodně upravit. Genomová DNA se nejdříve štěpí restríktá-zou nebo mechanickým stříháním na kratší fragmenty, jejichž velikost musí vyhovovat klo-novací kapacitě použitého vektoru. Předpokladem účinného spojení fragmentu s vektorovou DNA je vzájemná komplementarita jejich konců. Té lze dosáhnout: • štěpením genomové a vektorové DNA reštrikční endonukleázou, která vytváří komplementární (lepivé neboli kohezní) konce (obr. 16), • úpravou konců molekul vektoru a fragmentu připojením homopolymerních, vzájemně komplementárních konců terminálni transferázou (obr. 17), • připojením spojek k zarovnaným koncům molekul DNA (obr. 18). Spojky („linkery") jsou krátké uměle připravené oligonukleotidy, které obsahují jedno nebo více restrikČních míst pro reštrikční endonukleázy. Po jejich připojení ke koncům fragmentu DNA a Štěpení reštrikční endonukleázou se vytvoří lepivé (kohezní) konce. Podobnou funkci mají adaptory, což jsou uměle syntetizované oligonukleotidy s předem připravenými kohez-ními konci, které jsou komplementární ke koncům vytvořeným určitou restriktázou. Pro úplnost je třeba dodat, že T4 DNA ligázou lze vzájemně spojit i zarovnané konce DNA, ale účinnost je za těchto podmínek snížena. rozpoznávací místo . pro £coRI na vektoru V "F'T"i i PT^TT^^P : ■ a g a. a t t ca Mil hzjcttaag Fragment DNA z jiného zdroje vzniklý štěpením EcoRI. &' lepivě konce ■-:- II I I I m g mm a□ c t t a a a a t t c g □ \ vytvorení smési ..... 1 i g a a t t c ■ □ : ■ □ c T t A A Gllll Lepivé konce vzájemné hybridizuji a následné jsou kovalentně spojeny DNA-figázou. Obr. 16 Spojování fragmentů DNA s lepivými konci KLONOVÁNÍ DNA fragmenty DNA určené ke spojení 5 m 111111 m m i u n 1111111 3 3 II I I I I I I I U I i I I I I II I M I I II 5 dCTP 3 11 I I 1 í 11 M I I M I 11 I I t I ! I I M * 2- i n 11 i m h 11 11111 11 n 111 11 5. dGTP 5' i i i i i i i 11ii mCCCCC ' 11 I I I I I..... M M I I M í I M I GGGGG U I M I M H I I I DNA-ligáza 5" i h 1111 m 1111 ccccc iniiMiimi 3' z. nm......iiftfifififiim.....nn 5. Obr. 17 Spojování fragmentů DNA pomoci homopolymerních koncu spojka obsahující rozpoznávací m i sto pro EcoRl SCCGtftATTCGG 3' 3 GGCTTAAGÍCC 5' Ľ 2 dsDNAse zarovnanými konci T4-Jigáza spojky EcoRI adaptor nesoucí kohézni konec pro BamHt 5'OH-GATCCCCGGG-OH 3 3'GGGCCC-P dsDNA se zarovnanými konci adaptory T4-tigáza ho polynukleotidkirtáza !OH ATP klonování do místa EcoRl na vektoru klonování do místa BamH\ na vektoru Obr. 18 Spojování fragmentů DNA pomocí spojek a adaptorů 32 KLONOVÁNÍ DNA K přípravě cDNA se používá purifikovaná mRNA (obr. 19). Připojením krátkého řetězce oligo(dT) k poly(A) konci mRNA získáme primer, od něhož bude zpětnou transkriptá-zou syntetizován první řetězec cDNA. Po odbourání mRNA pomocí NaOH se dokončí syntéza komplementárního řetězce cDNA DNA-polymerázou, která využívá jako primer vlásenkový ohyb prvního vlákna c DNA vytvořeného zpětnou transkriptázou. Ohyb se pak vyštěpí Sl-nukleázou. Pro klonování se konce dvouřetězcové cDNA upraví buď připojením homopolymerních konců, nebo spojek. Upozorňujeme, že existují i další postupy přípravy cDNA, z nichž řada je založena na využití PCR. DNA syntetizovaná uměle chemickou cestou se obvykle připravuje postupným spojováním kratších dvouřetězcových úseků, vytvořených ze vzájemně komplementárních oligonukleotidů. Její celková délka pak může dosáhnout několika stovek párů bází a obsahovat sekvenci kompletního genu. Koncové sekvence mohou mít povahu kohezních koncu, nebo jsou k nim napojeny dodatečně spojky. Příprava vektorové molekuly ke spojení s cizorodou DNA je založena na jejím štěpení v klonovacím místě (příp. polylin-keru) reštrikční endonukleázou, která vytváří konce komplementární ke koncům cizorodé DNA. Po smíchání takto připravených molekul cizorodé a vektorové DNA se jejich přesahující konce vzájemně spojí (renaturují) a po přidání DNA-ligázy se mezi nimi vytvoří kovalentní vazba. Lze spojovat též molekuly, které jsou po štěpení restrikčními enzymy zakončeny tupě, účinnost spojování je však nižší než v případě molekul s kohezními konci. Spojením obou molekul vzniká rekombinantní DNA ve formě rekombi-nantního vektoru, která se přenese do vhodného hostitele, v němž se replikuje a přenáší do potomstva. KLONOVACÍ VEKTORY Jako klonovací vektory se nejčastěji používají kružnicové molekuly DNA schopné autonomní replikace, odvozené zejména z plazmidů nebo virů. Většina současných vektorů obsahuje kombinace sekvencí různého původu, včetně sekvencí eukaryotických chromozomů a sekvencí připravených uměle. Základní typy vektorů jsou charakterizovány níže. PLAZMIDOVÉ VEKTORY. Ideální klonovací vektor odvozený z plazmidu by měl míl následující vlastnosti: • Malou velikost (2-15 kb). Účinnost přenosu plazmidové DNA do buněk je nepřímo úměrná její velikosti. Malé plazmidy se navíc snadno izolují a v buňkách dosahují vysokého počtu kopií. mRNA E M IIIIIIII M I i M I!IlAAAAAAAAA i poty{A) mRNA ! I I II!II!flM IIIIIIIlAAAAAAAAA I I I I I I I I l směs dNTP I zpětná transkriptáza T mRNA IIII M II1 i II111!IIIIlAAAAAAAAA první řetězec cDNA ttttt vlásenka odbourání mRNA pomocí NaOH 7t '................I TTTTTT mimi syntéza druhého řetězce DNA-polymeráza ai 1111111II 1 1 1 1 1 1 1 1 m 1 vl 1 1 1 M M H 1 1 H 1 1 1 1 1 1 1 odbouráni vlásenky 1 St-nukleáza 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 mmiiimi 11111111 m m 111 n i í i cis cDNA Obr. 19 Příprava cDNA 33 KLONOVÁNÍ DNA • Schopnost snadného a účinného přenosu do hostitelských buněk. • Schopnost replikace v hostitelské bakteriální buňce. • Schopnost stabilního udržení cizorodé DNA při replikaci a uchovávání klonů. • Musí obsahovat geny, na základě jejichž fenotypového projevu lze buňky nesoucí plazmid snadno selektovat. Označují se jako selekční markery a nejčastěji jsou to geny, které buňkám propůjčují rezistenci k antibiotikům, např. k ampicilinu, tetracyklínu, chlo-ramfenikolu nebo neomycinu. • Musí nést vhodná klonovací místa, tj. jedinečná reštrikční místa pro reštrikční endonuk-leázy, do nichž se začleňuje cizorodá DNA. Novější vektory obsahují většinou seskupení většího počtu restrikčních míst na krátké uměle vytvořené a do vektoru začleněné nukleo-tidové sekvenci, označované jako mnohočetné klonovací místo nebo též polylinker (obr. 20). Do tohoto místa lze vložit cizorodou DNA připravenou štěpením různými re-strikčními enzymy. Híndlll Sph\ Psti Sall Xba\ SamHI Smál Kpn\ Ssti EcoRI Obr. 20 Struktura klonovacího vektoru pUC18. V rámečku jsou uvedeny reštrikční endonukleázy, jejichž cílová místa se nacházejí v polylinkeru. ampR = gen pro rezistencí k ampicilinu (selekční marker), ori = počátek replikace a íacZ' = část genu lačL kódující proximální úsek P-galaktozidázy. ZPŮSOBY PŘENOSU PLAZMIDOVÝCH VEKTORŮ DO HOSTITELSKÝCH BUNĚK. Velmi často používaným hostitelem píazmidových vektorů jsou buňky kmenů E. coli. Přenos lze provést několika způsoby. Nejčastější je transformace, při níž jsou bakteriální buňky nejprve uvedeny do stavu kompetence, ve kterém jsou schopny přijmout cizorodou DNA. Stav kompetence lze u buněk E. coli navodit působením chloridu vápenatého za nízké teploty (0 °C). Po přidání DNA a krátkém zahřátí na 42 °C přechází transformující DNA do buněk. Transformované buňky se selektují na agarových plotnách obsahujících příslušné antibiotikum. Jiným způsobem přenosu DNA do bakterií je elektroporace, při níž se buňky v roztoku obsahujícím rekombinantní DNA vystaví krátkému elektrickému impulzu o vysokém napětí, kterým jsou v buněčné stěně vytvořeny póry, jimiž exogénni DNA vstupuje do buněk. Výhodou této metody je, že ji lze aplikovat nejen u mnoha různých druhů bakterií, ale též při přenosu DNA do buněk eukaryotických buněk. Určitou nevýhodou je nutnost optimalizace elektroporačních parametrů (délka elektrického pulzu a napětí) a nízká 34 KLONOVÁNÍ DNA specifíía přenosu. Elektroporací se do buněk mohou zároveň s transformující DNA přenést další molekuly, včetně RNA nebo proteinů, navíc je přenos obousměrný, tj. vytvořenými póry může difundovat buněčný materiál ven z buňky. Další metody, které se používají pro přenos DNA do živočišných a rostlinných buněk jsou uvedeny v kapitole VII. IDENTIFIKACE BAKTERIÁLNÍCH KOLONIÍ OBSAHUJÍCÍCH REKOM-BINANTNÍ PLAZMIDY. Po přenosu píazmidových molekul do hostitelských buněk je třeba identifikovat transformanty (tj. buňky obsahující rekombinantní plazmidy) a odlišit je od buněk, do nichž byl přenesen pfozaúd bez cizorodé DNA (nerekombínantní plazmid). Nejčastěji se používají následující metody: Reštrikční analýza plazmidové DNA. Rekornbinantní DNA se podrobí reštrikční analýze, pomocí níž se prokáže přítomnost inzertu v rekombinantní plazmidové molekule. Inzerční in aktivace. Klonovací místo je ve vektoru umístěno v genu zodpovědném za rezistenci hostitelské buňky k určitému antibiotiku. Inzerce cizorodé DNA způsobí ztrátu funkce tohoto genu a proto se buňky nesoucí rekombinantní plazmid stanou k tomuto antibiotiku citlivé. To je odlišuje od buněk obsahujících vektor bez cizorodé DNA, které jsou k antibiotiku rezistentní. Alfa-komplementace, Vektor nese krátký segment laktózového operonu E. coli obsahující regulační sekvence a část genu kódujícího (l-gaiaktozidázu (lacZ1), jehož expresí vzniká N-koncový fragment tohoto enzymu (obr. 20). Do kódující sekvence je začleněno mnohočetné klonovací místo, které nepřerušuje Čtecí rámec. VektOTy tohoto typu jsou používány v hostitelských buňkách E, coli, které kódují C-koncový fragment p-galaktozidázy. Ani jeden z polypeptidových fragmentů není sám o sobě aktivní, mohou se však spojovat za vzniku enzymově aktivního proteinu (tzv. alfa-komplementací). Bakterie, do nichž je přenesen vektor bez inzertu, tvoří aktivní P-galaktozidázu, jejíž tvorbu lze prokázat na plotnách s chromogenním substrátem 5-bromo-4-chloro-3-indoly!-P-D-galaktozideni (X-gal). Jeho rozkladem p-galaktozidázou vzniká produkt zbarvující bakteriální kolonie modře. Inzerce cizorodé DNA do klonovacího místa inaktivuje N-koncový fragment enzymu a ke komple-mentaci tak nedojde. Kolonie buněk s rekombinantním plazmídem jsou pak bílé. Indukce tvorby (3-galaktozidázy je zajištěna izopropyl-|3-D-tiogalaktozidem (IPTG), který se přidává do živného media. Tento systém selekce je používán u mnoha píazmidových i fágových vektorů. Po selekci transformantů je dalším krokem vyhledání klonu nesoucího studovanou sekvenci. To se provádí pomocí hybridizace. Buňky s rekombinantním plazmídem jsou vyhledány prostřednictvím sondy DNA, specifické pro sekvenci inzertu (kapitola II). Hybridizace se provádí na membráně, na kterou byly přeneseny kolonie buněk transformantů. Klasickým plazmidovým vektorem používaným ke klonování v E. coli je plazmid pBR322. Nese geny určující rezistenci k ampicilinu a tetracyklínu, ve kterých jsou umístěna cílová místa pro několik reštrikční c h endonukleáz. Jako příklad klonování v pBR322 uvádíme začlenění cizorodé DNA do místa Psň, které se nachází v genu pro rezistenci k ampicilinu (obr. 21). Plazmid a donorová DNA se štěpí reštrikční endonukleázou PsiL kohézni konce obou molekul se kovalentně spojí DNA-ligázou a rekombinantní vektorová molekula se přenese do hostitelských buněk E. coli transformací. Selekce se provádí na plotnách s tetra-cyklinem a ampicilinem. Nejdříve se buňky vysejí na plotny obsahující tetracyklín, kde vyrostou všechny transformované buňky. Vyrostlé kolonie se pak přenesou na plotny s ampicilinem, kde nevyrostou buňky, obsahující rekombinantní plazmid. Přenos se provádí pomocí bakteriologického razítka nebo sterilním párátkem, KLONOVANIDNA Psn štépeni Pstt přidání fragmentů cizorodé DNA pripravených štěpením Psfl spojení DNA-li gázo u Ý cizorodá ONA prenos do buněk E, cotf výsev na plotnu s tetracyklinem přerazatkovám na plotny s amprcilinem Přenesené buňky obsahující rekombinantní plazmid nerostou a nevytvoří kolonie. Vyrostou kolonie z buněk, do nichž byl přenesen plažmid. Zataženi kultury z kolonií, které nevyrostly na půdě s ampícilinem. Obr. 21 Klonování DNA v plazmi do vém vektoru pBR322 36 KLONOVÁNÍ DNA Maximální délka fragmentu DNA, který může být do vektorů začleněn a stabilně udržován, se označuje jako klonovací kapacita vektoru. U plazmidových klonovacích vektorů se obvykle pohybuje v rozmezí jednotek až stovek kb, podle konkrétního typu vektoru. VEKTORY PRO SPECIÁLNÍ ÚČELY. Vedle vektorů určených ke klonování existuje řada vektorů připravených pro speciální účely. Z nich uvádíme: Expresní vektory, které obsahuji silný promotor umístěný proti směru transkripce od klonovacího místa. Po nakloňování cizorodého genu pak může dojít k jeho expresi a tvorbě příslušného produktu. Jelikož produkce cizího proteinu může vést ke smrti hostitelských buněk, je výhodné použít regulovatelných promotorů a syntézu cizího proteinu navodit po nárůstu kultur do vhodné hustoty. Příkladem takového promotoru je promotor laktózového operonu E. coli, jehož exprese je řízena represorem a operátorem. Přídavkem vhodného induktoru (jakým je např. isopropyl-fi-D-tiogalaktopyranozid - IPTG) do růstového prostředí dojde k inaktivaci represoru, což vede k zahájení transkripce klonováného genu. Kyvadlové vektory mají dva počátky replikace, které jim umožňují účinně se replikovat v buňkách dvou různých organizmů, např. E. coli a Bacillus subtilis, anebo v E. coli a kvasinkách. Výhodou jejich použití je snadné klonování genu do E. coli a jeho případná úprava. Z E. coli lze pak rekombinantní plazmid izolovat ve velkém množství a přenést do druhého hostitele, do kterého se rekombinantní molekuly připravené in vitro přenášejí jen s velmi nízkou účinností. VEKTORY ODVOZENÉ Z BAKTERIOFÁGA LAMBDA. Bakteriofág lambda používaný jako vektor má ve srovnání s plazmídovými vektory řadu výhod: 1. Rekombinantní DNA lze sbalit in vitro do fágových kapsidů a přenést do hostitelských buněk běžnou fágovou infekcí. Účinnost tohoto přenosu je o několik řádů vyšší než transformace buněk plazmidovou DNA. 2. Po výsevu fágových klonů lze na jedné Petriho misce analyzovat několik tisíc plak. 3. V jedné zkumavce lze uchovávat ve formě fágových virionů celou genovou knihovnu, čítající např. několik milionů rekombinantních klonů. Konstrukce vektorů odvozených z fága lambda vychází z poznatku, že střední třetina jeho genomu není pro jeho lyrický růst nezbytná a lze ji nahradit cizorodou DNA. Do fágových kapsidů lze in vitro zabalit rekombinantní DNA ohraničenou místy cos vzdálenými 37 až 52 kb, což představuje 78 až 105 % velikosti genomu fága lambda standardního typu. Na základě tohoto poznatku byla zkonstruována celá řada různých vektorů> které lze rozdělit do dvou základních typů: 1, Inzerční vektory, u nichž se cizorodá DNA vkládá do jednoho restrikčního místa na molekule vektoru. Velikost vlastní vektorové DNA je na spodní hranici velikosti, která může být ještě sbalena. Maximální klonovací kapacita těchto vektorů dosahuje přibližně 13 kb. 2. Substituční vektory, u nichž cizorodá DNA nahrazuje střední úsek genomu fágového vektoru, který je z něj restrikčními endonukleázamí před vložením cizorodé DNA vyště-pen. Klonovací kapacita se pohybuje od 9 do 23 kb. Vektory obou typů jsou přednostně používány ke klonování genomové DNA a c DNA při zakládání genomových a genových knihoven (viz dále). Jako příklad uvádíme klonování genomové DNA (obr. 22). Ta se nejdříve částečně štěpí vhodnou reštrikční endonukleázou za vzniku restrikčních fragmentů různé délky. Vhodné průměrné délky restrikčních fragmentů se zpravidla dosahuje částečným štěpením. Použije-li se inzerční vektor, štěpí se v jednom místě. U substitučního vektoru se vyštěpí a odstraní střední fragment genomu. V obou případech je štěpený vektor tvořen dvěma rameny, mezi které se vloží fragment cizorodé DNA a KLONOVÁNÍ DNA 37 kovalentně spojí DNA-ligázou. Současně přitom se tvoří konkatemer spojením rekombinant-ních molekul prostřednictvím míst cos. Po přidání sbalovacího extraktu obsahujícího pre-kurzory fágových hlav a bičíků je koňkatemerní rekombinantní molekula v místech cos štěpena a sbalena do fágových kapsidů. Vytvořenými fágovými viriony jsou infikovány hostitelské buňky E. coli, kde se rekombinantní DNA pomnoží. Buňka lyžuje a do prostředí uvolňuje fágové potomstvo, jehož genom je tvořen rekombinantní fágovou DNA. Výsev fágových virionů se prakticky provádí tak, že na misky s živným agarem se nalévá směs virionů a hostitelských buněk E. coli v řídkém agaru. V místech, kde došlo k lyži buněk se vytvoří průsvitná skvrnka (plak) v jinak souvislém nárůstu bakteriálních buněk. spojeni ligázou koňka tem s r I-37-52 kb -4-1->■ 37^52 kb -1 Obr. 22 Klonování DNA prostřednictvím vektorů, odvozených z fága lambda SELEKCE FÁGOVÝCH KLONŮ S REKOMBINANTNÍ DNA. Přirozená selekce rekombinantních molekul je dána spodní a horní hranicí velikostí DNA, která může být účinně sbalena do fágových kapsidů. Ke zvýšení účinnosti selekce se u jednotlivých typů vektorů dále používá: 38 KLONOVÁNÍ DNA 1. Inaktivace genu cl, Inzerční inaktivací genu cl po vložení cizorodé DNA (u in-zerčních vektorů) nebo jeho odstraněním jako součásti středního fragmentu (u substitučních vektorů) budou rekombinantní viriony tvořit plaky na E. coli K12 (k-), které jsou nerekom-binantními viriony lyzogenizovány. Gen cl kóduje fágový represor - pokud je tento gen inaktivován nebo odstraněn, není fág schopen lyzogenizace. 2. Selekce založená na ct-komplementaci. Klonovací místo, stejně jako u plazmido-vých vektorů, je začleněno do částí genu pro p*-galaktozidázu. Nerekombinantni viriony tvoři na plotnách s X-gal a IPTG modré plaky. Plaky tvořené rekombinantními viriony jsou bezbarvé. 3. Selekce podle fenotypu Spi-. Fág lambda standardního typu neroste na kmenech E, coli obsahujících profága P2 (jeho fenotyp je označován jako Spi+, tj. citlivý k inhibici profágem P2). Citlivost určují geny red a gam, které se nacházejí ve střední části genomu fága lambda. Tyto geny jsou u substitučních vektorů nahrazeny cizorodou DNA, takže re-kombinantni vektory na lyzogennich kmenech P2 rostou. Některé vektory fága lambda se používají rovněž jako expresní vektory, umožňující syntézu proteinových chimér. K nim patří např. inzerční vektor Xgtl 1. Tento vektor nese gen lacZ z E. coli, do jehož kódující oblasti je začleněno klonovací místo. Jestliže je do tohoto místa nakloňována cDNA kódující určitý protein, vzniká hybridní produkt - proteinová chiméra, tvořená částí molekuly pVgalaktozidázy a částí cizorodého proteinu. Jeho přítomnost lze prokázat imunologicky vhodně značenou protilátkou. KOSMIDY jsou vektory odvozené z plazmidů (např. pBR322), do nichž byla nakloňována místa cos bakteriofága lambda, a které proto spojují výhody klonování prostřednictvím plazmidových a fágových vektorů. Přítomnost míst cos umožňuje sbalení rekombinantní DNA, připravené začleněním cizorodé DNA do klonovacího místa kosmidu, sbalovacím extraktem fága lambda in vitro a její přenos do hostitelských buněk transdukcí, podobně jako vektorů odvozených z fága lambda. Uvnitř bakterii získává kosmid kružnicovou formu, ale vzhledem k absenci některých esenciálních genů fága lambda nemůže procházet lyrickým cyklem. V buňkách se proto replikuje jako plazmid. Selekci klonů umožňují plazmidové geny kosmidu určující rezistenci k antibiotikům Vzhledem k tomu, že do fágových hlav může být sbalena DNA o délce 37-52 kb a velikost kosmidu je zhruba 5 kb, lze jejich prostřednictvím klonovat DNA, jejíž velikost je 32-47 kb. Kosmidy jsou proto vhodné jako vektory ke konstrukci genových knihoven eukaryot. VEKTORY ODVOZENÉ Z BAKTERIOFÁGA M13. Genom blízce příbuzných vláknitých fágů M13, fl a fd, jejichž hostitelem je E. coli, je tvořen kružnicovou jednořetěz-covou DNA o velikosti přibližně 6,4 kb. Vektory odvozené z těchto fágů se vyznačují následujícími vlastnostmi (obr. 23): 1. Jejich replikace zahrnuje tvorbu dvouřetězcové DNA, kterou lze z buněk izolovat podobně jako plazmidovou DNA a podobným způsobem s ní lze in vitro manipulovat a použít ji ke klonování. 2. Během reprodukčního cyklu jsou do fágových virionů sbalovány kružnicové jednořetěz-cové molekuly DNA, které lze velmi snadno izolovat. 3. Do fágových virionů mohou být sbaleny molekuly DNA, jejichž velikost dosahuje několikanásobku délky fágového genomu. KLONOVÁNÍ DNA Tyto vlastnosti umožnily konstrukci vektorů pro přípravu jednořetězcových rekombi-nantnich molekul DNA, které nahradily dřívější pracné techniky separace řetězců. Takto připravené jednořetězce jsou používány: • k sekvencování enzymovou metodou, • k mutagenezi in viíro prostřednictvím mutagenních oligonukteotidůj • k přípravě hybrid izačních sond transkripcí in vitro, • k replikaci a replikativní rekonstituci chromatinu in vitro v extraktech vajíček Xenopus íaevis. PLAZMIDOVÉ VEKTORY NESOUCÍ BAKTERIOFÁGOVÉ PROMOTORY. Značná část moderních vektorů nese v blízkosti klonovacích míst promotory odvozené z bakteriofágů T3, T7 nebo SP6. Cizorodá DNA začleněná do vektoru může být proto přepisována in viíro, když se linearizovaná DNA mkubuje s příslušnou RNA-polymerázou a ribo-nukleotidy. V některých vektorech jsou na opačných koncích klonovacího místa umístěny odlišné promotory, což umožňuje přepisovat oba řetězce inzertu DNA podle toho, která z RNA polymeráz se použije. Takto vytvořené RNA mohou být použity jako hybridizační sondy nebo je lze překládat do proteinů in vitro v bezbuněČných systémech. UMĚLÉ BAKTERIÁLNÍ CHROMOZOMY (BAC). Umělé bakteriální chromozomy jsou plazmidové vektory odvozené z plazmidu F E. coli. Jejich předností je velká klo-novací kapacita, která dosahuje až stovek bp. UMĚLÉ CHROMOZOMY ODVOZENÉ Z BAKTERIFOÁGA PI (PAC). Vektory odvozené z bakteriofága Pí jsou podobné vektorům odvozeným z bakteriofága lambda. Genom fága Pl je však větší než genom fága lambda a klonovací kapacita těchto vektorů proto dosahuje až 125 kb. Umělé chromozomy odvozené z bakteriofága Pl, u nichž se kombinují vlastnosti vektorů Pia BAC, mají klonovací kapacitu až 300 kb. UMĚLÉ KVASINKOVÉ CHROMOZOMY (YACs). Umělé kvasinkové chromozomy patří mezi kyvadlové plazmidové klonovací vektory, replikující se v buňkách E. coli a v kvasinkách. Vedle sekvencí bakteriálního plazmidu obsahují části kvasinkového chromozomu (centromeru, sekvence pro autonomní replikaci, dvě kvasinkové telomery a selektova-telné signální znaky). Po štěpeni plazmidu se vytvoří dvě ramena, mezi něž se vloži klono-vaná genomová DNA. Rekombinantní DNA je vnesena transformací do kvasinkových 40 KLONOVÁNí DNA sféropiastů, tj. buněk s částečně narušenou buněčnou stěnou, kde se chová jako ostatní kvasinkové chromozomy. Výhodou kl ono vání v těchto vektorech je jejích obrovská klono-vací kapacita, která dosahuje několik stovek kb. Určitou nevýhodou je na druhé straně nestabilita inzertu cizorodé DNA, které se mohou podrobovat přestavbám. Postup klonování v kvasinkových umělých chromozomech je uveden na obr. 24. —j genomová DNA (85 částečné Štěpen i Ecc-RI pYAC4 ARS1 GEN4 ^ — 1 pfge ťJ.,1 EcoRI URA3 500 kb 400 300 200 100 50 štěpeni EotRI a 6»fíiH\ SamHI BamH\ BůmH\ t iíoiace frggmentú DNA - 400-500 kbp spojen t D NA-ligá zo u t 4^..........m t prenos do kvasinkových protoplastů _ Obr. 24 Klonování genů v kvasinkových umělých chromozomech Vysvětlivky: ARS1 - počátek replikace aktivní v kvasinkové buňce, TEL - telomerová sekvence z Tetrahymena, CEN4 - centromera, TRPÍ a URA3 - markery pro selekci vektoru v kvasinkových buňkách, ampR - bakteriální selekční marker, orí - počátek replikace aktivní v bakteriální buňce. 41 KLON OVÁNÍ DNA lidská DNA 1rozštěpení reštrikční endonukleázou ZAKLÁDÁNÍ GENOVÝCH KNIHOVEN. Jestliže má být vyhledán a klonován konkrétní gen určitého organizmu, je obvykle prvním krokem založení jeho genové knihovny (genové banky). Je to soubor náhodně klonovaných fragmentů genomové DNA příslušného organizmu. Celkově lze knihovny klasifikovat podle několika hledisek. Základní dělení je založeno na původu DNA použité ke konstrukci knihovny. Na rozdíl od genové knihovny představuje genomová knihovna (genomová banka) soubor klonovaných fragmentů připravených štěpením genomové DNA, které dohromady reprezentují celý genom daného organizmu (obr. 25). Knihovna cDNA je tvořena klony, které obsahují molekuly cDNA, připravené zpětnou transkripcí mRNA izolované z buněk organizmu. Protože buňky každé z tkání organizmu tvoří odlišný soubor molekul mRNA, budou se knihovny cDNA připravené z různých typů tkání navzájem lišit. Každý z uvedených typů knihoven má své výhody a nevýhody. Výhodou cDNA knihovny je její menší velikost, protože neobsahuje sekvence intronů, regulační oblasti a nepřepisované sekvence. Její prohledávání bude proto celkově snadnější a rychlejší. Genomová knihovna je podstatně větší, zato však umožňuje studovat geny v jejich přirozené podobě, včetně intronů a regulačních oblastí. Její konstrukce je nutná rovněž pro fyzikální analýzu genomu, jejímž předpokladem je sestavení souvislé úplné sekvence dlouhých úseků chromozomů. Dalším typem knihovny je expresní genová knihovna. Rozumí se jí knihovna cDNA vytvořená expresními vektory, které umožňují klonované sekvence exprimovat. Podle jiného kritéria se knihovny klasifikují na základě typu vektoru použitého k jejich konstrukci. Různé klonovací vektory mohou nést fragmenty DNA různé velikosti. Výběr vektoru závisí na velikosti genomu, z něhož se knihovna připravuje. Plazmidy mohou nést jen krátké fragmenty cizorodé DNA a jsou proto používány jen pro menší genomy, např. virové. Pro konstrukci genomových knihoven eukaryotických organizmů se nejčastěji používají vektory odvozené z fága lambda a kosmidy, případně umělé kvasinkové, bakteriální a jiné umělé chromozomy s velkou klonovací kapacitou, jejichž použití podstatně sníží velikost knihoven. V závislosti na použitém vektoru je pak plazmidová nebo kosmidová knihovna souborem definovaných reštrikční fragmenty genomové DNA I klonován í DNA-fragmentů do vektoru j^^X^A-. rekombinantn i DNA vnesení do bakterií Obr. 25 Konstrukce genomové knihovny z lidského genomu KLONOVÁNÍ DNA kultur bakterií nesoucích plazmidy nebo kosmidy, fágová knihovna souborem fágových Částic a knihovna umčlých kvasinkových chromozomů souborem kvasinkových kmenů. Důležitou charakteristikou každé genomové knihovny je jej i velikost, která udává minimální počet klonů postačující pro zachycení celého genomu. Velikost knihovny určitého organizmu lze vypočítat podle vzorce a^mO^/Wl-T), kde N je počet nezávislých klonů v genomové knihovně, P je pravděpodobnost výskytu dané genomové sekvence v genomové knihovně (napf. 95 %), a /je poměr velikosti klo-nováných fragmentů (inzertů) k velikosti celého genomu. Např. genomová knihovna lidského genomu, který má velikost přibližně 3 000 Mb3 připravená pomocí vektoru fága lambda s průměrnou velikostí klonováných fragmentů 20 kb, musí obsahovat alespoň 6t5 * 10s klonů, aby bylo s 99% pravděpodobností zaručeno, že nese celý genom. VYHLEDÁVÁNÍ GENÚ V KNIHOVNĚ. V knihovně obsahující několik tisíc klono váných fragmentů je třeba klony obsahující geny nebo sekvence DNA, o něž se zajímáme, nejdříve vyhledat. Metoda, kterou použijeme k detekci specifické sekvence genů v knihovně, se označuje jako vyhledávání genů. Za tím účelem lze použít dva základní typy sond: Sondy pro vyhledání sekvencí DNA, jejichž použití je založeno na hybridízací nukleových kyselin. Zdrojem pro přípravu těchto sond jsou nejčastěji: 1. cDNA, obvykle připravené přepisem mRNA z tkáně, v níž dochází k silné expresi hledaného genu a mRNA se v buňkách nachází s vysokou četností. Existují však i postupy, jimiž lze izolovat i molekuly mRNA přítomné v buňkách v relativně malém množství (viz kap. VIII). 2. Sekvence DNA genu příbuzného organizmu. Řada genů vyznačujících se stejnou funkcí obsahuje konzervativní sekvence s vysokým stupněm homologie. Hybridizaci je však třeba provést za málo přísných podmínek. 3. Synteticky připravené oligonukleotidy odvozené ze sekvence aminokyselin proteinu, kódovaného hledaným genem. Vzhledem k degeneraci genetického kódu je obvykle třeba připravit několik alternativních sekvencí, případně provést hybridizaci za málo přísných podmínek. Sondy pro vyhledání produktů hledaných genů. Jestliže je znám proteinový produkt hledaného genu a podaří se jej izolovat v čisté formě nebo se jeho část syntetizuje chemicky, lze jej použít k přípravě protilátky, kterou lze protein imunologicky detekovat. Nejdříve se připraví expresní knihovna, v niž bude docházet k expresi klonovaných genů. Identifikace klonu nesoucího hledaný gen se pTovede analogicky jako při hybridizaci kolonií nebo p lak s tím rozdílem, že se jako sonda použije značená protilátka. Ta se bude vázat na membránu v místě odpovídajícímu poloze klonu, který obsahuje klonovaný fragment DNA a exprimuje jej. ANALÝZA DLOUHÝCH ÚSEKŮ GENOMU. Dosud popsané postupy umožňují v genových knihovnách vyhledat specifické sekvence nebo geny, jejichž velikost nepřesahuje klonovací kapacitu použitých vektorů. Jednotlivé inzerty DNA klonované do fágových nebo kosmidových vektorů, které se ke koristrukci knihoven používají nejčastěji, představují poměrně krátké úseky genomu. Řada situací vyžaduje, aby byt charakterizován dlouhý nepřetržitý úsek genomu představující stovky kilobází. K tomu lze použít dva vzájemně se doplňující postupy, které se označuji jako procházení po chromozomu a přeskakování po chromozomu. PROCHÁZENÍ PO CHROMOZOMU (obr. 26). Cílem tohoto postupu je vyhledat v genové knihovně klony, jejichž inzerty cizorodé DNA se překrývají a navzájem na sebe KLONOVÁNÍ DNA 43 navazují. Uspořádáním těchto klonů lze pak získat informaci o spojité sekvenci určité oblasti genomu. Velmi Často se tento postup uplatňuje při izolaci genů nebo sekvencí s neznámou funkcí, pro něž dosud není vhodná sonda k dispozici. Z předchozí, např. genetické analýzy, je však přibližně známa oblast genomu, v níž se hledaný gen nebo sekvence nachází, a jsou rovněž k dispozici geny nebo sekvence pocházející z okolních oblastí, které slouží jako výchozí body pro procházení. Výchozí klon z genomové knihovny. Sonda připravená z koncového úseku inzertu -+ Vyhledáni dalšího klon J V genc-mc-vé knihovně a připrala další sondy. Sonda se využije k vyhledáni dalšího klonu. Klon obsahuje sekvence hledaného genu B. Schéma pohybu po chromozomu. -► -> -^ genomová DNA gen A gen B gen C .___ Obr. 26 Procházení pro chromozomu Nejprve se použije sonda pro vyhledání klonu nesoucího část již dříve charakterizovaného úseku genomu. Jakmile je klon vyhledán, jsou z koncových Částí inzertu klonované DNA připraveny sondy, kterými je genová knihovna znovu prohledána. Je vyhledán druhý klon, jehož inzert se částí své sekvence překrývá s inzertem prvního klonu. Z koncového úseku inzertu druhého klonu je pak opět připravena sonda, která se použije k vyhledání třetího klonu. Opakováním tohoto postupu nakonec získáme ve formě překrývajících se inzertů, tj. k lono váných fragmentů DNA, souvislou sekvenci, která má začátek v charakterizovaném úseku genomu a končí v cílové oblasti vzdálené stovky kilobází, která pak může být podrobně prostudována. Déíka jednotlivých kroků záleží na průměrné velikosti fragmentu DNA 44 KLONOVÁNÍ DNA klonovaného do vektoru použitého pro konstrukci genové knihovny. Procházet po chromozomu lze oběma směry. Během procházeni po chromozomu může dojít k situaci, kdy není možné jednoznačně vyhledat další překrývající se klonovaný fragment DNA. Určité úseky genomu se totiž v kosmidových a fágových vektorech klonují obtížně nebo je nelze vůbec klonovat, případně jsou tvořeny repeticemi, které nelze jako sondy pro vyhledáni dalších klonů využít. Pokud tato situace nastane, lze další klonované fragmenty vyhledat postupem přeskakováni po chromozomu, který je uveden níže. PŘESKAKOVÁNÍ PO CHROMOZOMU. Tento postup je určen k překlenutí chy~ bějících „mezer" v sekvencích genomové DNA, které se podařilo sestavit procházením po chromozomu. Tyto mezery mohou představovat vzdálenosti větší než 100 kb. Postup je založen na přípravě knihovny pro přeskakování obsahující přeskakovací klony, které nesou nesousedíci sekvence ze vzdálených oblastí genomu: 1. Částečným štěpením genomové DNA se vytvoří velké fragmenty ze segmentu DNA, o němž se předpokládá, že nese gen nebo sekvenci, o které se zajímáme. Pomocí pulzní gelové elektroforézy jsou pak izolovány fragmenty o velikosti 50-200 kb. 2. Spojením konců fragmentů DNA-ligázou se vytvoří kružnicové molekuly, v nichž se původně vzdálené konce nacházejí v těsné blízkosti. Štěpením kružnicových molekul se druhou restriktázou vytvoří fragmenty, z nichž část ponese spojené konce původních fragmentů. 3. Tato spojení jsou pak klonována do fágového vektoru za účelem založení knihovny pro přeskakování. Při analýze genomové DNA se pak postupuje tak, že se z počátečního úseku studované DNA připraví sonda a použije se k vyhledání přeskakovacího klonu v knihovně pro přeskakování. Jakmile je klon nalezen, použije se druhý konec jeho inzertu k přípravě sondy, kterou lze zahájit procházení po chromozomu oběma směry z místa vzdáleného 5O-2O0 kb od počátečního úseku. Sondu lze použít rovněž pro vyhledání dalšího přeskakovacího klonu a k zahájení dalšího procházení po chromozomu ze vzdálenějších míst. IV. Fyzikální mapování DNA (genomu) 1. Konstrukce restrikčních map Konstrukce přesné reštrikční mapy bývá jedním ze základních kroků při charakterizaci DNA. Reštrikční mapa je schematickým znázorněním poloh a vzdáleností restrikčních míst na molekule DNA. Je tudíž formou fyzikální mapy DNA, jelikož se vzdálenosti mezi jednotlivými místy udávají v počtech nukleotidů. Postup, podle kterého probíhá sestavování reštrikční mapy, se nazývá reštrikční mapování. Výchozím materiálem pro reštrikční mapování může být neporušená izolovaná genomová DNA (jednotlivé chromozomy, plazmidy, DNA mitochondrií a chloroplastů nebo genomová DNA virů), fragmenty DNA klonované ve vektorech anebo získané polymerázo-vou řetězovou reakcí. V závislosti na velikosti DNA se k reštrikční mu mapování používá několik různých postupů, které lze vzájemně kombinovat. Pro konstrukci reštrikční mapy DNA, jejíž velikost se pohybuje řádově v jednotkách nebo desítkách kilobází, se používá některá z následujících metod: 1. Štěpení DNA dvěma nebo několika restrikčními enzymy a vyhledávání překrývajících se restrikčních fragmentů. DNA se štěpí nejdříve každým enzymem samostatně a dále pak vždy dvěma enzymy současně. Stanoví se velikosti vytvořených fragmentů v každém ze štěpení a srovnáním jejich délek se určí polohy restrikčních míst pro každý enzym. Lze postupovat rovněž tak, že fragmenty vzniklé štěpením jedním enzymem jsou odděleny elektro-forézou a po izolaci z gelu štěpeny dalším enzymem. Postup je vhodný v těch případech, kdy celkový počet restrikčních míst na molekule DNA není příliš vysoký. Příklad mapování DNA o délce 17 kb výše uvedeným postupem je na obr. 27. 2. Částečné štěpení DNA jednou reštrikční endonukleázou a separace vytvořených fragmentů elektroforézou. Fragmenty jsou jednotlivě izolovány z gelu, doštěpeny stejnou reštrikční endonukleázou a vzniklé subfragmenty jsou znovu separovány elektroforézou. Soubory vzniklých subfragmentů jsou pak přiřazeny k prvotním fragmentům. 3. Částečné štěpení DNA radioaktivně značené na jednom z konců, elektroforetická separace vytvořených fragmentů a odečtení jejich délek z autoradiogramu. Délky vytvořených fragmentu odpovídají přímo vzdálenostem restrikčních míst použitého enzymu od značeného konce výchozí molekuly DNA, Tento postup je vhodný u větších molekul, které enzym štěpí na více místech. Na obr. 28 je uveden příklad této metody při mapování kružnicové molekuly DNA. Obdobný postup, při němž se místo přímo značené DNA použije sonda komplementární ke koncové oblasti, se nazývá nepřímé značení konců. Pomocí takové sondy budou technikou Southernovy hybridizace detekovány pouze reštrikční fragmenty obsahující koncovou oblast. Výhodou tohoto postupuje omezení práce s radioaktivitou. Konstrukce přesné reštrikční mapy je ve všech uvedených případech podmíněna identifikováním všech vytvořených restrikčních fragmentů a přesným stanovením jejich velikosti, která se určuje gelovou elektroforézou. 46 FYZIKÁLNÍ MAPOVÁNÍ DNA (GENOMU) enzym 1 a enzym 1 enzym 2 enzym 2 gel 3 3 kb 0 elektroforetická separace 4 enzym 1 enzym 2 enzym 1 a enzym 2 4^ t í í reštrikční t~ mapa -I—(- RE1 RE2 RE1 Obr. 27 Konstrukce reštrikční mapy kombinovaným štěpením dvěma restrikčními enzymy. Štěpení molekuly DNA enzymem 1 vedlo k vytvoření 3 kb, 6 kb a 8 kb fragmentu (tj. na DNA jsou pro tento enzym dvě cílová místa), ale neprokázalo, zda se 3 kb fragment nachází uprostřed nebo na konci štěpené sekvence. Kombinované Štěpení enzymy t a 2 ponechalo 6 kb a 8 kb fragmenty intaktni, ale došlo k rozštěpení 3 kb fragmentu, což dokazuje, že enzym 2 štěpí uvnitř 3 kb fragmentu vytvořeného enzymem 1, Pokud by 3 kb fragment byl na konci analyzované sekvence, pak štěpení samotným enzymem 2 musí dávat 1 kb nebo 2 kb fragment. Protože tomu tak není, musí být 3 kb fragment vytvořený po štěpení enzymem 1 uprostřed. To, že cílové místo pro enzym 2 leží blíže 6 kb fragmentu než 8 kb fragmentu lze odvodit z faktu, že po štěpení enzymem 2 vznikají fragmenty o velikostech 7 kb a 10 kb. FYZIKÁLNÍ MAPOVÁNÍ DNA (GENOMU) 47 1. linearizace molekuly Itěpeni I J * * \Alui |1 2 3 4 5 6 7 8 9| í í í | Haelll 2. značení na koncích ■Jjř ozn ače n í 5 konců32P ^1 2345678 9frfc částečné štěpeni Ah>\ *\\ 2 3 4 5 eT| [Ur* Reštrikční mapy umožňují napf. srovnávat DNA různých jedinců nebo příbuzných organizmů, aniž by bylo nutné přesně stanovit jejich kompletní nukieotidové sekvence. Lze pomocí nich snadno nalézt polymorfrzmy v sekvencích genomové DNA způsobené mutacemi, jejichž základem jsou nukieotidové substituce (v restrikčních místech), nebo delece a inzerce nukleotidů v sekvencích, nacházejícími se mezi dvěma restrikč-ními místy. U klonovaných sekvencí DNA umožňuje konstrukce reštrikční mapy lokalizovat geny na specifické reštrikční fragmenty DNA a usnadnit tak jejich následnou izolaci a charakterizaci. Reštrikční mapy lze poměrně snadno sestrojit u DNA menších velikostí, jako jsou gen omy virů, organe lární genomy eukaryot, molekuly plazmidů nebo jednotlivé geny prokaryot a eukaryot kionované do vektorů, u nichž lze velikost restrikčních fragmentů snadno stanovovat konvenční elektroforézou. Molekulární analýza kompletních genomů prokaryotických a zvláště pak eu-karyotických organizmů vyžaduje charakterizaci velmi dlouhých úseků DNA, jejichž velikost mnohdy přesahuje několik mega-bází. K sestrojení jejich fyzikální mapy a sekvencování a je proto třeba použít jiných postupů než těch, které jsou běžně využívány při analýze jednotlivých genů. Jejich základem jsou dva vzájemně se doplňující přístupy (obr. 29): • přístup shora dolů, při němž je výchozím materiálem intaktní chromozom (např. bakteriální chromozom nebo jednotlivé eukaryot ické chromozomy) a výsledkem je makrorestrikční mapa, • přístup zdola nahoru, při němž se vychází z genomové knihovny klonovaných fragmentů DNA, které se postupně *fc|1 2 3 4 5 I I 6 7 8 9Řfc jfcPTTl |4 5 6 7 8 9Bfc #£□ I2 3456789flfc nejde! ší fragment 3. izolace nejdelšiho fragmentu a jeho částečné štěpeni Aiu\ nebo Hasili M0\] čá!tečné \Hae\W f slepeni ^ [2~3l [4 5 6 7 6 gfrfrA [|] |3 4 5 6 7 8 9l& D E 3 4 5| 16 7 8 p|| B |2 3 "4j j5 6 7 8 9|9E e 12 3 4 5 6 7| rš~9b^C |2 3 4 5 6| [7T|íjř F 12 3 4 5 6 7 8| G \ gelová elektroforéza \ a auto rad iografie mapa [4 5 6 7 8 9|# A 6 7 8 9jjfe B T 2 3 —^ 4 5 ...... i= 7 - ý 9 D 13 4 5 6 7 8 Ôfelŕ e j5 6 7 8 9Efr f 17 8 9 Atu\ HaeUi 4. elektroforéza, stanovení velikosti fragmentu a sestrojení mapy Obr. 28 Reštrikční mapování koncově značené DNA. Molekula DNA je íinearizována enzymem EcoRl. Lineárni molekula DNA je pak značena na 5'-koncích a částečně štěpena enzymem Alu\ (nebo by mohl být použit i enzym HaelU) za vytvoření fragmentu různých délek, Z nichž ty, které obsahují koncové sekvence původní molekuly DNA nesou na jednom ze svých konců radioaktivní značku. Po elektroforetické separaci je vybrán a z gelu izolován nejdelší fragment DNA a vzorek jc rozdělen na dvě části. Jeden vzorek je opět částečně štěpen Alul, druhý vzorek je částečně štěpen HaeUl. Nové sady fragmentů jsou separovány v gelu a jejich poloha se identifikuje autoradiografieky. Pořadí restrikčních míst lze přímo odečíst z délek fragmentů v příslušných drahách. 48 FYZIKÁLNÍ MAPOVÁNÍ DNA (GENOMU) sestavují do souvislých sekvencí označovaných jako kontigy. Tento postup se proto označuje jako kontigové mapování a jeho výsledkem je fyzikální mapa tvořená souborem uspořádaných klonů (dílčích kontigů). ——- přístup shora dolů chromozóm makrorestrikční mapa přístup zdola nahoru A kontkjová mapa kontkjy klony - í í í t t t t t štepení re I I v. uspořádání f Sní klonú í genomová Obr. 29 Základní strategie pro mapovaní a sekvencováni velkých genomů PŘÍSTUP SHORA DOLŮ, Tento přistup je založen na přípravě velkých fragmentů DNA z neporušených chromozomů a jejich bezprostředním použití ke konstrukci reštrikční mapy, která je pak základem k následnému sekvencováni DNA. Ke štěpení chromozómové DNA se používají vzácně Štěpící reštrikční endonukleázy, které rozpoznávají delší a tudíž v genomu jen zřídka se vyskytující sekvence. Příkladem takových enzymů jsou např. Noň (rozpoznávající sekvenci GCGGCCGC), Smál (CCCGGG) nebo Pacl (TTAATTAA). Štěpením DNA chromozomů těmito enzymy vznikají reštrikční fragmenty o velikosti stovek kilobází až několika megabází, které lze účinně rozdělit jen pulzní gelovou elektroforézou. Strategie pro sestavení reštrikční mapy je však odlišná od té, která se používá při mapování krátkých úseků DNA. K seřazení fragmentů se obvykle používají genově nebo sekvenčně specifické hybridizační sondy. Pří použití kombinace většího počtu sond a několika restrikČ-ních endonukleáz lze pak fragmenty hybridizující se stejnými sondami vzájemně seřadit (obr. 30). Reštrikční mapa sestrojená tímto postupem s využitím pulzní gelové elektroforézy se označuje jako makrorestrikční mapa. 49 FYZIKÁLNI MAPOVÁNÍ DNA (GENOMU) kb 2200 ~ 1500 ~ 700 -200 ~ N M R N M R N M R N M r N mr N m r w-w-i S3 S101 S15 S39 MxA/B auto rádiogramy po hybridizaci genomové DNA štépené Not! (N), Mlul (M) a Nruí [R) se sondami S51 Reštrikční fragmenty hybridizujícl k použitým sondám - označené fragmenty hybridizují k vice sondám. sonda enzym S3 S101 S15 S39 MxAJB S51 Non 700 1800 2200 Aí/ul 700 1000 200 NfU\ 600 fTooo) 500 (2ÔÔÔ) Šipky naznačují mista na genomové DNA, kde se vážou sondy. makrorestríkční mapa Nott [2 1800 |_ _22 QQ _I j 700 ■ 1400 m MM 700 1000 1250 5ZI 2000 Nru\ 1 eoo 1400 600 | mm 1000 ~1— 2000 3000 40CC 5000 kb Obr. 30 Konstrukce makrorestrikční mapy dlouhého ramene lidského chromozomu 21. Pro mapování byly použity tři vzácné štěpící enzymy (N-Afo/I, M-Mul, R-AV-wl) a šest různých radioaktivně značených sond (S3, S101, SI 5, S39, MxA/B, S51). Zcela nahoře jsou znázorněna spektra restrikčních fragmentu, které byly rozděleny pulzní gelovou elektroforézou, hybridizovány se sondami a následne detekovány autoradiograficky. Níže jsou uvedeny velikosti fragmentu vytvořených jednotlivými enzymy, k nimž hybridizují použité sondy. Šipky označuji místa vazby sondy na DNA. Z obrázku je patrné, že některé fragmenty jsou detekovány více než jednou sondou; např. sondy S101 a SI 5 detekují tentýž Noů 1 400 kb fragment. V případech, kdy dochází jen k částečnému Štěpení DNA (patrně v důsledku metylace) se na autoradio-gramu objevují dva pruhy, neboť sonda hybridizuje jak k fragmentu vznikajícímu úplným tak i částečným Štěpením DNA. Např. sonda Miň S3 detekuje 700 kb fragment, S101 detekuje 50 FYZIKÁLNÍ MAPOVÁNÍ DNA (GENOMU) 1 000 bp fragment, a obě sondy detekují částečně štěpený 1 600 bp fragment, který je siožen z obou menších (přesnou délku fragmentů lze při hodnocení makrorestrikčních spekter stanovit jen obtížně a jejich součet pak nemusí souhlasit). Výsledkem mapování je sestavení hrubé makrorestrikční mapy pokrývající přibližně 5 000 kb chromozomu 21. Jako hybridizační sondy k přiřazení sousedních fragmentů vytvořených štěpením vzácně Štěpícími restrikčnímí endonukleázami lze použít rovněž fragmenty genomové DNA obsahující úseky genomu, na nichž se nacházejí reštrikční místa pro tyto enzymy (např. Notí) (tyto fragmenty lze získat částečným štěpením genomové DNA některou z běžných restrikČ-ních endonukleáz podobným postupem jako při konstrukci knihovny pro přeskakování po chromozomu; podrobný postup však neuvádíme). Klonováním těchto fragmentů se připraví knihovna spojujících klonů, která se skládá z velkého počtu tzv. spojujících klonů, v nichž klonované fragmenty DNA nesou reštrikční místa pro vzácně štěpící enzymy z různých míst genomu. Sonda připravená ze sekvence klonovaného fragmentu určitého spojujícího klonu bude hybridizovat s restrikčnímí fragmenty, vytvořenými štěpením genomové DNA právě v tom místě, které bylo do tohoto spojovacího klonu nakloňováno. Vedle fyzikálního mapování pomocí pulzní gelové elektroforézy se vyvíjejí rovněž techniky pro přímou detekci restrikčních míst na eukaryotických chromozomech. Vzorek deproteinovaných chromozomů se umístí do roztaveného gelu, při jehož tuhnutí se chromozomy natáhnou tokem gelové tekutiny. Po štěpení reštrikční endonukleázou vzniknou pak v místě naštěpení na chromozomech mezery, které lze přimo pozorovat světelným mikroskopem. Z velikostí fragmentů lze sestrojit reštrikční mapu. Další fyzikální metoda použitá např. při analýze genomu Drosophila melanogaster a člověka je založena na mikropreparaci malých úseků (krátkých fragmentů DNA) z chromozomů pomocí mikromanipulátoru a jejich amplifíkaci poíymerázovou řetězovou reakcí. Lze tak získat sekvence DNA pro klonování a hybridizační analýzu z dosud necharakterizováných oblastí genomu. PŘÍSTUP ZDOLA NAHORU. Tento přístup spočívá ve vytvoření souboru klono-vaných fragmentů genomové DNA, jejichž uspořádáním lze sestavit spojitou sekvenci odpovídající celému genomu nebo dílčím chromozomům Výchozím krokem je příprava genomové knihovny obsahující velký počet náhodně klonovaných fragmentů DNA o velikosti desítek až stovek kilobází. Při konstrukci genomové knihovny je třeba zvolit takovou strategii klonování, aby jednotlivé klony obsahovaly vzájemně se překrývající úseky genomové DNA. Toho lze dosáhnout např. Částečným štěpením genomové DNA restrikčnímí enzymy nebo její mechanickou fragmentací. Dnihým krokem je vyhledávání klonů, jejichž inzerty (klonované fragmenty genomové DNA) se svými sekvencemi vzájemně překrývají. Následně je zvolen některý z postupů, který umožní vyhledat a navzájem přiřadit právě ty klony, které nesou překrývající se úseky genomu a postupně tak zpětně rekonstruovat spojitou (nepřerušenou) původní sekvenci genomové DNA. Průběžně sestavované dílčí spojité úseky se označují jako kontigy. V první fázi je kontigů obvykle mnoho a odpovídají jen krátkým úsekům genomu. Se zvyšujícím se počtem charakterizovaných klonů se daří kontigy postupně navzájem spojovat jeden s druhým a tím je zvětšovat (prodlužovat). Postupné seřazování klonů se proto nazývá kontigové mapování a jeho výsledkem je sestavení kontigové mapy tvořené uspořádanými kontigy. Konečným kontigem je kompletní nepřerušená sekvence DNA chromozomu nebo celého genomu. Z tohoto důvodu je kontigová mapa formou fyzikální mapy genomu. FYZIKÁLNI MAPOVÁNÍ DNA (GENOMU) 51 Pro stanovení překryvů lze použít několika různých postupů, z nichž uvádíme: Srovnání spekter restrikčních fragmentů (otisků DNA, fingrprintů), které vzniknou po štěpení inzertů jednotlivých klonů restrikčními enzymy. Klony s překrývajícími se inzerty poskytnou reštrikční spektra, která budou obsahovat fragmenty téže délky (tyto fragmenty vznikají z identických úseků genomové DNA). Tyto klony jsou pak využity k sestavení kontigů. Tímto postupem byl kompletně zmapován genom E. coli. Strategie postupuje znázorněna na obr. 31. DNA inzert klonovaný v kosmidovém vektoru obsahuje 3 místa pro Hindlll (II). Po štěpení tímto enzymem jsou konce restrikčních fragmentů radioaktivně označeny a je provedeno druhé štěpení enzymem Sau3Al (S), který štěpí častěji než //mdlil. Tím je vytvořen soubor menších fragmentů, z nichž pak pouze některé budou koncově označeny. Fragmenty jsou rozděleny na polyakrylamidovém gelu h t h 1 h "n kosrnid ^H/ndlII 1.) štěpení kosmidových klonú Hind\\\ kionovaná DNA s s s s I Z) koncové značeni restrikčních fragmentu $ s 3) štěpení značených fragmentu Sau3AI (S) s s s 1 2 3 4 5 « 7 elektroforetická separace a autoradiografie autoradiogram jednoho inzertu 7 různých inzertů srovnáni délek fragmentů vyhledání překrývajících se inzertů SEŘAZENÍ KOSMIi Obr. 31 Uspořádání kosmidových klonů srovnáním restrikčních spekter 52 FYZIKÁLNI MAPOVANÍ DNA (GENOMU) jsou charakteristická pro každý kosmidový klon v závislosti na distribuci restrikčních míst Hindíll a Sau3Al v jejich inzertu. Vlevo dole jsou znázorněny otisky DNA sedmi různých klonů. Klony vykazující 5 nebo více společných restrikčních fragmentů s velkou pravděpodobností nesou překrývající se inzerty. Srovnávání restrikčních spekter jednotlivých klonů a následné sestavení kontígů se provede pomocí počítačových programů. • Srovnání hybridizačních vzorů kl o no váných fragmentů. Připraví se velký počet krátkých uměle syntetizovaných oligonukleotidů s náhodnými sekvencemi, které se pak použijí jako sondy pro hybridizaci k DNA všech klonů genomové knihovny. Klony obsahující překrývající se inzerty klonované DNA budou hybridizovat se stejným souborem sond. Princip postupuje znázorněn na obr. 32. • Celogenomové sekvencování (sekvencováni bez předchozího mapování). Projekt zaměřený na sekvencování genomu bakterie Haemopkilus influenzae byl založen na strategii náhodného sekvencování DNA klonováných úseků bakteriálního chromozomu a jejich následném uspořádání. Nejdříve byla genomová DNA mechanicky fragmentována a po elektroforetické separaci byly fragmenty o velikosti 1,6-2,0 kb klonovány do plazmido-vého vektoru. Takto připravená genomová knihovna obsahovala vysoký počet klonů nesoucích inzerty, které se vzájemně mnohonásobně překrývaly. S využitím sekvenačních primerů vázajících se v sousedství polylmkeru vektorové DNA pak byly stanoveny krať ké sekvence konců všech inzertů a použity k vzájemnému uspořádání klonů. Díky vysokému počtu klonů a redundanci jejich sekvencí bylo možné sestavit téměř kompletní sekvencí genomu (chybějící mezery byly postupně zaplněny jednak metodou procházení příměrem, při níž se koncové sekvence klono váných fragmentů použily k navržení primerů pro sekvencování sousedních úseků genomové DNA, které se nepodařilo klono vat, a poslední chybějící sekvence DNA byly nakonec stanoveny z inzertů klono váných ve fá-govém vektoru). • Seřazení klonů na základě přítomností míst se sekvenční adresou („sequence tagged site", STS). Místa se sekvenční adresou jsou krátké (100-500 bp) jedinečné sekvence genomu, jejichž úseky lze specificky amplifikovat pomocí PCR, Jako STS lze použít: Náhodné genomové sekvence, které pocházejí z vhodně vybraných úseků klonované genomové DNA anebo se vyhledají ze sekvencí uložených v databázích. Místa s expresní adresou („expressed sequence tags", ESTs). Jsou to krátké sekvence odvozené z klonů cDNA a tudíž představující sekvence strukturních genů. EST může být použita jako STS za předpokladu, že je odvozena z jedinečného genu, nikoliv z genů patřících do genové rodiny, které mají stejné nebo velmi podobné sekvence. Úseky genomu vyznačující se sekvenčním polymorfizinem, např. polymorfizmy typu minisatelitů (SSLP, VNTR) nebo mikrosatetiíů (STRs, „simple tandem rcpcats" — d i-, tri- nebo tetranukleotidové repetice). Zvláště cennejšou SSLP, které byly již zmapovány vazbovou analýzou a představují tak přímé propojení mezi genetickými a fyzikálními mapami. FYZIKÁLNI MAPOVÁNÍ DNA (GENOMU) 53 -—- hybrid i2ace se sondou [aJ [D s pozfce kosmtdu na filtru 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 20 repliko vých flitrů, každý se sedmi kosmidy. Každý filtr je hybridizován s oäigonukleotidovou sondou {1-20). binárni charakter hybridízace ojkjofiukleot.do^á sonda A C D £ F G o o o Q 0 0 o b c é 7 ~w 0 0 o o o o S 10 11 D D O o 1g 13 14 15 O D 0 0 t 16 17 0 Q 0 □ e o o o o o 18 19 ?0 é D 0 D Kosmid A hybridizuje se sondami 2, 7,14 a 19. stanovení pfekryvii kosmid 12 6 13 17 14 19 11 15 a 16 10 20 18 Stanovení pŕekryvíi kosmidů (těch, které hybridízují se stejnými sondami). kontigová mapa pfekryvú kosmidů 1 4 12 5 13 172 14 7 19 11 15 5 S 16 3 10 9 20 18 oligonukfeotidové sondy ^4 ^ ^ 41 ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ genornová DNA kosmid y mmn;;::::::!»$mm m Uspořádání kosmidů do konligové mapy.. Obr. 32 Koníigové mapováni s využitím náhodných oligonukleotidových sond (binárni fíngrprín-ti n g): přiřazení klonovaných fragmentu genomové DNA na základe hybridizace, Je analyzováno celkem 7 kosmidových klonů označených písmeny A-G. Nejdříve jsou z jednotlivých klonů izolovány DNA, které jsou uspořádaně naneseny na 20 hybridizačních filtrů. Každý / filtrů je pak jednotlivě hybridizován s připravenými oligonukleotidovými sondami (označené čísly I až 20). Pozitivní výsledek hybridízace klonu k sondě se označí číslicí l, negativní reakce číslici 0. Klony, jejichž inzerty obsahují společné genomové sekvence, budou hybridi 7,avat s týmiž sondami (napr. klony A a C hybridízují se sondami č. 2 a 14). Stanovením znaků I a 0 pro každý klon lze klony uspořádat. Významným rysem tohoto typu analýzy je automatizace založená na počítačovém zpracováni hybridizačních údajů. 54 FYZIKÁLNÍ MAPOVÁNÍ DNA (GENOMU) Jako výchozí materiál pro mapování genomu pomocí STS lze použít soubor překrývajících se fragmentů genomové DNA pokrývajících celý studovaný genom nebo určitý chromozom. Takovým souborem může být: 1. Panel radiačních hybridů. Radiační hybrid je hlodavci buňka obsahující fragmenty chromozomů z jiného, např. lidského organizmu. Výstavem lidských buněk X-paprskům (3 000-8 000 rad) nebo rentgenovému záření vyvolá v chromozomech náhodné zlomy za vzniku fragmentů různé délky. Ozáření má na lidskou buňku letálni vliv, fragmenty chromozomů se však mohou udržovat, pokud je buňka bezprostředně po ozáření fúzována s neozářenou hlodavci buňkou. Fúze je navozena buď chemicky polyetylenglykolem nebo infekcí virem Sendai. V buňkách hybridů jsou chromozómové fragmenty lidské DNA náhodně začleněny do chromozomů hlodavci buňky. Tyto fragmenty jsou obvykle dlouhé 5-10 Mb, takže každá buňka obsahuje přibližně 15-35 % ekvivalentu lidského genomu. Soubor hybridních buněk se nazývá panel radiačních hybridů a může sloužit pro STS mapování za předpokladu, že PCR primery pro STS neamplifikují ekvivalentní oblasti hlodavci DNA. Lze připravit též panely radiačních hybridů obsahující pouze jeden lidský chromozom. Radiační hybridy se staly důležitým materiálem při mapování lidského genomu v rámci projektu HGP. V současné době jsou k dispozici standardní panely celého lidského genomu, které jsou používány celosvětově, což umožňuje propojovat a přímo srovnávat mapovací údaje získané v různých laboratořích. 2. Genomová knihovna. Knihovna klonů může být připravena z genomové DNA reprezentující celý genom, nebo to může být knihovna specifická pro jeden chromozom (vychází se z chromozomů separovaných průtokovou cytometrií). Pro klonování se s výhodou používá vektorů s velkou klonovací kapacitou (např. umělé kvasinkové nebo bakteriální chromozomy). Analýzou STS se vyhledají klony obsahující překrývající se fragmenty, což pak umožní sestavit kontigy a jejich následným uspořádáním pak vytvořit dlouhé souvislé úseky DNA. Údaje o STS se potom využijí k lokalizaci těchto úseků na fyzikální mapě. Pokud STSs současně představují SSLPs, které již byly mapovány genetickou vazbovou analýzou, lze vzájemně propojit fyzikální mapu s mapou genetickou. Ve srovnání s panely radiačních hybridů mají knihovny klonů pro STS mapování přednost v tom, že individuální klony mohou být později bezprostředně využity pro stanovení sekvence DNA. 2. Detekce polymorfizmu v genomech Metody molekulární diagnostiky se zaměřují na vyhledání rozdílů v sekvencích DNA a identifikaci polymorfizmu v celkové genomové, chromozómové, mitochondriové, chloroplastové nebo píazmidové DNA a nebo polymorfizmu specifických genů, případně jejich částí. Za předpokladu, že rozdíly v sekvenci DNA ovlivňují určité fenotypové znaky, mohou tyto metody nahradit jiné diagnostické techniky (např. biochemické nebo sérologic-ké). Záměrem použití jednotlivých metod je zpravidla identifikace nebo typizace studovaných vzorků, které mohou poskytnout informace důležité pro rozlišení jedinců, léčbu choroby, vyhledání zdroje patogenních organizmů, provedení preventivních opatření anebo fylogenetické studie. Metody založené na analýze DNA mají na rozdíl od fenotypových metod 100% typovátelnost, protože všechny organizmy DNA obsahují. Genotypové diagnostické metody jsou rychlé a často nevyžadují předchozí kultivaci buněk. Pro studium sekvenčního polymorfizmu DNA mohou být použity přímé metody, při nichž se přímo stanovuje sekvence variabilní oblasti DNA (kapitola V.). Tyto metody jsou však časově náročné a často nevhodné pro rutinní provádění. Častěji se proto používají FYZIKÁLNÍ MAPOVÁNÍ DNA (GENOMU) 55 nepřímé metody, kterými lze zobrazit profil DNA konkrétního organizmu ve formě otisku DNA (fingrprintu). Otisky DNA mohou mít podobu spekter restrikčních fragmentů nebo produktů PCR rozdělených geíovou elektroforézou, případně spekter restrikčních fragmentů hybrídízujících ke specifické sondě. Výsledné vzory mohou být hodnoceny vizuálně nebo analýzou obrazu s použitím výpočetní techniky. Nepřímé metody se rozdělují na techniky založené na amplifikaci DNA (kapitola Ví.) a na techniky, u kterých se amplifíkace neprovádí; mezi ně řadíme reštrikční endoiiukleá-zovou analýzu (REA) a selektivní hybridizaci restrikčních fragmentů (SRFH) ke specifickým sondám. Samostatnou skupinu potom tvoří techniky využívající rozdílnou elektrofo-retickou pohyblivost fragmentů DNA obsahujících standardní a mutantní varianty genu, které umožňují identifikaci konformačních polymorfizmu nukleových kyselin a techniky s vysokou rozlišovací schopností pro detekci jednonukleotidových polymorfizmu (SNP) (str. 69), POLYMORFIZMUS DÉLKY RESTRIKČNÍCH FRAGMENTU (RFLP). Při analýze genomu lze využit rozdílů v restrikčních mapách jedinců téhož druhu. Tyto rozdíly, podmíněné různou délkou a počtem restrikčních fragmentů vytvořených štěpením genomové DNA (nebo její části) určitou reštrikční endonukleázou, se označují jako polymorfizmus délky restrikčních fragmentů (RFLP). Jejich podstatou jsou buď mutace, které vedou k vytvoření nebo ztrátě rozpoznávacích míst pro reštrikční endonukleázy, nebo vznikají jako důsledek přítomnosti různého počtu repetitivních sekvencí, delecí, inzercí nebo přestaveb ve specifických oblastech chromozómů (obr. 33). Rozdíly ve velikosti restrikčních fragmentů u různých jedinců lze snadno detekovat gelovou elektroforézou, která může být doplněna Southemovou hybridizaci se sondami specifickými pro polymorťhí oblasti genomu. Selektivní hybridizace umožní snazší interpretaci výsledků analýzy RFLP snížením počtu srovnávaných fragmentů, které lze využít i jako signální znaky při mapování genomu. změny u 400 top fragmentu: x> g ■M N izolace chromozomální A DNA ->■ B ^ štěpení restrikíní endonukleázou výsledné fragmenty: c _ o -C & £ 3 Z ■m in A c_^ľt^> B c cV^=> dráha: 400 250+150 A B 600 C CL -O O lil 450 D 600 500 450 400 350 250 20Ů 150 100 počet změn Cl £t O TJ O 360 e gelová elektroforéza / Southernova hybridizace Obr. 33 Analýza polymorfizmu délek restrikčních fragmentů chromozómové DNA 56 FYZIKÁLNÍ MAPOVÁNÍ DNA (GENOMU) Při analýze prokaryotického genomu metodami selektivní hybridizace restrikČních fragmentů se využívají: • sondy připravené z náhodně vybraných sekvencí, • sondy specifické pro esenciální geny nebo geny kódující faktory virulence u patogenů, • sondy odvozené z vícekopiových elementů typu inzerČních sekvencí, transpozonů nebo jiných repeticí, • sondy připravené z genů pro 16S rRNA nebo 23S rRNA (ribotypizace). Pro eukaryotické genomy mohou být využity: • jednolokusové sondy hybridizující k různým hypervariabilním oblastem genomu, • mnoholokusové sondy hybridizující k repetitivním sekvencím (minisatelitňm), • sondy připravené ze sekvencí transpozonů a retrotranspozonů. POLYMORFIZMUS DÉLKY AMPLIFTKOVANÝCH FRAGMENTŮ (AFLP). Jedná se o rozdíly v délce amplifikačních produktů vznikajících při použití některých variant polymerázové řetězové reakce (např. AP-PCR, REP-PCR, Alu-PCR, ITS-PCR, SRFA) Pod* statou tohoto polymorfizmu jsou změny v sekvencích DNA pro vazebná místa primerů nebo delece a inzerce v amp 1 ifikováných sekvencích. V užším slova smyslu je označení AFLP používáno také pro pro jednu z typizačních metod, která využívá selektivní amplifikaci souboru fragmentů DNA vytvářeného štěpením restrikčními endonukleázami (str. 102). Stanovení AFLP je vhodné pro účely srovnávací typizace celkových genomových DNA a zpravidla nevyžaduje znalostí sekvencí pro hybridizaci univerzálních primerů. Metody PCR, kterými byl stanoven polymorfizmus AFLP můžeme použít rovněž pro stanovení polymorfizmu délky fragmentů DNA s jednoduchou repeticí (SSLP). Rozdíly v délce fragmentů genomové DNA jsou v tomto případě podmíněné přítomností krátké tandemové repetice (např. mikrosatelitu). V důsledku mutací nebo rekombinace se počet těchto repeticí může zvýšit nebo snížit. Polymorfizmy SSLP se používají k odlišení blízce příbuzných jedinců a k detekci vztahů mezi nimi v genetice populací. POLYMORFIZMUS DÉLKY FRAGMENTŮ DNA VYTVOŘENÝCH CLEA-VASOU (CFLP). Cleavasa I je specifická endonukleáza upravená metodami genového inženýrství, jejíž cílové místo se nachází vždy u paty vlásenky vytvořené v molekule jedno-řetězcové DNA. Diagnostická metoda CFLP využívá tohoto enzymu k detekci a lokalizaci polymorfizmu v molekulách ssDNA připravených denaturací fragmentů koncově značené genomové DNA s optimální velikostí do 2 700 bp (obr. 34). ssDNA vytváří po rychlém snížení teploty roztoku různé sekundární struktury (vlásenky, vlásenky se smyčkou, křížové struktury) v závislosti na své primární struktuře. Enzym nepůsobí na všechny vlásenky, pravděpodobně v závislosti na dalších faktorech ovlivněných strukturou ssDNA, a proto dochází k částečnému štěpení jednořetězců. Mutace a modifikace v nukleotidových sekvencích ovlivňují sekundární strukturu ssDNA a konečným výsledkem je vytvoření rozdílných míst rozpoznávaných enzymem a vznik spektra fragmentů charakteristického pro danou molekulu. Separaci fragmentů provádíme na krátkém denaturačním polyakrylamídovém gelu s následnou detekcí koncově značených fragmentů autoradiografií. Metoda CFLP porovnává tvorbu vlásenek v jednořetězcích, ale z obecného hlediska je polymorfizmus CFLP analogický s RFLP. Pro detekci známých mutací v genomech může být vytvoření vlásenek rozeznávaných cleavasou I navozeno prostřednictvím sekvenčně specifických invazivních oligonukleotidů vytěsňujících část řetězce sekvenčně specifických signálních sond, které indikují přítomnost cílových sekvencí. Produkty štěpení signálních sond cleavasou jsou potom detekovány fluorescenčními metodami nebo hmotnostní spektrometrií. FYZIKÁLNÍ MAPOVÁNÍ DNA (GENOMU) 57 standardní typ I M 1 I I I M II I I I I I I I I I I I M I I H I H i i i i l i I I I.H I i i i i i i i i i i t i l i i i m mutant 1 koncové značeni a denaturace FIM I I I I I I ! I I I I I I II I ! I M I T" Mi. iZyki n t i i i i t n i n i i n i i t i i sílí. Ž%.............. $1 I I I I I I M I M I I 1 I I I I I I I I I I I M I I I I 'i*ítTT7 ochiazeni a vytvorení sekundární struktury ssDNA I I I I t I I I I I M I I I I I M I I ) I M I II 1 I částečné štepení cleavasou u paty vlásenky ^ 11111111C > 1111111 i gelová elektroforéza a vytvoření profilu CFLP 1 Obr. 34 Princip detekce polymorfizmu délky fragmentů DNA vytvorených cleavasou POLYMORFIZMUS KONFORMACE JEDNOŘETĚZCŮ (SSCP). Diagnostická metoda analýzy konforrnačního polymorfizmu jednořetězců využívá tvorby rozdílné sekvenčně specifické intramolekulámí struktury ssDNA nebo ssRNA ovlivňující mobilitu jed-nořetězců při nedenaturujících elektroforetických podmínkách. Analýza SSCP je vhodná pro sledování změn (mutací) v krátkých úsecích DNA libovolného původu o velikosti 150 až 400 bp, připravených polymerázovou řetězovou reakcí (PCR-SSCP). Obvykle se používá pro detekci sekvenčních rozdílů mezi různými aíelami téhož genu. Jednořetězcové molekuly DNA se připraví denaturací dvouřetězcových molekul formamidem nebo teplem a rozdělí se elektroforézou v nedenaturačním polyakrylamidovém gelu (obr. 35). Jednořetězce lišící se svou sekvencí byť i jedinou bází vytvářejí rozdílné sekundární struktury s různou elektrofo-retickou pohyblivostí, což umožňuje rozlišit polymorfní alely. Diskriminační účinnost a rcprodukovatelnost této metody se snižuje u fragmentů DNA delších než 400 bp. Fragmenty vhodné velikosti lze získat štěpením restrikčními endonukleázamí (RFLP-SSCP) nebo polymerázovou řetězovou reakcí. POLYMORFIZMUS KONFORMACE DVOUŘETĚZCŮ (DSCP). Pokud jsou denaturované produkty polymerázové řetězové reakce podrobeny pomalé renaturaci, vytvářejí duplexy DNA. Duplexy, jejichž řetězce se vyznačují úplnou komplementaritou bází FYZIKÁLNÍ MAPOVÁNÍ DNA (GENOMU) (homoduplexy) a hybridní molekuly DNA, jejíž řetězce se vyznačují neúplnou komplementaritou bází (heteroduplexy) mají v nedenaturujících gelech rozdílné elektroforetické pohyblivosti. 1 v případě jediného chybného páru bází může být heteroduplex zřetelně zpomalen vzhledem k homoduplexu. Analýza pohyblivosti heteroduplexů (HMA) se používá k lokalizaci a detekci bodových mutací v genomech. Její účinnost může být zvýšena elektroforetic-kou separací v denaturačním gradientním gelu. molekuly dsDNA o stejné velikosti, ale s odlišnou sekvencí 111 r 11 r 111 iitffiiiiii -o, mi.tňrjf> Miniím učinili íf* mutace I -tí? *£> ssDNA denaturace formamidem a teplem ssDNA I nedenaturační polyakrylamidová I gelová elektroforéza, V barvení stříbrem Obr. 35 Princip metody SSCP. Homozygotní DNA vytváří 2 elektroforetické formy, heterozygotní DNA obsahující sekvence dvou různých alel vytváří 4 elektroforetické formy, odpovídající komplementárním řetězcům DNA. V. Stanovení sekvence DNA (sekvencování DNA) Cílem sekvencování DNA je stanovení primární struktury neboli pořadí nukleotidů v molekulách DNA. Metody, které umožňují rychle a spolehlivě stanovit sekvenci nukleotidů hrají klíčovou roli v analýze genomů a umožňují lépe porozumět molekulární podstatě základních biologických procesů. Znalost sekvence DNA je rutinně používána k odvození informace o aminokyselinové sekvenci kódovaných proteinů, o regulaci jejich tvorby a umožňuje též detailně stanovit charakter mutací, které se např. projevují vznikem genetických chorob. Znalost sekvencí DNA také značně urychlila rozvoj dalších molekulárních metod, mezi které patří např. polymerázová řetězová reakce, jejíž provedení je na znalosti sekvencí DNA často závislé. V současné době jsou k sekvencování DNA používány dvě principiálně odlišné metody. První je založena na specifické degradaci řetězců nukleových kyselin pomocí chemických sloučenin a je proto označována jako chemická metoda nebo též podle jmen autorů jako Maxamovo-Gilbertovo sekvencování. Druhá metoda využívá specifickou inhibici enzymové syntézy řetězců DNA a je označována jako enzymová metoda nebo též podle jména autora Sangerovo sekvencování. I když se obě metody svým principem diametrálně liší, je v obou případech základním požadavkem pro zahájení sekvencování příprava molekul DNA s přesně definovanými konci. Nejčastěji používaným výchozím materiálem pro sekvencování DNA jsou proto reštrikční fragmenty, nakloňované ve vhodném klonovacím vektoru, nebo fragmenty získané PCR. Společným rysem obou metod je rovněž splnění několika technologických požadavků; • definování jednoho z konců fragmentu DNA, u něhož sekvenci stanovujeme, • vytvoření souboru jednořetězcových molekul DNA, jejichž vzájemná velikost se liší o jedinou bázi, • rozdělení tohoto souboru fragmentů elektroforézou s takovou rozlišovací schopností, která umožňuje navzájem oddělit řetězce DNA lišící se svou délkou o jedinou bázi. Poslední fáze sekvencování spočívá ve vyhodnocení získaných sekvencí. To se již neobejde bez využití počítačů a speciálních programů, kterými lze stanovené sekvence komplexně analyzovat. Při této analýze se provádí: • vyhledání otevřených čtecích rámců, které mohou být potenciálními geny, • vyhledání exonů a intronů a převedeni sekvence nukleotidů do sekvence aminokyselin v proteinech, • vyhledání známých motivů na DNA, charakteristických pro regulační oblasti, • vyhledání repetitivních sekvencí, • vyhledání rozpoznávacích míst pro reštrikční enzymy, čímž se získá kompletní reštrikční mapa, • srovnání stanovené sekvence nukleotidů nebo z ní odvozené sekvence aminokyselin se sekvencemi uloženými v databankách, v nichž se shromažďují údaje získané v laboratořích celého světa. CHEMICKÁ METODA SEKVENCOVÁNÍ DNA (MAXAMOVO-GILBERTOVO SEKVENCOVÁNÍ). Podstatou chemické metody sekvencování je specifické rozštěpení molekuly DNA chemickými činidly v místech, kde je lokalizována báze určitého typu. Výchozím materiálem je soubor identických fragmentů jednořetězcové DNA označených na jednom konci radioaktivní značkou. Každý ze čtyř typů bází v molekule DNA lze určitým 60 STANOVENÍ SEKVENCE DNA (SEKVENCOVÁNÍ DNA) způsobem modifikovat tak, aby bylo v tomto místě možno dosáhnout přerušení řetězce DNA. Mezi chemikálie používané pro navození modifikací bází patří dimetylsulfát, hydroxid sodný, kyselina mravenčí a hydrazin (Tabulka 2). Podmínky reakce se zvolí tak, aby byla poškozena v průměru pouze jedna báze v řetězci. Výsledkem modifikace a nakonec i eliminace báze je vytvoření křehkého místa v řetězci DNA, které je velice citlivé ke štěpení. Poté je DNA za vysoké teploty vystavena působení pipcridinu. což vede k rozštěpení řetězce v zeslabených místech. Reakce je prováděna ve velkém souboru molekul, proto je výsledkem Štěpení soubor fragmentů DNA všech různých délek, které odpovídají vzdálenosti bází příslušného typu od značeného konce výchozí molekuly DNA. Postup sekvencování probíhá v následujících krocích (obr. 36); • příprava značených jednořetězcových fragmentů DNA, jejichž sekvence má být stanovena, • rozdělení souboru fragmentů DNA do čtyř vzorků, • působení chemickou látkou, která specificky modifikuje jeden nebo dva typy bází DNA u každého vzorku, ■ působení další chemické látky, které vede k rozštěpení řetězců DNA ve všech místech, v nichž byly báze modifikovány, • rozdělení fragmentů DNA elektroforézou v denatarujícím polyakrylamidovém gelu; vzorky z každé ze čtyř reakcí jsou na gel naneseny vedle sebe v definovaném pořadí, • autoradiografická detekce fragmentů; detekovány budou pouze ty fragmenty DNA, které nesou označený konec, • stanoveni sekvence DNA z autoradiogramu odečtem poloh pruhů v jednotlivých drahách. Maxamovo-Gilbertovo sekvencování není rutinně používáno z několika důvodů. Data produkovaná chemickým sekvencováním bývají častěji nejednoznačná než u enzymového sekvencování, protože reaktivita chemických činidel je ovlivněna různými nečistotami. Dalším důvodem je nutnost používat radioaktivní značení konců přinášející vysokou úroveň radioaktivity. V porovnám s enzymovým sekvencováním poskytuje chemické relativně kratší sekvence a postup pro jejich získáni je laboratorně náročnější. Tabulka 2 Chemické modifikace bází používané při Maxamově-Gilbertově sekvencování Báze Specifická modifikace G Metylace dusíku N7 di mety bul fátem při pH 8,0 způsobuje, že vazba C8-C9 je citlivá ke štěpení. A + G Piperidin při pH 2,0 zeslabuje glykosidovou vazbu adeninu a guaninu protonací dusíkových atomů v purinových cyklech. C + T Hydrazin otevírá pynmidinové cykly, které recyklují do pětičetných, citlivých ke štěpeni. C Hydrazin za přítomnosti NaCl (1,5 M) reaguje pouze s cytozinem. A >C 1 lydroxid sodný (1,2 N) při 90 0C způsobuje silné štepení u A a slabé štěpení u C. STANOVENÍ SEKVENCE DNA (SEKVENCOVÁNÍ DNA) 61 v D MS t G i lP - GATCAG lP - GATCAGG elektfoforéza, autoradiografie SctIotSSÍ řetězcová DNA J korcové značení a separace řetězců "P-GATCAGG-3' ♦ A reakce modifikace bází -1-1- piperidin hydrazin i * lepení piperidinem pň vysoké teplotě A+G T+C "P-GAT "P-GATC I 'P-GA *P - GATCA 3P-GATCAG 'P - GATCAGG G A + G T + C \J hydrazin + NaCI I C I "P-GATC odečet sekvence 5" Obr. 36 Chemické sekvencování DNA podle Maxama a Gilberta ENZYMOVÁ METODA SEKVENCOVÁNÍ (SANGEROVO SEKVENCOVÁNÍ). Enzymová metoda sekvencování je v současné době nejběžnější metodou sekvencování DNA. Vyvinula se z techniky označené sekvencování + /— která poprvé využila prodloužení primem DNA-polymerázou a její specifické zakončení, avšak byla poměrně máto přesná. Při sekvencování Sangerovou metodou je DNA, jejíž sekvence má být stanovena, použita jako matrice pro syntézu komplementárních řetězců různé délky prostřednictvím DNA--polymerázy. Metoda využívá několika vlastností DNA-polymerázy: schopnosti vytvářet přesné kopie molekuly DNA a schopnosti specifické syntézy řetězce DNA ve směru 5* -> 3' od primem s volnou 3'-OH skupinou. Syntéza řetězce na matricové DNA je zahájena od místa, ke kterému je připojen sekvenčně specifický primer pro sekvencování, a ukončena 62 STANOVENÍ SEKVENCE DNA (SEKVENCOVÁNÍ DNA) v místě, v němž je do rostoucího řetězce inkorporován místo normálního deoxyribonukleo-sidtrifosfátu jeho analog 2',3'-dideoxyribonukleosidtrifosfát (ddNTP), postrádající 3'-OH skupinu (obr. 37). Ten má po začlenění do rostou-OOO cího řetězce DNA funkci koncového inhibitoru q—p_p_p_o__^Ov^káze (terminátoru) syntézy DNA, neboť DNA-poly- III \ j meráza k němu nemůže v důsledku nepřítomnosti O O O 3' C—C 3'0H-skupiny připojit další nukleotid. Důležitým H2 H2 faktem je, že ddNTP jsou DNA-polymerázou inkorporovány do rostoucího řetězce DNA podle Obr. 37 2',3'-dideoxyriukleotidy inkorpo- pravidel o párování bází. Vhodně zvolený poměr rované do řetězců nukleových mezi ddNTP a odpovídajícím dNTP (zpravidla kyselin nemohou vytvořit fosfo- i:100) v reakční směsi rozhoduje o tom, jak dlou-diesterovou vazbu s dalším při- hé fetězcej náhodně zakončené v mistech začleně-stupujídrr» dNTP v důsledku ab- ^ ddNTp> budou DNA_po1ymerázou syntetizová-Srnce j \j\ i-Kyne c ny. Podobně jako u chemické metody sekvencování jsou reakce prováděny ve Čtyřech oddělených vzorcích (obr. 38). Každá reakce je určena ke stanovení relativní pozice specifické báze na konci analyzovaného řetězce. To je provedeno přípravou reakčních směsí, které obsahují: • purifikovanou molekulu DNA, jejíž sekvence má být stanovena, • primer, připojující se k části molekuly DNA nebo k místu připojení na vektoru v případě, že se jedná o klonovanou DNA, • směs obsahující 4 normální nukleotidy a jeden ze čtyř ddNTP, • DNA-polymerázu (používají se různé typy polymeráz, např. Klenowův fragment DNA-polymerázy I, T7 DNA-polymeráza zbavená 3'-exonukleázové aktivity chemickou modifikací označovaná jako Sequenase™, zpětná transkriptáza nebo Taq DNA-polymeráza). Jako příměry lze použít krátké reštrikční fragmenty nebo synteticky připravené oligo-nukleotidy o délce zhruba 18 bází, které jsou komplementární k části molekuly DNA, jejíž sekvence se stanovuje. V případě sekvencování produktů PCR je možné použít stejné příměry se kterými byl fragment DNA amplifikován. Řada vektorů je pro účely sekvencování cíleně upravena a obsahuje obvykle po obou stranách mnohočetného klonovacího místa krátké specifické sekvence, k nimž se připojují univerzální sekvenační primery. Příkladem jsou univerzální sekvenační primery připojující se v sousedství mnohočetného klonovacího místa vektorů odvozených z bakteriofága M13mpl8 nebo MI3mpl9, které umožňují sek-vencovat oba řetězce nakloňované DNA, aniž bychom potřebovali znalosti o části analyzované sekvence pro účely připojení primem. Pro umožnění detekce nově syntetizovaných řetězců je primer, ddNTP nebo jeden ze Čtyřech dNTP radioaktivně a nebo neradioaktivně označen. Po proběhnutí polymerizační reakce se vytvořené produkty denamrují a separují na polyakrylamidovém denaturujícím gelu podobně jako při chemické metodě. Rovněž odečet sekvence z autoradiogramu nebo hybridizační membrány u neradioaktivního značení primem je obdobný. Při manuálním provádění Sangerova sekvencování je možné stanovit sekvenci dlouhou přibližně 300-400 bází. STANOVENÍ SEKVENCE DNA (SEK VĚNCOVÁN í DNA) 5' |GC ATATGTC AGTCCAGJ3' dwiinrttaavá DNA 3' [CGTATACÁGTC AGGTCJ51 ^ denaturace a pripojení primeru 5' značený primer 3' ÍCGTATACAGTCAGGTGl5' jednořetěrcová DNA i + nadbytek d AT P dTTP dCTP dGTP 4 reakce V V y 5' +ddATP +DNA-polymeráza 3' _ "a ^E35E3atgtca S' 3' _ ~™ ATGTCAGTCCA +ddTTP +DNA-polymeráza +ddCTP +DNA-polymeráza ATGTC ATGTCAGTC ATGTCAGTCC 5* 5' 51 AT ATGT ATGTCAGT +ddGTP +DN A-pol y meráz a elektroforéza, autoradiografie InTnf ATG ATGTCAG ATGTCAGTCCAG ii_ji__n__n G A C C T G A C T G T A odečet sekvence 5' Obr. 38 Enzymové sekvencování DNA podle Sangera AUTOMATICKÉ SEKVENCOVÁNÍ DNA. Významného pokroku ve stanovování sekvencí DNA enzymovou metodou bylo dosaženo po zavedení přístrojů pro automatické sekvencování DNA. Při něm se pro separaci reakěních produktů, detekci, shromáždění dat z reakce a analýzu pořadí bází používají plně automatizované aparatury. Tento přístup umožňuje stanovit a následně i zpracovat sekvence DNA mnohem rychleji než při standardních 64 STANOVENÍ SEKVENCE DNA (SEKVENCOVÁNÍ DNA) postupech. Je proto využíván zejména při sek věncování DNA z genomových knihoven, obsahujících tisíce klonů. Automatické sekvencováni má ve srovnání se standardní enzymovou metodou tyto odlišností: • syntéza DNA probíhá metodou asymetrické polymerázové řetězové reakce v termocy-kleru s využitím Taq DNA-poíymerázy (str. 94), • k detekci reakční ch produktů se používají čtyři různé fluorescenční značky, každá určená pro detekci produktů zakončených specifickou bází, • délka stanovené sekvence je typicky mezi 500-1 000 bázemi. Chemie fluoroforů pro automatické sekvencováni využívá dva odlišné přístupy: „barevně značené" primery nebo „barevně značené" terminátory. K nejčastěji používaným fluor o fórům patří FAM (6-karboxyfluorescein), TET (6-karb oxy-2', 4,7,7 '-tetracbJoro-fl uo-rescein), HEX (2,,4,4,,5,,7,7'-hexachlorofJuorescein) a TAMRA (5-karboxytetrametyl-rodamin). Pokud jsou fluorofory připojeny kprimerům, je třeba printer syntetizovat čtyřikrát a během tohoto procesuje kprimeru připojena specifická fluorescenčně značená báze. Následně jsou pro asymetrickou PCR připraveny čtyři reakční směsi, z nichž každá obsahuje templátovou DNA, čtyři dNTP, specifický ddNTP, specifický fluorescenčně značený primer a další potřebné reagenty (obr. 39). Primer definuje 5'-konec molekul produktů a začleněný ddNTP definuje totožnost báze na 3'-konci. Jakmile je reakce dokončena, jsou barevné produkty ze všech čtyřech reakcí smíchány a naneseny do jedné dráhy automatického analyzátoru. V případě, že jsou pro detekci sekvenačních produktů použity barevně značené terminátory, 3'-konec molekuly a současně totožnost báze jsou určeny příslušnou fluorescenční značkou. Polymerizační reakci lze potom provést v jedné zkumavce obsahující templátovou DNA, primer, čtyři dNTP, čtyři značené ddNTP a další nezbytné reagenty (obr. 40). Reakční produkty jsou rozděleny v elektroforetickém gelu v téže dráze. Výhodou použití barevně značených terminátorů je skutečnost^ že jsou vizualizovány pouze ty produkty prodloužených primerů, které jsou zakončeny barevně značeným ddNTP a nikoliv produkty předčasně ukončené syntézy. To umožňuje snížit signály pozadí a obecně vede k získání kvalitnějších výsledků. Detekce produktů sekvenačních reakcí probíhá v průběhu elektroforézy automaticky pomocí laserového detektoru napojeného na počítač, který z pořadí signálů v příslušných drahách přímo vyhodnocuje sekvenci DNA. U aparatur poslední generace probíhá elektrofo-retická separace v kapilárách. Kapilárnímu uspořádání se dává přednost při prostém sekvencováni a fragmentační analýze, zatímco deskovému v molekulární diagnostice při detekci heterozygotů. STANOVENÍ SEKVENCE DNA (SĽKVENCOVÁNÍ DNA) 65 místo pro připojeni univerzálního pnmeru + ddATP o- a accgta 4- inzert určený k sekvencování vektor + ddTTP ac acc detektor 71 sběr a zobrazeni dat + ddCTP accg + ddGTP dideoxyterminátory + 4 fluorescenčně označené univerzální prime ry + dNTP + Taq DNA-polymeráza asymetrická PCR, Sangerova temirnačni reakce ACCGT ACCGTAT smíchání produktu všech čtyř reakci dělení na denaturačni polyakrylamidové geíové elektroforéze >aser l_ Obr. 39 Automatické sekvencování využivajíci barevné značení primerů 66 STANOVENÍ SEKVENCE DNA (SEK VENCO VÁNÍ DNA) tempäátová DNA připojeni příměru univerzálni primer + Taq DNA-polymerázíi + ďNTP asymetrická PCR + fluorescenčně značené d id eúxy-terminátory ACÍ ACC ACCGO ACCGT0 accgtaO accgtat i přečištění a odstranění nezačleněných dideoKy-tarminátorů dělení na denaturačni polyakrylamidové gelové eíektroforéze Obr. 40 Automatické sekvencováni využívající barevné značení terminátorů SEKVENCOVÁNÍ GENOMU (CELOGENOMOVÉ), V praxi je velmi Často potřeba stanovit sekvenci fragmentu DNA, jehož velikost přesahuje 500-1 000 bází, které lze analyzovat v jedné reakci. Pro dosažení tohoto cíle, který je bčžně požadován při sekvencováni genomů, mohou být zvoleny dvě" zcela odlišné strategie: náhodné sekvencováni nebo uspořádané sekvencováni sousedních úseků. Volba odpovídající strategie závisí zejména na velikosti stanovované sekvence. Při náhodném sekvencováni genomu jsou nejdříve připraveny mechanickým stříháním genomové DNA fragmenty s optimální velikostí (1 300-2 000 bp) a po úpravě jejich konců jsou nahodile klonovány do vhodného vektoru za vzniku velkého počtu klonů. Ke štěpení DNA se využívá sonikace nebo pankreatická DNáza I za přítomnosti Mn2+. Předpokládá se, že celková informace o sekvenci obsažená v připravených malých klonech odpovídá původní DNA a sekvence fragmentů jednotlivých klonů se vzájemně překrývají. Pomocí univerzálních sekvenačních příměrů připojujících se k vektoru v blízkosti klonovacího místa jsou stanoveny sekvence krátkých úseků na koncích klonovaných fragmentů (minimálně 500 bázi). Stanovené sekvence jsou pak použity k uspořádání klonovaných fragmentů z jednotlivých vektorů do souvislých sekvencí genomové DNA - kontigů. K rekonstrukci původní sekvence se používají speciální počítačové programy pro sestavování sekvencí, které vyloučí sekvence vektorů, maskují známé repetice, vyloučí nespolehlivá data a najdou shodné úseky. Správnost stanovené sekvence je ověřena po srovnání překryvů stejné sekvence z několika různých klonů. Tato strategie však neumožní získat úplnou sekvenci genomu, protože po počítačovém sestavení zůstanou mezery, odpovídající nenakl ono váným fragmentům. Často je třeba také ověřit správnost sekvence koncových úseků genomu. K tomuto účelu je obvykle použita strategie uspořádaného sekvencováni (procházení chromozomu) popsaná níže. Pro doplnění sekvence mezer zbývajících po náhodném sekvencováni nebo pro sekvencováni malých fragmentů DNA je používán přístup procházení příměrem nebo postupné zkracování fragmentu exonukleázou a tvorba přilehlých d e led Procházení primerem vyžaduje znalost sekvence, ke které se připojuje přimet umožňující prodloužení řetězce DNA-polymerázou. Sekvence získaná z první reakce je použita pro návrh primeru pro další reakci a tento krok se opakuje, dokud není dosaženo kompletního stanoveni sekvence. Tento proces nevyžaduje další klonování a minimalizuje stanovení STANOVENÍ SEKVENCE DNA (SEKVENCOVÁNÍ DNA) 67 nadbytečných sekvencí, ale správnost stanovené sekvence by ničia být ověřena sekvencová-ním obou řetězců. Pro přípravu sady delečních mutantů s přilehlými delecemi bylo vyvinuto několik metod, které využívají specifické exonukleázy (Bal31, pankreatická DNáza I nebo exonukleáza III) postupně odštěpující více nukleotidů z jednoho nebo druhého konce cílové molekuly DNA. Fragmenty DNA s vytvořenými delecemi jsou znovu klonovány do vhodného vektoru a sekvencovány. Uspořádané sekvencování genomu je v porovnání s náhodným mnohem pomalejší a dražší v důsledku nutnosti návrhu a syntézy nových příměrů. Použití exonukleáz navíc vyžaduje značné praktické zkušenosti. Metody postupného přímého sekvencování DNA také nejsou příliš vhodné pro stanovení repetitivních sekvencí. HYDROGENSIŘIČITANOVÉ GENOMOVÉ SEKVENCOVÁNÍ. U obratlovců a vyšších rostlin hraje důležitou úlohu v organizaci a expresi genů metylace cytozinu. Metoda enzymového sekvencování však neumožňuje odlišit cytozin a 5-metylcytozin (m5C). Z tohoto důvodu byla vyvinuta selektivní chemická metoda využívající hydrogensířičitan sodný (NaHS03) k modifikaci cytozinu v DNA, označovaná jako hydrogensiřičitanové genomové sekvencování. Podstatou této metody je chemická reakce, při níž dochází u denaturované DNA ke kompletní deaminaci cytozinu na uracíl s následnou amplifikací obou řetězců pomocí PCR. Cytozinové báze přeměněné hydrogensiřičitanem na uracil jsou v průběhu PCR nahrazeny tyminem a báze 5-metyleytozinu, které nebyly modifikovány, jsou nahrazeny cytozinem. Produkty PCR mohou být buď přímo sekvencovány nebo subklonová-ny a sekvencování jsou podrobeny jednotlivé klony. Získané sekvence jsou srovnány se sekvencemi stanovenými před chemickou modifikací. Ve výsledném vzoru hydrogensiřičita-nového sekvencování se pôvodní cytozin jeví jako tymin, zatímco m C je zobrazen jako cytozin. Kvantitativní zastoupení metylcytozinů se stanovuje u přímého sekvencování produktů PCR z poměru ploch píků tyminu a cytozinu, výsledky však nejsou příliš spolehlivé. Proto se častěji sekvencuje reprezentativní počet jednotlivých klonů (20-50), a zastoupení metylcytozinů nalezených v určité poloze se vyjádří v procentech z celkového počtu sekven-covaných kionů. PYROSEKVENCOVÁNÍ. Pyrosekvencování je vysoce přesné sekvencování se syntézou DNA v reálném čase nevyžadující značené primery nebo značené nukleotidy, ani rozdělení produktů reakcí elektroforézou. Je založené na uvolnění pyrofosfátu (PPi) při enzymatické syntéze DNA. V kaskádě enzymatických reakcí je v konečném kroku emitováno viditelné světlo (obr. 41). Míra emise světlaje úměrná množství zabudovaných nukleotidů. (DNA)n + dXTP DNA-polymeráza (DNA)11+1+PPi dXTP apyráza > dXMP PPi + APS ATP sulfuryíáza ATP + SOr ATP + luciferin + 02 luciferáza ► AMP + PPi + oxyluciferin + C02 + světlo Obr. 41 Přehled reakcí probíhajících při pyrosekvencování 68 STANOVENÍ SEKVENCE DNA (SEKVENCOVÁNÍ DNA) V prvním kroku se hybridízuje sekvenační primer k jednořetězcovému templátu DNA a je inkubován s následujícími enzymy a substráty: • DNA-polymerázou I z E. coli, • ATP sulfurylázou, • luciferázou, • apyrázou, • adenoztn S'-fosfosulfátem (APS), • lucifer in cm. primer templářova DNA r*vi.....h >mľíTTTTf mhu (jjjp........ ^. je degradován + (JATP-^ je degradován + dGTP O cHeniilijminJSQSJíce = "Vrrjl M i t?f i^ rnm + + dTTP->■ je degradován + dATP ttwmilyrdifi&csnpe B iii.iii ctvemiltiminiscerwe Ul- dGTP chfmillirniriEcsríca ij^F cíierrtiluFfTini&ĽenĽfl dCTP ftiemiluminiScíľitB + ďTTP (Miamäuniíiisuarice = Irrrjťlítti9j?^T1.1 dfijp-je degradován + dGTP chemilumemsíence. = ~^TTTTr?V? pyrogram odečtená nukleotide vá sekvence G C - A GG CC T T A O C T : A G C T ":g A ■ přidaný nukleotid Obr. 42 Princip pyrosekvencování DNA Ve druhém kroku (obr. 42) se postupně přidávají (jeden po druhém) všechny čtyři dNTP (v tomto případě se označují dXTP). Pokud se na matricové molekule vyskytuje komplementární báze k přidanému dXTP, DNA-polymeráza kata lyžuj e připojení nukleotidu k primem. Pokud na matrici není přítomna komplementární báze, nukleotid bude degradován apyrázou. Každé připojení nukleotidu je provázeno uvoměním pyrofosfátu (PPi) v ekvimo-íárním množství k zabudovanému nukleotidu. Uvolněné PPi jsou kvantitativně převáděny ATP sulfurylázou za přítomnosti APS na ATP, což umožňuje luciferázou zprostředkovanou konverzi luci ferinu na ox y lucifer in. Oxyluciferin vytvoří světelný záblesk, který lze zaznamenat detektorem fotonů a zobrazit jako vrchol na pyrogramu. Nepřipojené dXTP a nespotřebované ATP jsou degradovány apyrázou. Jakmile je degradace volných nukleotidů STANOVENÍ SEKVENCE DNA (SEKVENCOVÁNÍ DNA) 69 v reakční smžsi dokončena, je přidán další dXTP. Celý proces se znovu opakuje a sekvence je odečítána z pyrogramu (obr. 42). Namísto standardního dATP je při reakci používán 2,-deoxyadenozin-5'-a-tio-trifosfát} který je zpracován DNA-polymerázou, ale nikoli luci-ferázou. Rychlost pyrosekvencování je cca 1 odečtená báze/min a běžná délka stanovené sekvence je přibližně 100 bp. V současnosti jsou používány dvě rozdílné techniky pyrosekvencování: v roztoku a na pevné fázi využívající imobilizovanou DNA. Metoda je ve vývoji a je používána pro ověření sekvencí krátkých fragmentů DNA a identifikaci jedno-nukleotidových polymorfizmu v genomech. Zejména pyrosekvencování v roztoku umožňuje snadnou automatizaci a možnost paralelního zpracování velkého množství vzorků. SEKVENCOVÁNÍ POMOCÍ HYBRIDIZACE (SBH). Enzymová a chemická metoda sekvencování nebo pyrosekvencování patří mezi tzv. přímé metody stanovení sekvence DNA, ve kterých je pozice každé báze stanovena jednotlivě. Naproti tomu sekvencování pomocí hybridizace je nepřímá metoda, ve které je sekvence DNA sestavena na základě výsledku hybridizace oligonukieotidových sond se sekvencemi analyzované DNA. Velmi perspektivní a účinnou metodou je varianta SBH prováděná prostřednictvím technologie DNA-Čipů („DNA microarray"), jejímž klíčovým faktorem je miniaturizace společně s možností vizuální detekce hybridizujících molekul. Při SBH je fluorescenčně značený fragment analyzované DNA hybridizován k DNA--čipu obsahujícímu všechny kombinace oligonukleotidů s konstantní délkou (obr. 43). Výsledek hybridizace je odečten konfokálním mikroskopem a sekvence je odvozena dedukcí z hybridizujících pozicí. Pro sekvencování 1 Mb by bylo třeba vytvořit Čip obsahující 1,112 x io6 možných 20 -merů. V současné době však DNA-čipy dosahují hustoty pouze 500 000 polí na ploše 1,6 cm2. Každé z těchto polí obsahuje milióny fotolitograficky syntetizovaných molekul oligonukleotidů, jejichž délka může být až 25 bází. Takový Čip by byl vhodný např. pro stanovení sekvence klonované v BAC vektoru. Technologie DNA-čipů byla optimalizována zejména pro stanovení jednonukleotidových polymorfizmu v genomech, pro srovnávací sekvencování krátkých fragmentů DNA a pro analýzu exprese genů. Metoda SBH na DNA-Čipech by měla v budoucnu po dosažení miniaturizace a zvýšením citlivosti detekčních metod až na jedinou molekulu sondy umožnit rutinní sekvenční analýzu celých genomů v jednom hybridizačním experimentu. MINISEKVENCOVANI, Metoda minisekvencování je založená na prodloužení 3'-konce příměru o jediný značený nukleotid, který slouží jako terminátor, podobně jako u Sangerova sekvencování. Technologie je určená pro ověření jednonukleotidových polymorfizmu (SNP) v sekvencích a umožňuje spolehlivě odlišit jednotlivé alely genů. Primer se váže svým 3'-koncem v těsném sousedství polymorfhího místa. K prodloužení primeru DNA-polymerázou dojde pouze tehdy, jestliže značený nukleotid přítomný v reakci je komplementární k bázi v cílovém místě. Produkty prodloužených primerů jsou analyzovány elektroforetícky a vyznačují se odlišnou pohyblivostí. Automatizaci stanovení jednonukleotidových polymorfizmu umožňuje modifikace metody prováděná na DNA-čípech, která používá specificky fluorescenčně značené nukleotidy. Pro stanovení totožnosti báze existuje několik variant stanovení (APEX, AS-PE), které využívají prodloužení primeru o jeden nebo více nukleotidů před nebo po hybridizaci (obr. 44): • Při prodloužení imobilizováného primeru je specifický primer pro každý SNP, který genotypizujeme, vázaný na čipu. K čipu jsou přidány produkty mnohonásobné PCR, na 3-konci fluorescenčně značené ddNTP a DNA-polymeráza. Po prodloužení primem o jeden ddNTP je výsledek reakce vyhodnocen: pozice primem na čipu definuje, který SNP analyzujeme a fluorescence nukleotidu při dané vlnové délce určuje genotyp příslušného SNP. 70 STANOVENÍ SEKVENCE DNA (SEKVENCOVÁNÍ DNA) Obr. 43 Princip sek věncování pomocí hybridizace s použitím DNA-čipu • Při alelově specifickém prodloužení primeru jsou na čipu imobilizovány dva alelově-specifické příměry s 3'-koncovou bází komplementární k oběma možným variantám nukleotidů v každém SNP. Produkty mnohonásobné PCR jsou přepsány do mnoha kopií RNA RNA-polymerázou. Molekuly RNA hybridizuji k čipu a slouží jako templát pro prodloužení primeru katalýzované zpětnou transkriptázou. Během zpětné transkripce jsou do produktů začleněny fluorescenčně značené dNTP. U homozygotních genotypů je signál tvořen pouze jedním ze dvou alelově-specifických prodloužených primeru, kdežto u heterozygotních genotypů je signál tvořen oběma prodlouženými primery. STANOVENÍ SEKVENCE DNA (SEKVENCOVÁNÍ DNA) 71 • Cyklické prodloužení příměrů nesoucích specifickou přídatnou sekvenci adaptoru na 5'-konci je prováděno s denaturovanou DNA v roztoku za přítomnosti fluorescenčně značených ddNTP a DNA-polymerázy. DNA-čip obsahující sondy komplementární k přídat-ným sekvencím adaptorů je potom použit pro zachycení produktů reakce, při které došlo k prodlouženi primerů. ai i i i i i i i i i mlľ i i i i i i i i i i i i i PCR produkty + DNA-polymeráza 5'« 5« 5 « směs značených ddNTP hybrid izace a extenze J> -*> SNP, (AA) SNP2 (CG) SNP (CC) hyMdtz.- *w m m jed nonukleo lidová extenze A TA GC CG GC 51 V 51 5' 5 5 SNP, SNP, SNP- ff*in iiZ3m588SSiJJÍB88PBr AA CG CC RNA vzniklá transkripci jeden značený + zpétná transkriptáza dWTP a 3 neznačené C> 5 5 v v i nn-! -O %h»i O—,' • SNP, SNP2 SNP, Ä7 AA CG CC snp. SNP. zachycení na čipu II 9 9 ? 9 snp1 snp2 snp. U ti th^? 3' 3' 3' 3 3' 3 AA CG CC produkty prodloužení primeru v roztoku Obr. 44 Varianty minisekvencování prováděné na DNA-čipu VI. Amplifikace nukleových kyselin 1. Polymerázová řetězová reakce (PCR) I llllllll LLLLLLU lilii LH11 li 111 i 1111 l iiiiinmi denaturace DNA (94-96 *C) iihiiiiiimiiihiiiiiih JJXl I 1 1 !,i i 1 I I I I i I 1 I I I I I připojení primeru (30-65 °C) '""jilU1" IIIIIIIIIIII "'......tlili..........I I syntéza nových fetézcú (72 *C) rm3E ,fTT Li.lJLt.Hl Taq DNA-polymeráza IIIIIIIIIIII^ • dNTP _______ ______lilii I__Jfc Zavedení polymerázové řetězové reakce (PCR) v roce 1985 Kary B. Mullisem, znamenalo pro molekulární biologii stejný přínos jako objev restrikčních endonukleáz nebo zavedení sekvencování DNA, Výhodou PCR je zejména to, že umožňuje získat požadovanou a specifickou sekvenci genomové DNA bez jejího předchozího klonování ve vektorech. Princip PCR je založen na replikaci nukleových kyselin, která je základním molekulárním procesem všech živých organizmů. Podstatou PCR je cyklicky se opakující enzymová syntéza nových řetězců vybraných úseků dvouřetězcové DNA ve směru 5* —> 3' prostřednictvím DNA-polymerázy. Studovaný úsek nukleotidové sekvence je vymezen připojením dvou primerů, které se vážou na protilehlé řetězce DNA tak, že jejich 3'-konce směřují proti sobě. Po přidání DNA-polymerázy a nukleotidů pak probíhá syntéza nových vláken na obou matricových řetězcích protisměrně. K syntéze DNA se používají termostabitní polymerázy izolované z termo-filních mikroorganizmů, např. Taq DNA-polymeráza z Thermus aqttaticus odolávající teplotám, při nichž DNA denaturuje. To umožňuje, aby syntéza DNA probíhala opakovaně formou cyklů. PCR je proces při němž se v závislosti na teplotě reakční směsi pravidelně střídají tři kroky, během nichž probíhají tři odlišné děje s odlišnými nároky na teplotu (obr. 45): • denaturace dvouřetězcových molekul DNA (94 °C% • připojení primerů k odděleným řetězcům DNA (30-65 °C), • syntéza nových řetězců DNA prostřednictvím DNA-polymerázy (65-75 °C). denaturace DNA (94-96 "O t 111 r t r i r r i r r ti r i i i iiin i i tiiiiiiiinm...... ^llllillilll..... n m 11111 n 11111111111111 ^ připojeni primerů (30-65 *C) lllllllIlHllimiHTjTTTT "in.......n 11111111 ^ ^ ! T11 r 11111111T11 1T ITT I 111111111111111111 n111<11 | syntéza nových řetězců (72 'C) MMIII mi in I I I I I | I M niiiiiiiimiiiiiii 8 IIMMII LUXU.' ■■■■III I TJ IIII111! M denaturace DNA, připojeni primeru. syntéza DNA 25-35 cyklu L úsek DNA. který je mnohonásobné n 11 n i zmnožen rrrrrr Hllfa Obr. 45 Princip standardní polymerázové řetč-zové reakce (PCR) 74 AMPLIFIKACE NUKLEOVÝCH KYSELIN Číslo cyklu Počet syntetizovaných molekul produktu ] 0 2 0 3 2 4 4 5 S 6 16 7 32 8 64 9 128 10 256 11 512 12 1024 13 2048 14 4096 15 8192 16 16384 17 32768 18 65536 19 131072 20 262144 21 524288 22 1048576 23 2097152 24 4194304 25 8388608 26 16777216 27 33554432 28 67108864 29 134217728 30 268435456 31 536870912 32 1073741824 denaturace vzorku DNA pro oddělení jednofeíězců (94 X; 5 min) připojeni primerú ^na řetězce DNA , (30-65 X; 1 min) denaturace pro separaci řetězců DNA (94X;.30 s) 25-35 x syntéza nových řetězců DNA polymerázou C; 45 s- 2 min) (72 Obr. 46 Teplotní režim a doby trvání jednotlivých kroků při polymerázové řetězové reakci Tabulka 3 Teoretická amplifikace cílového fragmentu DNA při zvyšujícím se počtu cyklů Reakce se provádějí v zařízení nazývaném termocykler, v němž se teplota mění automaticky v naprogramovaných časových intervalech (obT. 46). Postupným opakováním tohoto procesu se exponenciálně (2n; n *= počet cyklů) vytváří až miliarda kopií vybraného úseku cílové molekuly (Tabulka 3). Jelikož výsledkem PCR je mnohonásobné zmnožení vybraného úseku DNA, lze ji označit za způsob klonování DNA. Přesnost a úspěšnost PCR při amplifikaci určitého genu nebo části sekvence genomo-vé DNA je závislá na pečlivém návrhu obou primerů, při němž je třeba přihlížet k celkové sekvenci studovaného genomu. Pro genom o velikosti 3 miliardy bp je teoreticky postačující sekvence primeru o délce 16 nukleotidů (4lů). Sekvence o této délce by měla být v genomu uvedené velikosti jedinečná a měla by se proto vázat specificky jen k jedinému místu. Ge-nomy organizmů však nemají náhodné sekvence a proto se primery navrhují zpravidla delší. Při návrhu primerů pro standardní PCR je proto třeba brát v úvahu několik důležitých pravidel, mezi něž patří: • délka zpravidla 18-25 nukleotidů, • obsah G+C 40 % až 60 %, • rovnoměrná distribuce oblastí bohatých na G/C a A/T páry, AMPLIFIKACE NUKLEOVÝCH KYSELIN 75 • teplota Tm primeru alespoň 50 °C, • podobná teplota Tm u obou primerů, • specifičnost primerů - na matricové DNA nesmí být nespecifická vazebná místa, • absence komplementárních sekvencí v příměrech, které by mohly vést k tvorbě duplexů, • absence vnitřních sekundárních struktur (vlásenek), • zařazení 1 až 2 zbytků G nebo C v sekvenci na 3'-koncích primerů pro zajištění přesné vazby na templát. Komerčně dostupné syntetizátory oligonukleotidů poskytují dostatečnou čistotu (> 98 %) a příměry běžných velikostí mohou být používány při PCR bez přečištění. Pro návrh primerů v analyzovaných oblastech sekvence DNA existuje řada počítačových programů, které umožňují zohlednit výše zmíněná pravidla. Přesné hodnoty teploty a dobu trvání jednotlivých kroků je třeba optimalizovat. Pro získání požadovaného produktu, specifičnosti a výtěžku je důležitá koncentrace jednotlivých složek reakční směsi. Kromě Taq DNA-polymerázy a primerů obsahuje reakční směs jako kofaktor horečnaté ionty Mg2+, které tvoří rozpustný komplex s jednotlivými 2'-deoxyribo-nukleosid-5'-trifosfáty (dNTP) rozpoznávaný DNA-polymerázou. Jelikož ionty Mg2+ intera-gují nejen s dNTP, ale i s primery, templátovou DNA, EDTA a dalšími chelatačními činidly, je třeba ve většině případů stanovit pro každou aplikaci optimální koncentraci iontů Mg empiricky. Příliš vysoká koncentrace některé ze složek reakce může vést k chybám a vzniku nespecifických produktů. Optimální počet cyklů je závislý na výchozí koncentraci templátové DNA a zpravidla se pohybuje v rozmezí od 25 do 35 cyklů. Příliš vysoký počet cyklů významně zvyšuje množství vznikajících nespecifických produktů PCR. Pro PCR je důležitá úplná počáteční denaturace templářů a obvykle k tomuto účelu postačuje zahřátí směsi na 94—97 °C po dobu 2-5 min. V případě, že dojde pouze k částečné denaturaci, molekuly DNA velice rychle re^turují, což vede k nespecifické vazbě primerů („self-priming") a falešným výsledkům. Protože Taq DNA-polymeráza má při 95 °C poločas stability 40 min, volí se pro následnou denaturaci amplikonů během reakce doba pouze 15—45 s. Podmínky pro hybridízaci primerů závisí na zastoupení bází, délce oligonukleotidů a hodnotě Tm produktu. Teplota pro připojení (hybridízaci) primerů (Ta) se stanovuje podle vztahu: T = 0,3 xT%umer +0,7x7 Produkt -25, a m avšak obecně užívaným pravidlem pro stanovení Ta je snížení teploty Tm o 5 °C. Teplota Ta se obvykle pohybuje v rozmezí 55 až 68 °C po dobu 30-60 s, doporučuje se však provést její optimalizaci. Syntéza DNA probíhá zpravidla při 68-72 °C. Taq DNA--polymeráza při této teplotě syntetizuje DNA rychlostí cca 60 bází/s. Pro PCR jsou často používány jako zdroj DNA různé biologické materiály, např. hrubé extrakty z krve, tělní tekutiny, kultury mikroorganizmů, buňky z tkáňových kultur, atd. V důsledku vysoké citlivostí PCR je vhodné provést hrubou extrakci vzorků za použití kombinace zahřátí a různých detergentů nebo enzymatického štěpení. U těchto materiálů by měla být věnována pozornost možným nečistotám, které mohou inhibovat Taq DNA-polymerázu. Mezi ně patří komponenty červených krvinek, některé detergenty (SDS), EDTA, vysoké koncentrace solí a negativně působí také vysoká koncentrace DNA. Pro PCR je třeba pouze malé množství templátové DNA, proto mohou být tyto nečistoty ve většině případů odstraněny dostatečným naředěním vzorku. Výsledným produktem PCR jsou amplikony - úseky DNA definované délky o velikosti obvykle desítky až tisíce bp, analogické restrikčním fragmentům, jejichž přítomnost 76 AMPLIFIKACE NUKLEOVÝCH KYSELIN se v reakční směsi prokazuje stanovením jejích velikosti elektroforézou v agarózovém nebo polyakryl amidové m gelu nebo kvantitativním měřením množství produktu v reálném čase (str. 79). Podrobná analýza polymorfizmu sekvencí v produktech PCR může být dále provedena některou z následujících metod: • elektroforetickou separací produktů za specifických podmínek pro detekci sekvenčních polymorfizmu denaturaČní gradientovou gelovou elektroforézou (DGGE, str. 16), • analýzou polymorfizmu konformace j ednořetězcových foTem (SSCP, str, 57), • liybridizací s neradioaktivně značenou sondou k o mp lem entá mí k Části sekvence amplifi-kováného úseku a detekcí enzymoimunoanalýzou v mikrotitraČni destičce (PCR--EIA/ELISA); hybridizační sonda může být následně amplifikována (PCR-OLA, str. 108), • imobilizací PCR-produktů na membráně a tečkovou hybridizací se značenými alelovč-specifickýmí oligonukleotidy (A SO) nebo zpěmou tečkovou hybridizací s různými ASO imobilizovanými na membráně, • hybridizací na DNA-čipech, str. 69, • stanovením sekvence DNA, str. 59. FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ PCR. PCR je plně automatizovaný proces, který využívá termostabilní DNA-polymerázu. Avšak i termostabílní DNA-polymeráza katalyzuje prodlužováni primeru při laboratorní teplotě, což může být příčinou chyb a vzniku nespecifických produktů, zejména při nízkých koncentracích templátové DNA. Specifičnost, citlivost a výtěžek reakce významně ovlivňuje modifikace PCR označovaná „hot-start" PCR, Při PCR s horkým startem jsou určité složky reakční směsi (viz ní Že) odděleny od ostatních, dokud teplota ve zkumavce nepřekročí optimální teplotu pro připojení primeru (obvykle 55 až 65 °C). DNA-polymeráza jev této nekompletní reakční směsi nefunkční a proto nedochází k prodlužování nespecificky navázaných primeru dokud není dosažena teplota Ta. Separace důležitých složek reakční směsi je dosaženo některým z následujících způsobů: • Některé složky reakce jako DNA-polymeráza nebo ionty Mg2+ jsou v původní reakční směsi vynechány a přidány manuálně po dosažení teploty > 70 °C. Nevýhodou je možnost kontaminace a možná ztráta Teprodukovatelnosti, • Reakční komponenty jsou rozděleny do dvou směsí, které jsou odděleny fyzikální bariérou (vosková přepážka, nebo voskové korálky obsahující MgCl2). Během počáteční dena-turace vosk roztaje a umožní smíchání složek reakce. • Přídavek teplotně nestabilních protilátek specifických pro DNA-polymerázu umožni její počáteční i n aktivaci. • Chemická modifikace polymerázy teplotně nestabilními látkami, které se vážou na určité aminokyselinové zbytky, způsobí inaktivaci enzymu při laboratorní teplotě. K aktivaci enzymu dochází při počáteční denaturaci DNA. Vysoká citlivost a specifita PCR způsobuje, že kontaminace i jedinou molekulou exogénni nebo neznámé DNA postačuje pro získání falešného signálu, Pro minimalizaci falešných pozitivních výsledků byly doporučeny určité standardní postupy zahrnující používání auto k lávo váných roztoků, fyzikální separaci používaných PCR-reagencií od templátové DNA a produktů PCR, přípravu reagencií i vzorků do alikvotních Částí, používání UV-světla k odstranění exogénni ch nukleových kyselin na pracovní ploše, používání jednorázových rukavic, přidávání DNA do reakce jako poslední složky a pečlivou volbu pozitivních, negativních a vnitřních kontrol. Vyloučení kontaminace je důležité zejména u nízko koptových templátů DNA nebo degradovaných vzorků, kde je potřeba použít vysokého počtu amplifi-kačních cyklů, aby bylo dosaženo požadovaného množství produktu. V těchto případech může zbytkové množství exogénni DNA konkurovat templátové DNA, potlačit amplifikaČni AMPLIFIKACE NUKLEOVÝCH KYSELIN 77 proces a způsobit tak falešný výsledek. V případč pochybnosti je nej lepším přístupem opakování experimentu s pečlivým dodržováním dílčích postupů a kontrol. Jako zdroj kontaminace DNA je nejčastěji uváděn: • přenos kontaminující DNA z dřivé amplifíkovaných produktů PCR, • vzájemná kontaminace zdrojových materiálů, • kontaminace vektorem z rekombinantního klonu, který obsahuje cílovou sekvenci. Z těchto tři příčin kontaminace jsou nej významnější přenesené sekvence dříve získaných amplikonů, protože jsou z cílových sekvencí přítomny v laboratoři v relativně největ-ším množství. K prevenci amplifikace kontaminující DNA je v reakční směsi rutinné používán 2'-deoxyuridm-5'-trifosfát (dUTP) namísto 2,-deoxyryrnidin-5,-rrifosfátu (dTTP). Následným působením uracil-N-glykosylázy na reakční směs před zahájením amplifikace dojde k odstranění dU z každého možného produktu PCR způsobujícího kontaminaci, přičemž templátová DNA a dUTP zůstanou neovlivněny. Odstraněním dU dojde k vytvoření míst bez bázi, která jsou teplotně labilni a řetězce jsou během počáteční denaturace degradovány (obr. 47). ■ i i i A T A G T T f Ť t j // ampllfiiovaná nukleová kyselina PCR 1 ♦ dATP, dGTR dCTP, dUTP Ä V A, 9 y" produkt PCR C G A U A G U o 9 V * u ? Ý hybrid izace, klonování ____L nebo sekvencovánl---■—■---- ■4- nástedujlci PCR -i-i i i i i G A U A G U C G A U A G U uiaol-Nglykosyiaza i i G C * A * B A odStepenl uracilových zbylkú JL_i_' ■ _-L_ ^ 1 denaturace (95 *C) rozstépem ŕetézcú CGA ■g-g-h-fr-i S Ý < nedochází k ampiifikaa Obr. 47 Využití uraciťN-glykosylázy při ochraně před kontaminaci při polymerázové fetézové reakcí Alternativně lze amplifikační produkty PCR inaktivovat fotochemicky deriváty pso-ralenu nebo isopsoralenu, což jsou furokumarínové sloučeniny interkalující se mezi páry bází DNA, Pokud jsou tyto látky excitovány UV-světlem o vlnové délce 320-400 nm, kova-lentné se vážou na nukleové kyseliny a tvoří s pyrimidinovými bázemi cyklobutanové aduk-ty, které blokuji reakci s DNA-polymerázou (obr. 48). 78 AMPLIFIKACE NUKLEOVÝCH KYSELIN Obr. 48 Tvorba cyklobutanových aduktů s pyrimidinovými bázemi po excitaci UV-svčtletn Inaktivační látky se přidávají do reakce před zahájením amplifikace. Po proběhnutí PCR, ještě před otevřením zkumavky a vystavením amplikonu atmosféře, je provedeno ozáření a aktivace fotochemicky reaktivní látky. Účinnost fotochemické inaktivace však nemusí být stoprocentní a závisí na koncentraci inaktivačního činidla, obsahu C+C v produktu a přítomnosti různých inhibitorů v reakční směsi. BEZCHYBNOST SYNTÉZY A OMEZENÍ DÉLKY PRODUKTU. Podobně jako jiné biochemické procesy ani replikace neprobíhá bezchybně a Taq DNA-polymeráza příležitostně zařazuje do nově syntetizovaných řetězců chybné (nekomplementární) nukleotidy. Z analýzy sekvencí klonovaných PCR produktů vyplývá, že frekvence chyb pro Taq DNA--polymerázu je 1 na 4 000 až 5 000 bp. Frekvence těchto chyb in vitro je značně závislá na vyváženosti jednotlivých složek reakce, zejména na koncentraci volných iontů Mg2+, změnách pH reakčního pufru a vyváženosti koncentrace čtyřech dNTP. Buňka má schopnost chybně začleněné báze odstraňovat opravnými mechanizmy, avšak Taq DNA-polymeráze 3-exonukleázová aktivita chybí a in korporace nesprávné báze zpravidla vede k terminaci řetězce a současně i syntézy DNA. Při použití PCR v molekulární diagnostice nejsou chybně začleněné báze problémem, neboť vznik molekul DNA se stejnou chybou je málo pravděpodobný a molekuly s chybně začleněnou bází tvoří jen zlomek z celkového produktu. Chybné začleňování bází je však důležité, jestliže jsou PCR produkty klonovány, neboť každý klon je odvozen z jediné molekuly DNA. Pokud DNA obsahuje jednu nebo více chybně začleněných bází (tj. mutací), budou je mít všechny DNA v potomstvu a navíc tyto mutace mohou následně způsobit substituci aminokyselin při expresi prováděné in vitro. Tento problém lze snížit použitím většího množství templátových molekul DNA při zahájení reakce. Pak je potřeba menšího počtu cyklů a dojde k syntéze menšího množství DNA. V současné době byly zavedeny do praktického použití termostabilní DNA-polymerázy disponující 3'-exonukleázovou aktivitou, které byly izolovány z různých druhů pyrokoků, např. DNA-polymeráza Pfu z Pyrococcus furiosus nebo DNA-polymeráza Pwo z Pyrococcus woesei. Frekvence chyb je u těchto po-lymeráz 2-6krát nižší než u Taq DNA-polymerázy, ale jejich rutinní použití je obtížné, protože jejich 3f-exonukleázová aktivita často způsobuje degradaci jednořetězcových primerů. DNA-polymerázy s 3'-exonukleázovou aktivitou však našly úspěšné uplatnění v kombinaci s Taq DNA-polymerázou v modifikacích PCR určené pro ampliíikaci dlouhých úseků DNA. Při standardních podmínkách PCR bývají obvykle amplifíkovány cílové úseky o velikosti do 3^4 kb. Lze získat rovněž amplikony delší než 5 kb, ale s nižším molárním množstvím. Toto omezení délky produktů PCR je důsledkem chybně začleněných nukleotidů, které značně snižují efektivitu amplifikace dlouhých úseků. PTŮlom v syntéze dlouhých úseků přineslo použití kombinace dvou termostabilních DNA-polymeráz, z nichž jedna má 3-exonukleázovou aktivitu. Princip reakce je takový, že Taq DNA-polymeráza zajišťuje syntézu části produktu PCR v těsném napojení na opravnou 3'-exonukleázovou aktivitu AMPLIFIKACE NUKLEOVÝCH KYSELIN 79 druhé DNA-polymerázy. Jakmile je chybné začleněný nukleotid opraven, Taq DNA-poly-meráza dokončí syntézu dlouhého PCR-produktu. Z empirických studií vyplývá, že k tomuto účelu stačí pouze stopové množství DNA-polymerázy s 3'-exonukleázovou aktivitou, např. pro syntézu úseků delších než 20 kb lze použít přibližně 1 % DNA-polymerázy Pwo z celkového množství Taq DNA-polymerázy. Namísto Taq DNA-polymerázy je pro tento účel také doporučována jiná DNA-polymeráza označená Tth izolovaná z Thermus thermo-phillus. Důležitým faktorem při syntéze dlouhých úseků je izolace kvalitního templátu a jeho ochrana proti degradaci během střídání teplot při PCR. K tomuto účelu a také pro redukci nespecifické vazby primeru na templát mohou být použity přídatné látky, jejichž vliv se obvykle určuje experimentálně. Mezi tyto látky patří dimetylsulfoxid (DMSO), betain, glyce-rol, spermidín nebo protein 32 fága T4. KVANTITATIVNÍ PCR (QPCR). Skutečnost, že při PCR dochází k exponenciální amplifikaci cílové sekvence nukleové kyseliny by mohla naznačovat, že se PCR nemůže stát kvantitativní metodou. Avšak již dříve byly popsány metody kvantifikace DNA pomocí mnohonásobné PCR (str. 85) s kvantitativně kompetitivním stanovením (QC-PCR). Při tomto postupu jsou amplífikována známá množství kompetitivního templátu spolu se stejnými množstvími cílové DNA. Kompetitivni templát obsahuje stejné sekvence pro vazbu primerů jako cílová DNA, ale má rozdílnou velikost. Okamžik, ve kterém jsou intenzity PCR-produktů odvozených z cílové DNA a kompetitivni DNA ekvivalentní, je potom použit ke stanovení množství cílové sekvence v původním vzorku, V současné době se používá varianta PCR umožňující přímou kvantifikaci PCR--produktu v průběhu reakce („real-time PCR"). Kvantifikace množství molekul nukleových kyselin je důležitá při detailním studiu genové exprese nebo diagnostice některých patogenů. QPCR má široké využití také v klinické diagnostice pro genotypizaČní analýzu bodových mutací, delecí nebo chromozómových aberaci. Kvantifikace amplikonu při QPCR v reálném Čase se provádí prostřednictvím detekce a kvantifikace fluorescenčního signálu ve speciálním zařízeni, které kromě cyklického střídání teplot umožňuje detekci fluorescence a monitorováni postupu PCR v reálném čase bez nutností detekovat produkty PCR elektrofore-ticky (viz též str. 124). Při provádění QPCR v reálném Čase je nutné kromě faktorů ovlivňujících standardní PCR optimalizovat také kinetiku reakce. Pro kvantitativní detekci produktu v průběhu PCR existují tři obecné metody založené na použití: • interkalačniho barviva vázajícího se na DNA, • fluorescenčně značených sond vázajících se na střední část amplifikovaného produktu, • fluorescenčně značených primerů. Pro značení primerů a hybrid i začni c h sond se používají specifické molekuly íluoro-forů, které emitují světlo určité vlnové délky po předchozí absorpci světla odlišné vlnové délky. Emitovaná vlnová délka světla je vždy vyšší než absorbovaná. Dvojitě fluorescenčně značené sondy obsahují kromě fluoroforu také zhášeč, což je molekula, která přijímá energii z fluoroforu ve formě světla a způsobuje její rozptýlení buď ve formě světla s vyšší vlnovou délkou nebo tepla. K dosažení optimálního zhášení je třeba, aby se absorbční spektrum zhášeče překrývalo s emisním spektrem fluoroforu, V současné době existuje mnoho flurofo-rů určených pro jednobarevné nebo vícebarevné mnohonásobné detekce polymorfních sekvencí (obr. 49). 80 AMPL1F1KACE NUKLEOVÝCH KYSELIN Obr. 49 Jedna z nejčastěji používaných dvojic fluorofbrů při metodách FRET, donorový fluorofor FAM (6'karboxyťluorescein) a akcepiorový fluorofor TAMRA (5-karboxytetrametyl-rodamin) Detekce produktů QPCR se může provádět celou řadou technologií (obr. 50). • Pro kvantifikaci ampl ikonu se běžně používají fluorescenční kyaninová barviva SYBR® Green, která fluoreskují po vazbě na menší žlábek dsDNA. Fluorescence SYBR green I je po vazbě na DNA až 1 000* vyšší a fluorescenční signál se zvyšuje se vzrůstajícím množstvím PCR-produktu. Signál se měří na konci elongace nebo kontinuálně. Je zřejmé, že barviva, která se vážou na DNA nemohou být použita u mnohonásobných reakcí a jejich hlavním omezením je nemožnost odlišení nespecifických produktů. Nespecifické signály tvořené dímery příměrů mohou být zhášeny při použití příměrů značených specifickými fluorofory. • Sondy TaqMan™ jsou oligonukieotidy delší než příměry s hodnotou Tm vyšší asi o 10 ''C s fluorescenční značkou na 5*-konci a zhášečem na 3'-konci. Sonda se váže na vnitřní část amplifikované sekvence a pokud vytváří homoduplex, je rozložena 5' exo-nukleázovou aktivitou Taq DNA-polymerázy. To způsobí ukončení zhášení a emisi fluorescence. • Dvojice fluorescenčně značených sond využívající přenos energie fluorescenční rezonancí (FRET), což je excitovaný stav interakce dvou fluoroforů závislý na vzdálenosti, ve kterém je emise energie z donorového fluoroforů na 3'-konci první sondy spojená s excitací akceptorového fluoroforů na S'-konci druhé sondy vázající se na sousedící sekvenci. Přenos energie mezi ligandy se může uskutečnit na vzdálenost 10-100 Á (1-5 nukleotidů), přičemž citlivost FRET může detekovat změny vzdáleností 1-2 A na základě změny intenzity fluorescence. AMPLIITK A('l: NUKLHOVÝni KYSĽLIN Hl A) DENATURACE PRODLOUŽENÍ PRIMERU pnmer DENATURACE pnmer C) hybridizační ŕ~VyO sonda sond; TaqMan" DENATURACE HYBRIDI2ACE _ PRIMERU A SONDY ^ PRODLOUŽENÍ PRIMERU A DEGRADACE SONDY hu /WV sonda 2 matncova DNA I mM i DENATURACE motettuiarnl maják matricová DNA. HYBRIDI2ACE PRIMERU A SOND ^ PRODLOUŽENÍ Třrr^ PRIMERU •S HYBRIDIZACE PRIMERU A SONDY PRODLOUŽENÍ PRIMERU riTi-»»- prime* AmpMuar primer 2 PCR F'C F? SPRIMERY S PRIMERY 1 A 2 AMPLIFLUOR f) DENATURACE matncové DNA HYBRIDIZACE PRIMERU PRODLOUŽENÍ PRIMERU pomer LUX L G) DENATURACE HYBRIDIZACE PRODLOUŽENI y. PRIMERU ^ PRIMERU w * ^ matnccvá tq pnmer 1 DNA jíž primer Scorpton DENATURACE t»> A PRESKUPENÍ JŕV*^ Obr. 50 Technologie používané pro detekcí produktů při kvantitativní PCR. A) Fluorescenční barvivo vázající se na DNA. B) Technologie TaqMan. C) FRET mezi fluorofory nesenými dvěma sondami. D) Molekulární majáky. E) Technologie prímerů AmpliFluor. F) Technologie přímeni LUX. G) BifunkČní molekuly Scorpion 82 AMPLIFIKACE NUKLEOVÝCH KYSELIN * Sondy označené jako molekulární majáky (MB) jsou olígonukleotídy vytvářející sekundární strukturu vlásenky určené pro detekci přítomnosti nukleové kyseliny v roztoku. Obsahují vnitřnč zhášený fluorofor, jehož fluorescence je obnovena po vazbě na cílovou sekvenci. Smyčka má komplementární sekvenci k cílové molekule a krátká vlásenka tvořená obrácenou repeticí, která není homologická s cilovou molekulou, udržuje v tésné blízkosti na koncích připojený fluorofor a zhášeč. Podstatou detekce je stabilnejší vazba MB k citové sekvenci nukleové kyseliny než volná forma MB, Po hybridizaci sondy dojde k ukončení zhášení a emisi fluorescence, • Bi-funkční molekuly Scorpions® jsou olígonukleotídy obsahující PCR-primer kovalent-ně vázaný k hybridizační sondč. Molekula obsahuje na 5'-konci fluorofor, který interagu-je se zhášečem vázaným na střední část téhož oligonukleotidu (monomolekulární „škorpión") nebo 3'-konec druhého komplemetárniho oligonukleotidu (bimolekulámi „škorpión"). Po dokončení cyklu PCR dojde k intramolekulárnímu přeskupení „škorpió-nu** v důsledku hybridizace sondy k cílové sekvenci. Fluorofor je tím oddálen od zhášeČe, což vede k emisi svetelného signálu. • Technologie univerzálních primerů AmpliFluor™ je detekční systém založený na inkor-poraci fluorescenčné značeného primeru s vlásenkovou smyčkou do produktu PCR, Printer je navržen tak, aby fluorescenční signál byl tvořen pouze tehdy, je-li porušena sekundární struktura primem během syntézy druhého řetězce PCR-produktu. Za těchto podmínek dojde k oddělení fíuoroforu na 5'-konci primeru od zhášeče vázaného ve střední části primeru, AmpliFluor-pnmery jsou univerzální, pracují spolu s jinými PCR příměry a rozpoznávají sekvence modifikovaných konců vytvořených prostřednictvím sekvenčně specifického primeru obsahujícího dodatečnou adaptorovou sekvenci. * Technologie LUX využívá dva primery, z nichž pouze jeden je fluorescenčně značený. Zhášení primeru je zajištěno sekundární strukturou vlásenky a přítomností páru dG-dC nebo dC-dG na 3'-konci primeru, který specificky detekuje polymorfhi sekvenci. K emisi fluorescence dojde po prodloužení primeru. Primery se snadno navrhují a mohou být značeny různými fluorescenčními značkami umožňujícími mnohonásobné QPCR. PCR JAKO DETEKČNÍ SYSTÉM. PCR je významným nástrojem pro detekci odchylek v sekvencích nukleových kyselin. Znalost povahy mutací je důležitá především pro správnou diagnostiku a terapii. V literatuře bylo popsáno mnoho technik pro odlišeni standardních a lei od mutantních, ale to je pouze malá část širokého potenciálu PCR. PCR je neocenitelným nástrojem pro celou řadu analýz prováděných v základním nebo aplikovaném výzkumu a v praxi (tabulka 4). V další části uvádíme několik příkladů širokého použiti PCR v klinické diagnostice. PCR se např. používá k monitorování terapie rakoviny. Možnost detekce genetických změn v rakovinných buňkách je cenným prostředkem ke sledování přítomnosti maligních buněk u pacientů s nádorovým onemocněním. Léčba cytostatickým léčivem nebo zářením se může ukončil jakmile je rakovinná tkáň zničena, a naopak se může opět zahájit v případě opakovaného výskytu rakoviny. Některé formy rakoviny vznikají jako výsledek chromozómových Iranslokací. Např. u folikulárního lymfomu je popsána translokace mezi chromozomy 14 a 18. Tyto rakovinné buňky mohou být detekovány konvenční Southemovou hybridizaci, pokud frekvence jejich výskytu v buněčné populaci dosahuje alespoň I %. Citlivost technik PCR je podstatně vyšší a umožňují detekci jediné buňky v populaci 106 normálních buněk. Pro detekci se v tomlo případě vyberou dva PCR-primery ze sekvencí sousedících s místy zlomu na každém chromozomu. K ampliftkaci dojde pouze v buňkách, kde proběhla translokace, a vznikne fragment konstantní délky (obr. 51). Podobná strategie byla použita k detekci leukémií. Jako výchozí materiál se zde používala mRNA. Výhoda použití mRNA AMPLIFIKACE NUKLEOVÝCH KYSELIN spočívá v tom, že tato molekula již představuje amplifikační produkt daného genu genomové DNA. přiměn 1S^1 odměr 2 14(132 nopilpojujs se k tomuto ch mmoíůmu i—»-i n e p hpoj uje se k tomuto chromozomu jeden PCR produkt, variabilní velikost v každém cyklu PCR fragmenty s definovanou velikosti a exponenciálne se zvyšujícím poetem v každém cyklu jeden PCR produkt, variabilní velikost v každém cyklu Obr. 51 Detekce translokace mezi chromozomy 14a 18 u foli ku lamího lymfomu pomocí pcr Tabulka 4 Využiti PCR a jejích modifikací vc výzkumu a praxi Základní výzkum Aplikovaný genetický výzkum Klinické disciplíny Ostatní • izolace genů nebo jejich částí ■ sekvencování DNA • mutageneza in vitro, modifikace konců DNA • analýza klonů z genových knihoven • příprava značených sond • prenatální diagnostika dědičných chorob • detekce mutací v genech • studium polymorfizmu genů • populační genetika • detekce patogenních bakterií, virů, prvoků a hub • typizace patogenních mikroorganizmů • identifikace onkoge-nú • typizace nádorů • stanovení pohlaví • archeologie • soudnictví • kriminalistika PCR se používá k detekcí bakteriálních a virových infekcí. Konvenční diagnostické metody jsou založeny na schopnosti kultivovat patogenní organizmy v kultuře nebo detekovat jejich přítomnost u pacienta prostřednictvím protilátek. Kultivační techniky jsou často náročné a vyžadují až několik týdnů (např. u mykobakterií) a navíc některé imunologické metody bývají málo citlivé. Naproti tomu detekce patogenů prostřednictvím PCR, která využívá amphfikaci konzervativní genomové sekvence může detekovat již 10 bakterií mezi 106 eukaryotických buněk. Amplifikovaný fragment je pak hybridizován se sondami vysoce specifickými pro daný druh mykobakterte. Spolehlivá a citlivá diagnostika je zvláště důležitá při detekci virů, např. viru HIV (kapitola IX). 84 AMPL1F1KACE NUKLEOVÝCH KYSELIN odebrání oocytü po ovulaci opíodnění in vitro i' kultivace do 6.-10, buněčného děíení odebráni 1 buňky z embrya ö n no n e 1 2 3 4 5 6 amplifikace Y-specifické sekvence Cf* 1 2 3^4 5 6 B samčí specificky frag mení elektroforéza PCR produktů Významnou oblastí, která často využívá PCR, je prenatální diagnostika. Příkladem je použití PCR ke stanovení pohlaví u prenatálních buněk. Pro choroby vázané na X-chromozom, které postihují pouze samčí jedince, je prvním krokem stanovení pohlaví. To je možné proto, že samci nesou pouze jeden Y-chromozom, obsahující jedinečné sekvence. Některé repetttivní sekvence jako např. 3,5 kb sekvence DYZ1 se vyskytují v mnoha (až 5 000) kopiích. Takové sekvence [ze ampíífikovat a získaný PCR-produkt je specifický pro samčí buňky. Při oplození in vitro se mikromani-pulátorem odebere jedna buňka z rané zygoty, ze které se izoluje DNA a ta se podrobí ampliťikaci pomocí specifických primeru (obr. 52). Přítomnosti Y-specifické h o amplikonu se pak využívá v genetickém poradenství. Obr. 52 Stanovení pohlaví u prenatálních buněk pomocí PCR AMPLIFIKACE NUKLEOVÝCH KYSELIN 85 2. Varianty a modifikace PCR Polymerázová řetězová reakce je používána v široké škále variant, které jsou upraveny podle toho, zdaje potřeba amplifikovat templáty s nízkým počtem kopií, detekovat sekvenční polymorfizmy, provádět molekulární identifikaci nebo typizaci organizmů nebo modifikovat sekvence nukleových kyselin. Tyto varianty se navzájem liší použitím dalších enzymatických reakci kromě amplifíkace Taq DNA-polymerázou, použitím specifických sekvencí primerů, přísností podmínek pro amplifíkaci a způsoby detekce produktů PCR. STANOVENÍ POLYMORFIZMU DÉLKY RESTRIKČNÍCH FRAGMENTŮ U PRODUKTŮ PCR (PCR-RFLP). PCR-RFLP je modifikace standardní PCR používaná pro typizaci cílové sekvence, obvykle určitého genu, obsahujícího sekvenční polymorfizmus. V závislosti na volbě primerů může být provedena analýza jakéhokoliv genu. Tato sekvence o délce až 5 kb se amplifikuje za přísných podmínek pomocí primerů připojujících se ke koncovým konzervovaným oblastem. Výsledkem amplifikace jsou produkty PCR o stejné délce, které se detekují elcktroforeticky. Ampíifíkované produkty jsou štěpeny reštrikční endonukleázou a poté opět analyzovány elektroforézou v agarózovém nebo polyakry(amidovém gelu. Vzorky jsou typizovány reštrikční mi spektry fragmentů amplífí kované DNA (svých vzorů RFLP). Jako přiklad využití PCR-RFLP může být uvedena prenatální diagnostika hemofílie A u rodiny, která nese určitý typ mutace. Úsek genu pro koagulaČní faktor Vlil (Xp28) o délce 142 bp obsahující sekvenční polymorfizmus v restrikčním místě Bell v intronu 18 je amplifi-kován prostřednictvím PCR. Standardní alela tohoto genu obsahuje rozpoznávací sekvenci reštrikční ho místa Bell a amplikon je proto Štěpen tímto enzymem na fragmenty o velikosti 99 bp a 43 bp. U mutovaného genu reštrikční místo chybí a amplífikovaný fragment DNA proto štěpení nepodléhá. Heterozygotní matka - přenašečka má jednu kopii normálního genu (poskytujícího fragmenty (J9 b p a 43 bp) a jednu kopii mutantního genu (142 bp). Jelikož se jedná o X-chromozómovou recesivnč dědičnou chorobu, postiženi potom bývají synové, kteří zdědí X-chromozom s mutantním genem (neštěpený fragment 142 bp). Pro účely molekulární typizace může být jako příklad uvedena analýza RFLP u pro-karyotických genů pro 16S rRNA (obr, 53). Celý gen o velikosti asi 1 600 bp je amplifiko-ván pomocí univerzálních primerů komplementárních k sekvencím na koncích genu pro 16S rRNA. S použitím vhodné reštrikční endonukleázy získáme spektrum několika (až 8) fragmentů, které se liší počtem a velikostí podle bakteriálního druhu nebo kmene. MNOHONÁSOBNÁ („MULTIPLEX") PCR. Mnohonásobná PCR je taková varianta PCR, kdy je do reakční směsi přidáno několik párů primerů rozpoznávajících několik rozdílných cílových sekvencí, což umožňuje detekci několika genů současně v jedné reakční směsi. Reakční podmínky pro současnou amplifíkaci všech produktů je nutno empiricky, krok za krokem optimalizovat. Hlavní výhodou této varianty jsou nižší cenové náklady než při samostatných ampliftkacich a proto se používá pro vyhledávání změn na dlouhých úsecích DNA, testování vzájemně nesouvisejících oblastí na DNA a zejména pro amplifíkaci vnitřních kontrol současně se vzorky. Příkladem využití mnohonásobné PCR je diagnóza Duchennovy muskulůrní dystrofie kdy se provádí detekce deletovaných exonů. V dystrofinovém genu (Xp2l) o délce 2 400 kbp je navrženo celkem 9 úseků určených k amplifíkaci. Tyto úseky představují Částí genu, které bývají nejčastěji postiženy delecí. Vzorky DNA z pacienta jsou amplifikovány za současného použití sady devíti primerů v jedné reakci a produkty jsou elcktroforeticky separovány (obr. 54). 86 AMPL1F1KACE NUKLEOVÝCH KYSELIN Obr. 53 Typizace genu pro 16S rRNA pomocí metody PCR-RFLP AMPLIFIKACE NUKLEOVÝCH KYSELIN 87 -- gen pro dystrofin (-2400 kbp) s'n// i LIL izolace DNA přidáni sad primerů PCR amplifikace elektroforéza a barveni gelu \ oblasti amplifikované PCR hmotnostní blank standard kontrola (bez deiece) pacienti Obr. 54 Diagnóza Dnchennovy muskulámí dystrofie pomocí mnohonásobné PCR ODSTUPŇOVANÁ PCR NEBOLI PCR VYUŽÍVAJÍCÍ VNĚJŠÍCH A VNITŘNÍCH PRIMERŮ (angl. NESTED PCR). PCR využívající vnějších a vnitřních primerů je v porovnání se standardní PCR vysoce citlivá metoda, která umožňuje detekovat i jedinou molekulu templátové DNA. Při typickém protokolu se amplifikace provádí ve dvou krocích. První amplifikační krok zahrnuje 15-30 cyklů s jedním párem tzv. vnějších primerů. V tomto kroku vzniká produkt, který je převeden do nové zkumavky pro druhý amplifikační krok pomocí páru tzv. vnitřních primerů, které jsou specifické pro vnitřní část sekvence amplifikované s párem vnějších primerů. Druhý amplifikační krok zahrnuje dalších 15-30 cyklů a po jeho dokončeni se produkt detekuje elektroforézou. Přenos amplifikačních produktů z první reakce do druhé umožňuje naředění inhibitorů, které mohly být přítomny v původním vzorku, ale přináší s sebou i možnost kontaminace. Pro odstupňovanou PCR byly popsány i protokoly zahrnující různé přístupy pro provedení reakce v jedné zkumavce. Obsah prvního amplifikačního kroku může být oddělen od obsahu druhého amplifikačního kroku silnou přepážkou z rninerálního oleje; po první ampli-ftkaci jsou reakční komponenty smíchány mikrocentrifugací a obsah je amplifikován znovu. Častěji se však navrhují páry vnějších a vnitřních primerů, které se podstatně liší teplotou Tm. První amplifikace s párem vnějších primerů se provádí při málo přísných podmínkách (nízká teplota pro hybridizaci primerů) s 10-15 cykly. Jejím výsledkem je směs produktů jak vnitřních a vnějších primerů, tak jejich kombinace. Následuje druhotná amplifikace zahrnující 15-30 cyklů při přísných podmínkách (optimální teplota pro hybridizaci příměru) s vnitrními primery, jejichž konce jsou často bohaté na báze G+C a tak upřednostňují amplifikaci vnitřního produktu, který je detekován elektroforézou. 88 AMPLIFÍKACE NUKLEOVÝCH KYSELIN PCR KOLONIÍ. PCR je vhodná pro přípravu DNA z klonovaných inzertů v plazmi-dových nebo fágových vektorech, případně skrínink genových knihoven a stanovení velikosti a orientace inzertu, Pro tuto variantu PCR jsou potřebné univerzální primery komplementární k vektorovým sekvencím na obou stranách klonovacího místa. Během PCR je amp li fíková n jakýkoliv inzert bez ohledu na jeho sekvenci (obr. 55). Protokol metody zahrnuje přípravu reakční směsí obsahující všechny potřebné složky, její rozděleni do PCR-zkumavek, následné přenesení Části bakteriální nebo kvasinkové kolonie párátkem do reakčni směsi a roztřepání buněk. Zbytek bakteriální kolonie se uchová pro připadnou izolaci vektoru. Duňky lyžují během počátečního denaturaČního cyklu. Amplifikace začíná v prvním cyklu s nižší teplotou pro připojení příměru (např. 45 °C) a pokračuje jejím postupným zvyšováním o 1 až 2 °C v následujících cyklech až na optimální teplotu. ii ii klonované DUA s vyuíitfm primerů pro vefrtorové sekvence _^_____,._.-—- Obr, 55 Skrínink genové knihovny metodou PCR kolonii OBRÁCENÁ NEBOLI INVERZNÍ PCR (IPCR). Inverzní PCR je varianta umožňující amp linkovat úseky DNA o neznámé sekvenci ohraničené na obou stranách DNA se známou sekvencí (obr. 56). Primery pro inverzní PCR jsou navrženy na koncích známé sekvence tak, že jejich 3'-konce směřují od sebe a mají mezi sebou reštrikční místo (B) o délce 6 bp. V prvním kroku je genomová DNA Štěpena vhodnou reštrikční etidonukleázou (A) s rozpoznávacím místem o 4 bp, tak aby délka restrikčnich fragmentů byla vhodná pro PCR. V druhém kroku se provede ligace T4 DNA-ligázou, jejímž výsledkem je cirkularizace restrikčnich fragmentů. Aby bylo dosaženo jednomolekulární ligace, je třeba v reakčních podmínkách zvolil vhodné ředění. Kružnicové DNA obsahující známou sekvenci se potom AMPL1F1KACE NUKLEOVÝCH KYSELIN 89 linearizují štěpením v restrikčním místě B, jehož výsledkem jsou fragmenty s cílovou sekvencí nacházející se mezí zbytky známé sekvence na obou koncích fragmentu. Neznámá sekvence je následně amplifikována. Opakovaná inverzní PCR může být použita k procházení po chromozomu (kapitola (V), ale délka analyzované DNA, která má být amplifikována je omezená na relativně krátké úseky chromozomu. MODIFIKACE KONCŮ DNA PROSTŘEDNICTVÍM 5*-KON-CÚ PRIMERŮ. Příměry pro PCR mohou být navrženy tak, že kromě sekvence požadované pro hybridizaci s cílovou DNA obsahují navíc další sekvenci adaptoru na svém 5f-konci (lepivý konec). Tato sekvence se neúčastní prvního hybridizačního kroku, kdy hybridizuje pouze 3'-ko-nec primem, ale následně se stává součástí amplinkovaného fragmentu DNA (obr. 57). Dodatečná sekvence na 5-konci primem může být zvolena zcela libovolně a poskytuje širokou přizpůsobivost pro modifikaci konců DNA. Přidávané sekvence obsahují nejčastěji reštrikční místa pro snadné klonování produktů PCR nebo promotory, terminátory a translační Obr. 56 Princip obrácené polymerázové řetězové reakce signály (EC-PCR). (IPCR). Místa pro štěpení různými restrikčními endonukleázami jsou označená A a B ALELOVĚ SPECIFICKÁ PCR (AS-PCR). Pro detekci bodových mutací v geno-mech je AS-PCR prováděna ve dvou nebo více paralelních reakcích. V první reakci je jeden primer komplementární ke standardní sekvenci a v další reakci k mutantní nebo polymorfhí sekvenci. Druhý primer je v obou reakcích stejný. Předpokládá se, že k elongaci dojde pouze tehdy, pokud jsou primer a cílová sekvence plně komplementární. V případě homozygotního stavu bude kamplifikaci docházet pouze v jedné z reakcí. Metoda byla popsána nezávisle pod různými označeními a využívá dva odlišné přístupy. První přístup je založen na chybějící elongaci v důsledku chybného párování bází na 3'-konci příměru. Tento systém se nazývá amplifikaci nedostupný mutační systém (ARMS), PCR-amplifíkace specifických alel (PASA) nebo alelově specifická amplifikace (ASA). Ve druhém přístupu k chybnému párování bází dochází ve střední části sekvence příměru a brání tak hybridizaci primeru k cílovému místu v případě, že se vtemplátové DNA vyskytuje. Metoda využívající tento princip se nazývá kompetitivní připojení oligonukleotidu (COP). oblasti s neznámou •■*■ sekvencí 1 známá sekvence štěpení restriktázou ve specifických místech \ i cirkulace a ligace JÉ b mnoho ■=* J- kružnícových molekul ^N /-\ příměry se připojují ^ ke známé sekvenci i J a směřuji směrem ven amplifikace analýza sekvence příprava sond pro mapování chromozomu nebo primerů pro PCR 90 AMPLIFIKACE NUKLEOVÝCH KYSELIN 5 l ! i i l l l l l I I i 3' 5 f t I I M 1 I I I I I H/ndlll cgcgttcgUa _ 11 mí h i i|i i cílová sekvence I I I M M I I 1 I i M i i i M t M i denaturace a připojeni primerú 1 a 2 pcr I I ' ' M I t I I I EcoRI ÔJaÁt "c-ggc^ G Ofar. 57 Modifikace konců dvouřetézcové DNA pomoci PCR-primerů se sekvencemi restrikčních míst Pro snazší odlišení heterozygotního stavu v jediné reakcí je používána varianta označená jako PCR-amplifikace více specifických alel (PAMSA) nebo dvojitý ARMS, Jeden zalelově-specifíckých primerů obsahuje na 5-konci pfídatný úsek několika nekomplemen-tárních nukleotidů, a tak mohou být amplifikační produkty obou alel rozlišeny na základě své délky. Metoda je obecně velmi citlivá na optimalizaci experimentálních podmínek reakce, zejména koncentrace jednotlivých reagentů a templátové DNA. Úspěšně se používá pro rozlišení homozygotního a heterozygotního stavu v nejrůznějších klinických aplikacích. ZPĚTNÁ PCR (RT-PCR). RT-PCR je metoda určená k amplifikaci molekul RNA. RNA nemůže sloužit jako templát pro PCR, a proto se produkty tvoří pouze tehdy, jestliže je izolovaná RNA nejdříve převedena do cDNA retrovirovou zpětnou transkriptázou (např. zpětnou transkriptázou víru M-MuLV nebo AMV) a následně amplifikována PCR se dvěma specifickými primery standardním postupem (obr. 58). Nevýhodou zpětné transkriptázy je její termolabilita. Enzym ztrácí funkčnost již pří teplotách nad 42 °C a proto je stringence zpětné transkripce RNA na cDNA relativně nízká. Navíc v některých případech, zejména při stabilní složité sekundární struktuře RNA je znemožněn přepis RNA do cDNA. Výhodou naopak může být možnost optimalizovat samostatně zpětnou transkripci a samostatně PCR a také snadná syntéza dlouhých produktů o délce až 14 kb. AMPLIFIKACE NUKLEOVÝCH KYSELIN 91 lAAAAAAAA -tttttt1 Zpětná transkripce pomoci zpětné transkriptázy nebo Tth DNA-polymerazy -. primer oikjo(dT) nebo náhodné hexamery nebo genově specifický primer cDNA A AAAAAAA — tttttt1 genově specifický primer Obr. 58 Zpětná polymerázová řetězová reakce (RT-PCR) s využitím oligo(dT>primeru Současná technika RT-PCR využívá termostabilní Tth DNA-polymerázu, která se za přítomnosti iontů Mn3+ vyznačuje RNA-dependentní DNA-polymerázovou aktivitou a je schopná účinně a specificky převést RNA do DNA při teplotě 72 °C. Stejným enzymem je poté prováděna PCR. Pro zahájení RT-PCR se využívá jako jeden z příměrů oligo(dT)--prímer rozeznávající po!y(A)-konec mRNA nebo náhodné hexanukleotidy v případě, že mRNA není polyadenylovaná. RT-PCR můžeme provést rovněž prostřednictvím dvojice specifických primerů, které jsou navrženy tak, aby bylo možné odlišit produkty vznikající při RT-PCR a při standardní PCR s genomovou DNA, která může vzorky pro RT-PCR často kontaminovat (obr. 59). Pokud se místně specifické primery připojují k sekvenci 2 exonů na obou stranách určitého intronu, amplifíkační produkt z genomové DNA je větší než produkt RT-PCR. Pokud mají navržené primery vazebnou sekvenci na spojení exon/exon, neamplifi-kují genomovou DNA vůbec. RT-PCR a její modifikace jako DDRT-PCR (diferenciální display RT-PCR) nacházejí praktické využití při studiu úrovně exprese genů (kapitola VIII) a v molekulární diagnostice zejména některých virových genomových nukleových kyselin, které jsou přítomny pouze jako RNA (kapitola LX). RYCHLÁ AMPLIFIKACE KONCŮ cDNA (RACE). Syntéza cDNA z mRNA o úplné délce není pomocí RT-PCR snadná, protože často není dostupná celá sekvence tran-skriptu. K usnadnění klonování cDNA o úplné délce se pomocí RACE amplifikují kratší úseky od obou konců poté, co byla stanovena část sekvence cDNA jinými metodami. RACE umožňuje získat kompletní sekvence cDNA během několika dní. Dělí se na 5'-RACE a 3-RACE. Pro použití RACE je nezbytná znalost části sekvence uvnitř molekuly mRNA, ve které je navržen specifický primer, který je orientován ve směru 3' nebo 5' a umožňuje produkci překrývajících se fragmentů cDNA. AMPLLFIKACE NUKLEOVÝCH KYSELIN i— produkt PCR í íjenomová dma 1 [//] intron 1 mtron 1 /A mRNA ^-,- exDii2 I I produkt RT-PCR produkt PCR netvoří se produkt PCR í primer proti směru transkripce genomová DNA i mRNA i exon primer po smeru transkripce intron exon 3 produkt RT-PCR Obr. 59 Dva přístupy pro návrh příměru umožňujících odlišit produkty vznikající při RT-PCR a pří standardní PCR s genomovou DNA 3-RACE využívá výhody přirozeného poly(A)-konce na mRNA jako místa pro zahájení PCR ampliftkace {obr. 60). Pro zpětnou transkripci od 3'-konce se použije složený příměr obsahující 17 zbytků oligo(dT) navázaných na 17-mer kotevní adaptor (KOTV). Adaptor má vyšší Tm než oligo(dT) a je vhodné, aby nesl restrikění místa pro klonování. Pro PCR se pak použije primer komplementární k adaptoru a druhý, genově specifický primer navržený ze střední části cDNA, Při S'-RACE je cDNA syntetizována za použití genově specifického příměru SPI a zpětné transkriptázy (obr. 61). Reakční produkt zpětné transkripce je pak purifikován od nukleotidů a primerů a vybaven S'-polyídA)-koncem připojeným terminálni transferázou. cDNA s napojeným koncem je pak amplinkována PCR s použitím vnějšího genově specifického primem SP2S složeného primeru olígo(dT) s kotevním adaptorem (KOTV) a Taq DNA-polymerázy. Získaná cDNA může být dále amplifikována prostřednictvím další PCR využívající vnitřního primem SP3 a primem komplementárního k adaptoru. AMPLIFIKACE NUKLEOVÝCH KYSELIN 93 příprava cDNA se složeným oäigo(dT) primerem mRNA *V>AAArtAA/\/VV\/V\/VVVVlAAAA c D NA denaturace, připojeni primeru SP1| syntéza (+) řetězce TTTTKOTV denaturace, připojeni primeru KOTV syntéza (-) řetězce KOTV T jretézec | kotvj pokračováni PCR s primery SP1 a KOTV \ KOTV| až 105 kopíí cDNA řetězec KOTV Obr. 61 Princip odstupňované 5'-RACE s genově specifickými primery 5RT a SP2 Obr. 60" Princip 3'-RACE s adaptorovým oligo-(dT) primerem a genově specifickým primerem SPI príprava cDNA s genově specifickým primerem 5RT mRNAvwvwvwvwvvvvwuvM A A A cDNA | () řetězec .j 5ŘŤ~j odstranění primeru 5RT, pripojení poly(dA)-konce k cDNA AAÁAl denaturace, připojeni složeného olkjo(dT) primeru, syntéza (+) řetězce KOTvTTTT ^TTTTJ + B AAAA fteí 5RT denaturace, pripojení primeru SP2 | SF2~ syntéza {-) řetězce : ) feitiizec SP2 denaturace,__ připojeni primeru KOTV |_KOTV ■ syntéza (+) řetězce KOTV (^yrětězěc " j ŠP2~ pokračovaní PCR s primery KOTV a SP2 KOTV- J L SP2 i kotv -> r~ [ : ť^j řetězec SP2 až 10" kopií cDNA 94 AMPLIFIKACE NUKLEOVÝCH KYSELIN druhý primer není k dispozici PCR fragment dvouřetézcové DNA ^ dena ASYMETRICKÁ PCR, Podobně jako každá molekula DNA, může být i produkt PCR podroben sekvencování. Vzhledem k tomu, že optimálním templátem pro Sangerovu metodu sekvencování jsou ssDNA, byla pro jejich přípravu vyvinuta technika označovaná jako asymetrická PCR, při níž jsou tvořeny preferenčně ssDNA. Tato modifikace se od standardní PCR liší tím, že výchozí koncentrace primerů se liší faktorem 100, tj. jeden z primerů je ve 100* vyšší koncentraci než druhý. Dvouřetězcové fragmenty DNA se tvoří až do okamžiku, kdy se jeden z primerů vyčerpá. Druhý primer pak dále syntetizuje pouze jeden z řetězců a i když se tento řetězec tvoří pouze lineární a nikoli exponenciální rychlostí, je jeho množství postačující pro sekvencování. Asymetrická PCR může být prováděna rovněž pouze s jedním primerem, zejména pro účely automatického sekvencování (obr. 62). denaturace a připojení primerů dostupný primer ^ syntéza nového řetězce denaturace a připojeni primerů ^ syntéza nového řetězce denaturace a připojeni primerů syntéza nového řetězce denaturace a připojení primerů □ E Obr. 62 Princip asymetrické polymerázové řetězové reakce D1DEOXY-FINGRPRINTÍNG (ddF). ddF je hybridní diagnostická technika využívající dva metodické přístupy, Sangerovu sekvenační reakci asymetrickou PCR, která je na rozdíl od klasického sekvencování prováděna pouze s jedním dideoxy-terminátorem (kapitola V), a SSCP pro analýzu produktů reakce. Mutace jsou detekovány jako výsledek ztráty nebo získání dideoxy-terminačního segmentu a nebo na základě rozdílné elektroforetické mobility u alespoň jechnoho z dideoxy-terminačních segmentů. Reakce se provádí s Taq DNA-polymerázou a zpravidla využívá stejných primerů, které byly použity k amplifíkaci cílové sekvence standardní PCR, a to v obou směrech 5' a 3' a nebo pomocí dalšího primerů vázajícího se k vnitřní části ampliftkované sekvence (obr. 63). Používané primery jsou na koncích radioaktivně značené [y-32P]dATP prostřednictvím T4 polynukleotid kinázy. Po analýze produktů SSCP je provedena vizualizace výsledného fingrprintu autoradiografií. Metoda se používá zejména k detekci bodových mutací u eukaryotických genů. AMPLIFIKACE NUKLEOVÝCH KYSELIN 95 1 ri]iriiiiiii i u i n i i n i i i x - bodová mutace 11 ru 111 u 111 i 2 PCR s primery 1 a 2 II! I I I......II imniuimi 5 TTTI JJ-U ■ 1*1111 ■ ' ■' V ' 3 Sangerova terminační reakce se značným vnitrním příměrem 3 a jedním ddNTP — -^3 nedenaturační polyakry (amidová elektroforéza a autoradiografie vzorky 1 a 2 mají mutace, C je kontrola bez mutací PCR S DEGENEROVANÝMI OLIGONUKLEOTIDOVÝMI PRIMERY (DOP-PCR). DOP-PCR je metoda používaná pro uniformní náhodnou ampli-fíkaci DNA. Tato ampliftkace může být výhodná pokud je k dispozici jen malé množství vzorku DNA, takže další postupy (klonování, značení, hybridizační reakce) mohou být provedeny účinněji. Degenerované oligonukleotidové primery (DOP) mají definované sekvence na 5'- a 3'-kon-cích, které ohraničuji náhodnou hexamero-vou sekvenci. Náhodná hexamerová sekvence vykazuje všechny možné kombinace přirozených nukleotidů: A, G, C a T. DOP--primery se připojují při nízké stringenci k denaturované templátové DNA, kde hybridizují k vazebným místům příměru. Vzdálenost vazby primerů může být kontrolována délkou definované sekvence na 3'-konci a přísností podmínek amplifikace. DOP-primery tak skýtají univerzální metodu pro uniformní amplifikaci zejména krátkých molekul DNA nebo DNA přítomné ve velmi nízké koncentraci. Prvních pět cyklů DOP-PCR sestává z připojení při nízké stringenci, následným zvyšováním teploty na elongační teplotu a prodlužování primem. Dalších 35 cyklů probíhá za vyšší připojovací teploty (vyšší stringenci). Za přísnějších podmínek je materiál vytvořený při prvních cyklech amplifikován preferenčně, protože obsahuje kompletní příměrovou sekvenci na obou koncích (obr. 64). Na jiných místech se DOP-primer při stringentních podmínkách neváže. Amplifikace DOP-PCR vede ke vzniku spektra různě dlouhých fragmentů DNA. DOP-PCR se uplatňuje při: • hybridizaci in situ s chromozomy separovanými metodou FACS, chromozomy po mikro-sekci nebo genomovou DNA z hybridních somatických buněk, • srovnávací genomové hybridizaci (CGH), • přípravě fragmentů DNA frakcionovaných podle velikosti, • analýzu nebo klonování stopových množství DNA nebo DNA z nekultivovatelných mikroorganizmů. b -»- _ b b-M- a-K — — Obr. 63 Analýza produktu PCR metodou DdF s vnitřním primerem; „a" označuje složku dideoxy-polymorfízmu a „b" označuje složku SSCP-polymorfízrnu 96 AMPLIFIKACE NUKLEOVÝCH KYSELIN 5'- DOP-PCR prime r se skládá ze 3 oblastí: □ připojovaná sekvence na 5-konci □ náhodná hexamerová sekvence □ místně specifická sekvence na 3 -konci a/- OOP-PCR primer 5 - mhnmnn -3' 5- 3'- -3 |nmmhhh[ - templátovaná DNA -1Q DOP-PCR primer \ amplifikace při nízké stringenci mnhnnn 1 amplifikace pfi vysoké stringenci -1-- — [nhhnnn 3'- -5 -5 Obr. 64 Princip uniformní amplifikace DNA s degenerovanými oligonukleotidovými příměry (DOP-PCR) DEGENEROVANÁ PCR (D-PCR). Degenerovaná PCR se používá pro získání původních sekvencí cDNA na základě omezených informací o sekvenci aminokyselin. Pokud není známo, která z variant sekvence DNA se může v genomu vyskytovat, jsou PCR-primery odvozeny ze zpětné translace proteinového motivu, zpravidla 6 až 9 aminokyselinových kodonů, jejímž výsledkem je směs primerů s různým stupněm degenerace s výjimkou kodonů pro metionin a tryptofan (obr. 65). Návrhu primerů musí být věnována velká pozornost vzhledem k možnosti zvýšení komplexity sekvencí primem, která zpravidla vede k získání nespecifických produktů. Jakmile je vybrána optimální sekvence primerů, může být syntetizována současně směs všech variant sekvence reprezentující všechny možné aminokyselinové kombinace degenerované sekvence. Degenerace je zajištěna pfi syntéze primerů a AMPLIFIKACE NUKLEOVÝCH KYSELIN 97 není nutné syntetizovat zvlášť všechny varianty. Degenerovaná PCR je úspěšně používána pro: • vyhledání sekvence DNA na základě sekvence aminokyselin stanovené u proteinu, • vyhledání a klonování homologických genů napf. člověka a myši, • hledání a studium genových rodin s určitou strukturní podobností, • fylogenetické a evoluční studie využívající srovnávání ortologních genů. Trp Asp Thr Ala Gly Gin Glu 5' TGG GAY ACN GCN GGK CAR GA 3 T G G G G C A A A A T T T C C C Obr. 65 256 variant degenerovaného primem odvozeného zpětnou translací proteinu IN SITU PCR. PCR může být využita pro lokalizaci určité sekvence nukleových kyselin uvnitř jednotlivých buněk. Ve srovnání s hybridizací in situ (ISH), která v některých případech vykazuje nízkou citlivost detekce, je to technika extrémně citlivá, umožňujicí ampliftkaci řídce se vyskytujících nebo jedinečných kopií genů. Konvenční PCR však vyžaduje destrukci tkáně nebo buněk, ze kterých se nukleová kyselina izoluje, proto nelze výsledek amplifikace asociovat se specifickým histologickým typem buněk, s histopatologickými rysy nebo mírou či procentem buněk, obsahujících cílovou sekvenci. In sítu PCR je technika, která kombinuje vysokou citlivost PCR s cytologickou lokalizací sekvencí poskytnutou ISH. Kombinace těchto technik bývá také nazývána PCR-ISH, vnitrobuněčná PCR nebo PCR řízená ISH. Principem in silu PCR je amplifikace specifické sekvence DNA v buňce, čímž se počet kopií zvýší natolik, že je lze detekovat snadno metodou ISH nebo imunochemicky. Postup zahrnuje fixaci buněk nebo tkáně při zachování jejich morfologie, permeabili-zaci umožňující přístup primerů a dalších reagencií k intracelulárním sekvencím nukleových kyselin a ampliftkaci in situ PCR uvnitř neporušených buněk udržovaných v suspenzi a nebo v řezech tkání pod mikroskopickým sklem. In situ PCR v buněčných suspenzích se provádí s fixovanými buňkami resuspendovánými v reakční směsi pro PCR v mikrozkumavce v konvenčnim termocykleru. V preparátech jednotlivých buněk jsou nukleové kyseliny lépe chráněny a fixované buňky fungují jako amplifikační váčky se semipermeabilní membránou která dovoluje průchod primerů, nukleotidů a DNA-polymerázy do jádra, a přitom dostatečně zadržuje produkty, brání jejich zpětné difúzi a dovoluje detekci produktů PCR in situ. Po dokončení PCR se buňky centrifugu] í a alikvotní část je lyžována a analyzována gelovou elektroforézou a Southernovou hybridizací. Zbývající buňky jsou cytocentrifitgovány na podložní sklíčka. Následná vizualizace intracelulárních produktů PCR se provádí pomocí ISH nebo imunochemicky. Pro in situ PCR prováděné přímo v řezech tkání na podložních sklíčkách, je buněčný materiál přelit směsí PCR pod krycím sklíčkem, které je pak utěsněno gumovým cementem, lakem nebo překryto minerálním olejem, aby nedocházelo k nežádoucímu odpařování (obr. 66). Cyklické střídání teplot je dosaženo položením sklíčka např. na blok termocykleru. Ve srovnání s tradiční PCR má in situ PCR velmi nízkou účinnost, amplifikací v suspendovaných buňkách se dosáhne asi 50násobku množství DNA po 30 cyklech a u preparátů na sklíčkách je toto množství ještě nižší. Pro detekci intracelulárních produktů se používají dvě zcela odlišné metody: 98 AMPLIFIKACE NUKLEOVÝCH KYSELIN PC R přilepení přidání primerú. krycího sklíčka dNTP a DNA-poiymerázy prima - pomocí značených nukleotidů inkorporovaných při amplifikaci nepřímá - pomoci in situ hy briefizace se značenou sondou Obr. 66 Postup jednotlivých kroků při PCR i'm situ • in situ hybridizace se značenou sondou (nepřímá in situ PCR), • přímá detekce značených nukleotidů (digoxigerdn-11-dUTP, fluorescein-12-dUTP, tetrametyl rhodamin-5-dUTP, 3H-CTP), které byly inkorporovány do PCR produktů během amplifikace (přímá in situ PCR). Nepřímá metoda skýtá maximální specifitu při detekci intracelulárních produktů PCR. Přímá in situ PCR je rychlejší alternativou bez následné ISH. Vzhledem k její jednoduchosti se nyní používá častěji, ale i přes zlepšení ve fixaci, permeabilizaci a modifikaci s horkým startem, dává přímá metoda méně produktu než nepřímá, zvláště v řezech tkání. Příbuzná metoda využívaná v cytogenetických aplikacích je označována jako příměrem zprostředkované značení in situ (PRINS). In situ PCR má uplatnění jak ve výzkumu, tak v diagnostice: • pro analýzu chromozomovách přeskupení a translokací, • pro vyhledávání jednokopiových genů a mapování nízkokopiových chromozomovách sekvencí v metafázických chromozomech, • pro detekci nízkokopiových mRNA, • pro detekci sekvencí virových nebo provirových genomových nukleových kyselin (H1V--1, MMTV, CMV, HBV, HSV-2) a virových mRNA. AMPLIFIKACE VNITŘNÍCH PŘEPISOVANÝCH MEZERNÍKŮ (ITS-PCR). Vnitřní přepisované mezerníky (ITS) se nacházejí uvnitř transkripčních jednotek mezi geny pro funkční molekuly RNA (rRNA nebo tRNA) a jejich transkripty se v rámci posttran-skripčních úprav vystepují za tvorby funkčních rRNA z pre-rRNA nebo tRNA z pre-tRNA. Polymorfizmus délky ITS se využívá v diagnostice prokaryotických organizmů a vychází z rozdílných vzdáleností mezi opakujícími se konzervovanými geny pro rRNA nebo tRNA AMPLIF1KACE NUKLEOVÝCH KYSELIN 99 u jednotlivých druhů. Protože geny pro funkční RNA obsahují sekvenční motivy, které jsou vysoce konzervativní mezi eubaktériemi, mohou být navrženy univerzální genové příměry k prozkoumáni množství polymorfísmu délky přepisovaných mezerníků mezi druhy. Jednotlivé druhy se rozliší na základe různé velikosti a různého počtu vzniklých PCR-produktů. V praxi je nejčastěji používána PCR vnitřních ribozomálních mezerníků (RS-PCR), která vychází z vysoce polymorfní povahy I6S-23S mezemíkových sekvencí. RS-PCR může detekovat významný stupeň délkových a sekvenčních polymorfísmu na úrovni rodu i druhu a je často používána pro taxonomické studie. Je to rychlá vysoce reprodukovatelná technika označovaná též jako PCR-ribotypizace. POLYMORFIZMUS DÉLKY JEDNODUCHÝCH REPETITIVNÍCH SEKVENCÍ (SSLP-PCR). Jednoduché repetitivní sekvence (SSR) jsou tandemové repetice o délce 2 až 10 bp (např. mikrosatelity) přítomné v eukaryotických genomech s Četností až 80 kopií. V důsledku mutací nebo rekombinací se počet těchto repeticí může zvýšit nebo snížit. Primery pro tuto metodu jsou navrhovány tak, aby se připojovaly k oblastem ohraničujícím SSR. Tyto ohraničující sekvence bývají konzervativní pouze v rámci druhu a proto je nutné navrhovat pro každý druh novou sadu primerů. Jelikož je mezi jedinci počet repeticí značně variabilní, výsledkem amplifíkace je vznik různě dlouhých PCR produktů, které jsou separovány polyakrylamidovou nebo agarózovou gelovou elektroforézou s vysokým rozlišením, Rozdílů v délce fragmentů genomové DNA podmíněné přítomností SSR se používá k odlišení blízce příbuzných jedinců a k detekci vztahů mezi nimi zejména v genetice populací. NÁHODNÁ PCR (AP-PCR) NEBOLI NÁHODNÁ AMPLIFÍKACE POLYMORFNÍ DNA (RAPD). AP-PCR je rychlá a jednoduchá technika pro fingrprintínk DNA, která je vhodná pro rychlou srovnávací typizaci genomových DNA mikroorganizmů a některých rostlin. Byla popsaná nezávisle také pod označeními RAPD, DAF a MAAP. Metoda používá obvykle jeden nebo více krátkých primerů o délce 8-12 nukleotidů libovolné sekvence s neznámou homologií k cílové sekvenci DNA a málo přísné podmínky pm připojení primerů. Za těchto podmínek dochází k nasedání primerů s vysokou pravděpodobností na více místech na obou řetězcích chromozómové nebo plazmidové DNA. Obvykle se vyskytne několik míst, která nejsou od sebe příliš vzdálená a umožňují připojení primerů na protilehlých řetězcích 3'-konci směřujícími k sobě (obr. 67). Výsledkem je amplifíkace mnoha fragmentů s různou délkou (max. 2 000 bp) a rozdílným moSárním množstvím, v závislosti na tzolátu, ze kterého genomová DNA pochází. Použitelnost oligonukleotidových primerů může být zhodnocena pouze empiricky a informace o sekvenci templátové DNA není nezbytná. Rozlišování vzorků dobře koreluje s jinými genotypizačními technikami. Přes svou vysokou účinnost jsou při AP-PCR problémy s reprodukovatelností a s nedostatkem shodných pravidel pro interpretaci rozdílů vzorů. Metoda se v praxi používá pro identifikační postupy a taxonomické studie a může být kombinována s analýzou DGGE nebo SSCP, Produkty AP-PCR se využívají pro přípravu hybridizačních sond pro binární typizaci mikroorganizmů. Při této metodě se genomová DNA podrobí hybridizaci se sérií sond, které jsou připraveny z jedinečných amp li fixačních produktů AP-PCR, které diferencují bakteriální kmeny. Postup binární typizace byl technicky zjednodušen a zrychlen zavedením zpětné tečkové hybridizace s i mobil i zo vánými sondami. Hybridi zace se sondou je zaznamenána hodnotou 1, žádná hybridizace hodnotou 0, Binámí kód je převeden do desítkové soustavy, toto číslo vyjadřuje binární typ. Tento genotypizační systém poskytuje jednoznačné, číselné popisy vzorků. 100 AMPL1FIKACE NUKLEOVÝCH KYSELIN I- chromozóm A ů 1000 1000 500 amplifikace při nizké stringenci (nizká teplota pro připojeni pnmeru} etektroforéza v agarózovém nebo potyakrylamidovóm gelu — — — A B C bp 1000 500 200 Obr. 67 Náhodně amplinkovaná chromozómová DNA metodou AP-PCR INTERREPETIT1VNI PCR (REP-PCR). Interrepetitivní (repetitivní) PCR je typizační technika pro analýzu celého genomu využívající přítomnosti repetitivní c h elementů v bakteriálních nebo eukaryolických genomech. Princip metody je podobný AP-PCR, avšak pro zahájení amptífikace využívá známé repetitivní sekvence, vyskytující se v genomu ve více kopiích (repetíce, IS elementy, transpozony, VNTR, nepřepisované mezerníky). Výsledkem amplifikace je více produktů různé velikosti, jejichž tvorba vychází z rozdílné lokalizace opakujících se elementů a z rozdílné vzdálenosti, která je odděluje v jednotlivých genomech, a poskytuje tak jedinečný fingrprint. Ačkoli jsou amplifíkovány pouze malé části chromozomu, pro získám fmgrprintu je třeba kompletní chromozómová DNA podobně jako u AP-PCR. Primery jsou navrhovány tak, aby se připojovaly přímo ke koncovým, konzervativním oblastem repeticí a 3-konce primem směřovaly směrem ven z repetitivní ho elementu tak, aby se neamplifíkovala samotná repetice. K amplifíkaci dojde pouze v tom případě, že sekvence se nacházejí v genomu v obrácené orientaci a ampliťikovatelné vzdálenosti. Při návrhu univerzálních primerů použitelných pro více genomů je třeba navrhnout konsenzní sekvenci primeru a zvolit niž S í teplotu pro jeho připojení. AMPLIFIKACE NUKLEOVÝCH KYSELIN 101 K nej Častí ji používaným repetitivním elementům používaným při ínterrepetitivní PCR u prokaryot pro účely ge no typizace náleží; • opakuj í c i se e xrrage nové pa 1 indr omo vé Rep -e le me nty Escherich Ut coli, • enterobakteriální opakující se inlergenové shodné sekvence (ERIC-sekvence), • dlouhé roztroušené repetitivní elementy RepMP3 z Mycaplasma pneumoniae, • mozaikové repetitivní BOX-elementy z Streptococcus pneumoniaet • tandemově opakované polynukleotidové sekvence (GTG)n popsané u enterobakíerií. Podle typu repetitivní sekvence použité pro připojení primerů mívá metoda své specifické označení (např. ERiC-PCR nebo BOX-PCR). U eukaryotických genomů se prostřednictvím Ínterrepetitivní PCR amplífikují marke -ry označené jako inverzní sekvenčně značené repetice (ÍSTR) používající příměry komplementární např. k rozptýleným vysokokopiovým retrotranspozonům. Jiné metody označované jako amplifikace mezi jednoduchými repetttivrúmi sekvencemi (ISSR) a amplifikační reakce s jedním příměrem (SPAR) využívají primery homologické k sekvencím SSR nacházejícím se v rostlinných genomech (srovnej str. 99). Pro zahájení amplifikace je navržen primer odvozený ze samotné repetitivní sekvence a ten umožňuje amplifikaci jedinečných sekvencí oddělujících jednotlivé SSR. Pro zamezení překrývání těchto primerů mohou být prodlouženy o jedinečnou genomovou sekvenci ohraničující repetici. Primery navržené z tetranukleotidových repetící, např. (GATA)4f dávají lepší výsledky než dinukleotidové nebo trinukleotidové. Určitým vylepšením metody Ínterrepetitivní PCR je fluoroforem zdokonalená Ínterrepetitivní PCR (FERP), která používá primerů značených na 5'-konci fluorescenční látkou, rozdělení produktů PCR v nedenaturujícím polyakrylamidovém gelu a digitální zpracování otisků DNA. Další obměnou je automatická laserová fluorescenční analýza (ALFA), při které se rovněž používají 5'-koncově fluorescenčně značené PCR-primery a produkty PCR jsou rozděleny v denalurujícím potyakrylamidovém gelu na automatizovaném sekvenátoru, což značně zlepšuje rozlišení a reprodukovatelnost. Do skupiny inlerrepetílivní PCR bychom mohli zařadit i variantu označovanou Aíu--PCR, která je používána k amplifikaci sekvencí DNA specifických pro Člověka. ,4/ti-PCR představuje velmi jednoduchý prostředek pro charakterizaci a amplifikaci specificky lidské DNA. Metoda používá primery pro repetitivní sekvence, které jsou přítomny v množství asi 900 000 kopií v lidském genomu. Aiu-sekvence o délce 300 bp je velmi variabilní a obsahuje sekvenci která je specifický pro Člověka. Pro amplifikaci se připraví dva primery, každ> pro jeden směr, přičemž se využije nejvíce konzervativních úseků těchto sekvencí (obr. 68). Primery nelze použít společně, neboť vzájemně hybridizují. Lidské sekvence se budou am-plifikovat, pokud leží mezi sousedními Alu-repeticemi, které jsou orientovány v opačných směrech. Tato technika je často používána pro odlišení lidské DNA od ostatních DNA. AMPLIFIKACE NUKLEOVÝCH KYSELÍN prirner A čósl Alu sekvence jedinečná pni primáty prirner B amplifikace s příměrem A A AACGTCAC L ŕ 1 ' 1 1 1 r CGGCTCTA .....111 t I 1 I I—I I I í I 'I ľ ľ i [ I I TTGCAGTGAGCCGAGAT AACGTCACTCGGCTCTA 3' i—r T T i—r G C F I 1 I I t I 1 I 1 I i AGTGAGCCGAGA A jasa -----.—„ 3 4 AU- 1 [ Alu - ■". -*Atu Afv*- - Akl B T=l ■S B amplifikace s primerem B Obr. 68 Princip amplifikace mezemíkových sekvenci mezi ^/w-repeticemi metodou Alu-PCR POLYMORFIZMUS DELKY AMPLIFIKOVANÝCH FRAGMENTU (AFLP). AFLP představuje novátorskou metodu pro charakterizaci celkové genomové DNA, která poskytuje vysoké rozlišení a dobrou reprodukovatelnost. Označuje se rovněž jako amplifikace vzácnych restrikČních míst (IRS-PCR) nebo selektivní amplifikace restrikČních fragmentů DNA podmíněná primerem (SRFA). Metoda zahrnuje čtyři základní kroky (obr. 69): • úplné rozštěpení extrémně malého množství genomové DNA jednou neho dvěma re-strikčními endonukleázami, z nichž jedna mívá zpravidla méně cílových míst, • ligaci genomové DNA s oligonukleotidovými adaptory, které jsou navrženy tak, aby nedocházelo k obnově restrikčního místa; ligace probíhá za přítomnosti restriktáz, takže nedochází ke spojování restrikČních fragmentů, • selektivní amplifíkaci sady restrikČních fragmentů pomocí jednoho nebo dvou selektivních AFLP-primerů, • gelovou elektroforézu amplifikovaných fragmentů v nedenaturujícím poly akry lamí dové m gelu. Použitím AFLP je tedy možno vizualizovat sadu restrikČních fragmentů pomocí PCR bez znalosti jejich nukleotidové sekvence. Amplifikace restrikČních fragmentů je dosaženo použitím sekvencí adaptoru a zbytku restrikěního místa, které slouží jako cílová místa pro připojení primerů. Aby bylo dosaženo amplifikace pouze části adaptovaných fragmentů, bývají AFLP-primery navrženy tak, že jsou delší o jednu až tři náhodně zvolené báze na 3'-konci směrem k neznámé sekvenci fragmentu bezprostředně sousedící s restrikčním místem. K amplifíkaci a prodloužení primem dochází pouze v případě komplementárního párování 3'-konce AFLP-primem. Tímto způsobem dochází k selektivnímu výběm pouze malé části z velkého počtu až desetitisíců fragmentů vytvořených štěpením geonomové DNA, takže výsledný fingrprint lze snadno vyhodnotit a reprodukovat. Polymorfizmus je založen na ztrátě nebo získání restrikČních míst a je analogický s polymorfizrnem RFLP. Zdokonalením metody je použití fluorescenčního značení u jednoho z primerů a separace vzniklých AMPLIFÍKACE NUKLEOVÝCH KYSELIN 103 adaptor H Hinú\\\ (a/agctt) NNNNNNNNNCftGCTT -NNNNNNNNNGTCGAftNNNN- selektivnj ampliflkace pomocí pcr ľac/l (T7CGA) -nnnnagc]c_ GNNNNľJNNNNNN nnnnnnnnnnn adaptor! denaturace, hybridizace primer ú a jejich prodlouženi A N N N N N K' ľ>: N N C A G C TT NNNNMNNWNGTCGA/^JNN ■ 7 nnnnnnnnncagctt_ , nnnnnnnmngtgga^jnn--f nnnwnnnmncagctt,—, nnnnnnnnngtcga^nn Pokud není 3-kone c primeru komplementárni, nedochází k amplifikacf. primer h nnnnnnnnncagc 3-nnnnnnnnwgtcga nEt-► A^TJ- -cagccnnnnnnnnnnn-s' s'-nnnnnwnmncagctta- J GtrCGGNNNNNWNWNNM cKgCCNNNNNNNNNNN RfimerT Obr. 69 Postup stanovení polymorfizmu délky amplífikovaných fragmentu metódou AFLP 104 AMPLIF IKACE NUKLEOVÝCH KYSELIN produktů na automatickém sekvenátoru (fAFLP). AFLP je novou a velmi účinnou typizační metodou pro DNA libovolného původu a stupně komplexity, využívanou jak v diagnostice, tak pro fylogenetické a taxonomické studie. Metodu je možné dále modifikovat tak, že se navrhne jeden z příměrů specificky pro vazbu na střední část adaptovaných restrikčních fragmentů, což se využívá pro vyhledávání sekvenčně specifických amplifikačních polymorfizmu (SSAP) souvisejících např. s přítomností dlouhých koncových repetic (LTR-sekvencí). Podobně je možné jeden z primerů nahradit oíigonukleotidem komplementárním tandemové jednoduché repetitivní sekvenci, např. (GT)72(AT)2 a provést selektivní amplifikaci mikrosatelitaích polymorťhích lokusů (SAMPL). 3. Ampiifikace nukleových kyselin za nepřítomností termofilní DNA-polymerázy AMPLIFIKAČNÍ SYSTÉMY ZALOŽENÉ NA TRANSKRIPCI (TAS A 3SR). Transkripční amplifikační systém (TAS) je první metoda, která využívá pro amplifikaci nukleových kyselin transkripci in vitro a nikoli replikaci s Taq DNA-polymerázou. V současné době se používají varianty této metody označené jako 3SR (NASBA) a TMA. Metoda je vhodnější pro detekci molekul RNA než DNA. Strategií 3SR je kontinuální série zpětných transkripcí RNA následovaných transkripcí DNA. Každý cyklus 3 SR se skládá ze syntézy molekuly DNA, která je komplementární k cílové nukleové kyselině (RNA nebo ssDNA) a transkripce nově syntetizované cDNA, která slouží jako intermedíát a templát pro RNA--polymerázu in vitro. Syntéza cDNA je umožněna připojením speciálně navržených primerů obsahujících kromě 3'-koncové oblasti komplementární k cílové DNA přídatnou 5-sekvenci adaptoru s promotorem pro T7, T3 nebo SP6 RNA-polymerázu. V počátečním kroku je po připojení prvního příměru pro každou cílovou RNA syntetizována molekula ssDNA prostřednictvím zpětné transkriptázy (obr. 70). Syntéza druhého řetězce vyžaduje u varianty TAS tepelnou denaturaci RNA-DNA hybridních molekul, nebo u varianty 3 SR enzymatické odstranění sekvence RNA pomocí RNázy H. Po připojení druhého primem probíhá za přítomnosti zpětné transkriptázy syntéza druhého řetězce. Výsledná kopie dsDNA obsahuje modifikované konce s funkčním promotorem (na jednom nebo obou koncích cDNA). Po přidání RNA-po-lymerázy specifické pro fágový promotor dochází k vlastnímu amplifikačnímu kroku a z každého templářů cDNA vzniká transkripcí až 40 molekul RNA. Nové molekuly RNA tvoří substrát pro další cyklus. Přitažlivou vlastností systému je jeho rychlá kinetika, která umožňuje za 60 minut během několika cyklů získat až 107 molekul RNA. Variantou 3SR je izotermní amplifikační technika, která na rozdíl od varianty TAS nevyžaduje změny inkubační teploty a přidávám zpětné transkriptázy při dalším cyklu. Příkladem využiti je molekulární diagnostika lidského papilomaviru, detekce rezistence k azidotymidinu u viru H1V-1 a detekce obtížně kultivovatelných bakterií (Chlamydia trachomatis a Mycobacterium tuberculosis). AMPLIFIKACE DNA VYTĚSŇOVÁNÍM ŘETĚZCE (SDA). Metoda je založená na schopnosti DNA-polymerázy bez 3'- a 5'-exonukleázové aktivity iniciovat syntézu DNA v místě jednořetězcového zlomu uvnitř cílové molekuly a vytěsnit řetězec se zlomem během syntézy nového řetězce DNA. Takto vzniklé jednořetězce slouží jako substrát pro další SDA--reakci a izotermní akumulaci dvou- a jednořetězcových kopií cílové molekuly. Klíčem technologie SDA je vytvoření místně specifických jednořetězcových zlomů štěpením reštrikční endonukleázou. Za normálních podmínek reštrikční endonukleázy štěpí oba řetězce, AMPLIFIKACE NUKLEOVÝCH KYSELIN 105 matricová moíekula RNA 5'AAnAAA/WWVVWV 3' pnmer A s promotorem « pro Tľ RNA-poíymerázu1- T7 ^ zpětná transkripce s primerem A ^ degradace RNA RNázou K -<~J 5' T7 5 ^ syntéza druhého řetězce DNA s primerem B Jr primer B 3'l dsDNA s pripojeným promotorem T7 T7 RNA-polymemza 3'vwwwwvww 5" 3'vvvwvvvuvww 5' zpětná transkripce s primerem B 5' m degradace RNA 5' X syntéza druhého řetězce DNA s primerem A a T i-- i i dsDNAs pripojeným promotorem T7 J 3-i -------.— 3 Obr. 70 Princip amplifikačního systému 3SR založeného na transkripci což není pro SDA vhodné. Avšak pokud je při syntéze DNA použit jeden ze 4 dNTP a-thto-substituovaný (např. 2'-deoxyadeno-zm-5-a-thio-trifosfát), nově syntetizovaný řetězec DNA potom obsahuje modifikované nukleotidy. Reštrikční endonukleáza v takto modifikovaném rozpoznávacím místě štěpí pouze jeden řetězec a vytvoří místně specifický jednořetězcový zlom. Pro SDA se používá dvojice primerů, z nichž každý má dvě funkční oblasti: směrem k 3'--konci obsahují 15-20 bp dlouhou sekvenci komplementární k cílové molekule DNA a v oblasti sekvence směrem k 5'-konci obsahují rozpoznávací místo pro reštrikční endonukleázu. Reakce SDA je zahájena denaturací cílové molekuly dsDNA a připojením SDA-primerů (obr. 71). Prodloužení primerů vede k syntéze a-thiolovaných řetězů, které jsou chráněny před štěpením reštrikční endonukleázou. Připojený primer navíc slouží jako templ á t pro syntézu řetězce v opačném směru a prodloužení 3'-konců templátové DNA. Jakmile jsou štěpením reštrikční endonukleázou vytvořeny jedno-řetězcové zlomy, 3'-konec vytvořený v místě jednořetězcových zlomů inicializuje syntézu DNA a dojde k vytěsnění nových polynukleotidových řetězců. Oba vytěsněné řetězce se pak uplatní při zahájení dalšího cyklu ampliíikace. Reakce SDA je izotermní a simultánní. Střídání teplot není nutné, protože řetězce DNA jsou denaturovaný enzymaticky vytěsňováním řetězce DNA-polymerázou. Metoda byla původně vyvinuta pro detekci obtížně kultivovatel-ných mykobakterií, kde bylo po Shodinové inkubaci získáno až 106násobné amplifika-ce původních 100 kopií cílové sekvence. Nevýhodou je vysoká cenová náročnost (thio-substituovaný oligonukleotid) a nutnost používat reštrikční endonukleázu, což znesnadňuje výběr cílových sekvencí. Budoucí modifikace SDA budou zahrnovat použití termofílní DNA-polymerázy a možná termofílní restriktázy, což přinese značné zvýšení analytické specifity reakce. 106 AMPLIFIKACE NUKLEOVÝCH KYSELIN mrrmmimMiuimii 5" řetězcet1 at2 s, UJ^]LU,liLJtJI,nLJiHLJ,l tempiátové DNA Ti 1111 r r i r i r 111 f r i miitiii it^ 3, primer P, tttttti i li ii11 I m m 11 i m ii H i M U 11 H 111 i IJ I i i I M h ! i t i; rr 111111111 r 1111 t r r ht iní i ititinn n mími denaturace a hybridizace SOA-primerii TTTTTTTTTTTTTTTTlTŕ 3, ^ilIlítUIJI primer P3 reakce s DNA-poiymerázou a ä dNTP a dNTPaS lUTircriHinmi n-rrmT HimrintiHHHHHiin vytvorení jedno řetězcového zlomu IIIIII1IIIIIIIMIIMI1I1II ......tlIIHIIMIIII reakce s DNA~polymerázou a vytesnení ľ&tézcu UliMI I M I I i M t I I IFI 1 I III jLu.uuiu.iiim u,m.u,u,i. 11T111111 ľ!111 M M I f M IIII 111............1111 itini I hybridizace SDA-primerů k vytěsněným řetězcům Obr. 71 lzotermní amplifikace DNA vytěsňováním řetězce 4. Metody pro amplifikaci sondy Cílem metod pro amplifikaci sondy je ampliíikace sekvence, která se použije jako sonda při hybridizaci a tak zajistí zesílení hybridizačních signálů nebo selektivní detekci amplifikovaných produktů PCR. AJVIPLIFIKACE REPLIKÁZOU Q(3 (QBR). Qp-replikáza je RNA-dependentní RNA-polymeráza, která replikuje genomovou RNA bakteriofága Qj3 z čeledi Leviviridae. Enzym rozpoznává specifickou sekundární srjukturu RNA tvořenou intramolekulárním párováním bází genomové RNA fága Qp\ Jiné sekundární struktury RNA nejsou enzymem rozpoznávány. Některé substráty Qp-repiíkázy tolerují vložení krátké sekvence sondy a označují se jako „uprostřed obměněné sondy" (MDV-sondy). Sbnda se připravuje transkripcí in vitro. Pro konstrukcí sondy, která je schopná replikace se využívá predikce sekundární struktury RNA podobné standardní struktuře v genomu bakteriofága. Kromě rozpoznávacího místa pro Qfi-replikázu nese sonda navíc ve smyčce s vlásenkou na 3'- nebo 5'-konci krátkou sekvenci specifickou pro cílovou molekulu. Po provedení hybridizace sondy s cílovou DNA se volná sonda odstraní RNázou III. U navázané sondy chybí rozpoznávací místo pro RNázu III v důsledku změny sekundární struktury po vazbě na cíl a proto není degradována. Aby se snížila možnost nespecifické vazby sondy, je možné využít variantu metody QBR, která využívá ligaci dvou sousedících binárních sond, Plně amphfikovatelný substrát rozpoznávaný AMPLIF1KACE NUKLEOVÝCH KYSELIN 107 ......f ^ umní . S J^CCQTTAAAAGAToG-CTTCTTGTACTGTATř-5 -OGCAATTTTCTACr GÄAQAACATGACA.T- 3* ® sonda drkularizaee sondy I v závislosti na 1 + termostabilní tigáza qitové DNA T RCA-primery + dNTP +29 DNA-polymeráza I_ Obr. 74 Vznik replikačnich struktur při izoter-mické replikaci otáčivou kružnicí (RCA) VII. Transgenika V předchozích kapitolách jsme popsali, jakým způsobem mohou být geny izolovány, cíleně modifikovány a amplifikovány. V této části se budeme věnovat popisu způsobů, kterými lze tyto geny přenést do eukaryotických buněk. Tyto metody je možno rozdělit do 3 skupin na metody biochemické, fyzikálni a biologické. Výběr metody záleží na konkrétním cíli daného experimentu, na vlastnostech dané buněčné linie a na požadované účinnosti systému. Obvyklým cílem těchto postupů je studium funkce přenášených genů. 1. Transfekce přechodná a stabilní Z hlediska stability přenášeného genu v transfekované buňce rozlišujeme transfekci přechodnou a stabilní. Při přechodné transfekci se cizorodý gen v hostitelské buňce udržuje jen dočasně, protože se nespojuje s chromozomem a v důsledku absence příslušných signálních sekvencí není jeho replikace sladěna s replikací genomu. Během několika dnů se cizorodý gen z množících se buněk „vyředí". Při přechodné transfekci je však možné krátkodobě dosáhnout vysoké exprese přenášeného genu, protože jedna buňka může být transfekována několika kopiemi téhož genu. Při stabilní transfekci se cizorodý gen rekombinací začleňuje do genomu hostitelské buňky, stává se jeho stálou součástí a spolu s ním se replikuje. Stabilní transfekce buněk nastává s velmi nízkou frekvencí. Udává se, že pouze 1 buňka z 10-106 buněk je schopna přijmout transfekČní DNA a začlenit ji do chromozomu. Dosud není známo, co tyto kompetentní buňky odlišuje od buněk nekompetentních. Z nízké frekvence stabilní transfekce vyplývá, že po jejím provedení musí být vzácné transfekované buňky odlišeny od většiny buněk netransfekovaných. Tento problém se obvykle řeší selekcí transfektantů, která je zpravidla založená na použití slekčního Činidla umožňujícího růst pouze buňkám transfekovaným a nikoliv buňkám, které cizorodou DNA nepřijaly. Gen zajišťující rezistenci k danému selekčnímu činidlu je buď nesen stejnou molekulou transfekČní DNA, která kóduje testovaný gen nebo je nesen samostatnou molekulou DNA, která se přidává do transfekČní směsi. Vzhledem k tomu, že kompetentní buňka může přijmout více než jeden fragment cizorodé DNA, nemusí být selekční marker přítomen ve stejné molekule DNA jako vlasmi transgen. V další části této kapitoly stručně popíšeme jednotlivé transfekČní a selekční metody. BIOCHEMICKÉ TRANSFEKČNÍ POSTUPY. Tradičně se k přenosu DNA do různých adherujících i suspenzních buněk používá transfekce zprostředkovaná fosforečnanem vápenatým. Princip této metody spočívá v tvorbě jemné sraženiny fosforečnanu vápenatého a DNA, která se dotýká buněčného povrchu a je pohlcována endocytózou. Po vstupu do buněk, sraženina částečně uniká z endozomů nebo lysozomů a vstupuje do cytoplazmy, odkud postupuje do jádra. Podle typu použitého buněčného systému může až 50 % buněk přechodně exprimovat transfekované geny. Je popsána řada variant této metody, které se liší ve způsobu tvorby sraženiny před pHdáním k buňkám, jejichž smyslem je zajištění správné „hrubosti" sraženiny, aby její endocytóza byla co nejúčinnější při zachování dostatečné životaschopnosti buněčné populace. Dalšími faktory, které ovlivňují účinnost metody je velikost a koncentrace DNA (přítomnost vysokomolekulárni DNA ve sraženině zvyšuje účinnost transfekce nizkomolekulárními, např. plazmidovými DNAJ. Důležitá je rovněž přesnost nastavení pH a koncentrace vápenatých a fosfátových iontů. TRANSGENIKA Pro některé typy živočišných buněk (např. buňky COS, CV-I, BSC-1) se doporučuje transfekce zprostředkovaná dietylaminoetyl (DEAE) dextranem. I když přesný mechanizmus působení DEAE dextranu není známý, předpokládá se, že tento vysokomolekulárni a kladně nabitý polymer slouží jako most mezi negativně nabitými molekulami DNA a negativně nabitým povrchem buňky, Jakmile se komplexy DEAE dextran/DNA přenesou do buněk endocytózou, DNA se v postupně se okyselujících endozomech uvolňuje z komplexu a dosud neznámým mechanizmem přechází do jádra. Ve srovnání s transfekcí zprostředkovanou fosforečnanem vápenatým má technika založená na použití DEAE dextranu několik zvláštností: (1) doporučuje se pouze pro přechodnou a nikoliv stabilní transfekci, (2) funguje výborně jen u vybraných buněčných typů, ale u většiny ostatních je podstatně méně účinná, (3) využívá menších koncentrací transfekční DNA. Pro transfekci adherentních buněk, primárních buněčných linií i kultur rostoucích v suspenzi se Často použivá lipofekčních postupů založených na přítomnosti lipidových činidel. Tato činidla jsou schopna vytvářet umělé membránové měchýřky (lipozomy), které transfekční DNA obklopí a buď následně fúzují s buněčnou membránou nebojsou do buňky přeneseny nereceptorovou endocytózou. Avšak podobně jako u jiných transfekčních technik zůstává i po lipofekci většina transfekční DNA spojená s membránovými složkami buňky a jen malé procento lipozomů dopraví DNA až do jádra. Jsou popsány dvě skupiny lipozomál-ních transfekčních činidel, které se liší svým elektrickým nábojem. Transfekce prostřednictvím negativně nabitých lipozomů byla provedena již v 70. letech 20. století. V tomto případě musí být vytvořeny relativně velké lipozomy, které obsahují vodné prostředí vhodné pro přenášenou nukleovou kyselinu. Tato technika pro svou obtížnou reprodukovatelnost však nezískala velkou popularitu. V současné době jsou mnohem populárnější techniky, které využívají lipidů s kladným nábojem. Jejich výhodou je, že lipofekčni činidla vytvářejí s molekulou DNA komplexy spontánně na základě iontových interakcí. Lipidová povaha pfenašeče pak umožňuje fúzi s buněčnými membránami a tím přenos DNA do buněk. K transfekci některých buněčných linií (např. buněk CHO nebo keratinocytů) nízko-molekulámí (tj. plazmidovou) DNA lze použít polykationty jako polybren (1,5-dimethyl--1,8-diazaundekametylen polymetobromid) a poly-L-ornitin spolu s dimetylsulfoxidem (DMSO). DNA vytváří s polykationty komplexy, jejichž přenos do buněk je usnadněn per-meabilizací buněčné membrány a osmotickým šokem, které zajišťuje DMSO. FYZIKÁLNÍ TRANSFEKČNÍ POSTUPY. Elekíroporace se používá pro přechodnou i stabilní transfekci rozmanitých bakteriálních, savčích i rostlinných buněk. Podstatou této metody je aplikace krátkého elektrického pulzu o vysokém napětí, který v plazmatické membráně buněk vyvolá tvorbu pórů, kterými do buněčné cytoplazmy přechází transfekční DNA. Účinnost metody významně ovlivňuje síla aplikovaného elektrického pole, délka elektrického pulzu, teplota, konformace a koncentrace DNA a iontové složení média. Přesto, že je popsána řada transfekčních technik, některé typy buněk, tkání nebo nitrobuněč-ných organel zůstávají odolné a cizorodou DNA nepřijímají žádné z nich. Tento problém, který je zvlášť akutní u rostlinných buněk, byl do značné míry vyřešen vynálezem genové pušky („gene gun"). Toto zařízení umožňuje vytvořit v tlusté stěně rostlinných buněk otvory nastřelováním kovových částic pokrytých DNA. Přes počáteční skeptický postoj většiny vědců, tento přístup ukázal svou funkčnost a většina dnes používaných transgenních obilovin byla připravena touto technologií. Účinnost transfekce prostřednictvím genové pušky závisí na (1) buněčném typu (bakterie, rostliny i hepatocycty živých hlodavců byly úspěšně transfekovány mikroprojektíly, ale experimentální podmínky byly vždy odlišné), (2) na buněčné hustotě a stupni proliferace (požadavky na tyto parametry jsou rovněž specifické pro různé buněčné typy), (3) na kultivačním médiu (účinnost metody se zvýší, pokud jsou cílové buňky kultivované v médiu s vyšším osmotickým tlakem), (4) na nastavení parametrů pušky TRANSGENIKA 113 (stupeň vakua ve střelné komoře, míra tlaku hélia na mikroprojektily, vzdálenost mezi puškou a cílovými buňkami), (5) na typu a velikosti mikroprojektilů (používají se obvykle částice zlata nebo wolframu pokryté DNA o průměru 0,6 u,m pro buněčné organely až 1,6 um pro savčí buňky). Mechanického způsobu přenosu DNA do buněčných jader využívá technika mikro-injekce. V tomto případě je roztok DNA přímo aplikován skrze plazmatickou membránu do cílové buňky tenkou jehlou mikromanipulátoru. Pro tento postup jsou obzvláště vhodná jádra oocytů a vajíček a často se využívá např. pro transfekci oocytů drápatky Xenopus laevis. Dalším důležitým cílem pro mikroinjekce DNA je jádro oplozeného myšího vajíčka. V tomto případě je cílem experimentu dosáhnout toho, aby se cizorodá DNA včlenila do některého z chromozomů a přenášela se do všech buněk embrya a posléze dospělého organizmu. Organizmy, které byly genovým inženýrstvím pozměněny tak, že ve svých chromozomech obsahují cizí geny, se označují jako transgenni a slouží k monitorování místní a časové exprese daného genu a jeho významu pro vývoj a život daného organizmu. BIOLOGICKÉ TRANSFEKČNÍ POSTUPY. Pro přenos DNA do buněk lze úspěšně využít přirozeného životního cyklu některých virů, které disponují účinným mechanizmem pro infekci eukaryotických buněk a přenos vlastního genetického materiálu plazmatickou membránou. Obzvláště výhodné jsou retroviry, protože v infikované buňce dochází ke kopírování jejich RNA genomu do sekvence DNA zpětnou transkripcí a vzniklá molekula DNA se účinně a stabilně integruje do genomu hostitelské buňky. Byly proto konstruovány retrovirové vektory obsahující retrovirově sekvence začleněné do bakteriálního plazmidu. Do virových sekvencí plazmidu je pak možno přenést studovanou DNA, prostřednictvím transformovaných bakterií nalézt a pomnožit rekombinantní plazmidy a použít je pro transfekci pomocných živočišných buněk v kultuře. Cizorodou DNA přijme jen malá Část populace buněk, ale tyto transfekované buňky budou tvořit rekombinantní retroviry nesoucí studovanou DNA. Vzniklé viriony se mohou použít pro infekci vlastních cílových buněk, ve kterých dojde vzhledem k živomímu cyklu retroviru k začlenění vírového genomu v podobě DNA včetně studované sekvence do genomu a vytvoření rekombinantního proviní (obr. 75). Použití retroviru jako vektorů pro přenos genetického materiálu představuje velmi efektivní způsob spolehlivé a stabilní exprese transgenu, který se udržuje i v potomstvu hostitelské buňky. Nevýhodou využití retroviru při přenosu DNA do buněk je nedostatečná účinnost infekce nedělících se buněk, tj. např. nervových buněk. Navíc retroviry, mezi které patři například HIV, zahrnují významné patogeny, které u živočichů i člověka mohou způsobovat některé typy rakoviny. Používané retrovirové vektory jsou samozřejmě upraveny tak, aby neměly tyto nežádoucí účinky, ale jejich široké použití pro účely genové terapie vyžaduje velmi podrobné analýzy a kontroly, aby byla eliminována rizika jejich nežádoucích modifikací např. po interakci s přirozeně se vyskytujícími retroviry. Kromě retroviru se pro přenos genů do myší používají také postupy využívající myších embryonálních kmenových („embryonal stem" - ES) buněk. Tyto buňky jsou odvozeny z raných myších embryí (blastocyst), lze je udržovat v kultuře a opět přenést do raných myších embryí, kde se zapojí do normální tvorby tkání. Princip metody spočívá v tom, že se tyto buňky v kultuře podrobí transfekci, provede se selekce stabilních transfektantů, ve kterých došlo k začlenění cizorodé DNA do genomu rekombinací a tyto buňky se následně injekcí přenesou zpět do recipientní blastocysty, kde se po přenosu do březí samice zapojí do přirozených vývojových procesů (obr. 76). Část potomstva pak bude obsahovat buňky odvozené od pozměněných kmenových buněk a zároveň buňky pocházející z normálních buněk blastocysty. Tyto myši, které představují směs dvou různých buněčných typů, se označují jako 114 TRANSGEMIKA Amp' ktonovací místo retrovírová sekvence on začleněni klonované DNA izolace rekombinantního plazmidu z E.coli inzert DNA přenos DNA do živočišné buňky transfekcí některé buňky přijmou DNA a tvoří rekombinantní virové částice rekombinantní retrovirové částice nesou studovanou DNA rekombinantní provirus infekce a exprese gehu v dalších buňkách selekční marker 1 přenos do kultivovaných ES buněk studovaný gen ES buňky nesouc! sekvence plazmidu v chromozomální DNA injekce transfekovaných ES buněk do myší blastocyst^ ES buňky blastocysts přenos do březí samice vzniká chimérické potomstvo kříženi potomstvo zdědí transfekovaný gen z ES buněk Obr. 76 Využití transfekovaných embryonálních kmenových (ES) buněk pro přenos cizorodého genu do myší. Pokud se transgen začlení do zárodečných buněk lze křížením chimérických myši získat myší transgenní. Obr. 75 Použití retrovirových vektorů pro přenos cizorodých genů do živočišných buněk TRANSGENIKA 115 myši chimérické. V některých z nich mohou být buňky pocházejici z transfekovaných kmenových buněk začleněny do zárodečné linie. Křížením takovýchto myší vzniká potomstvo, které daný transgen stabilně udržuje ve svém genomu. Mezi biologické transfekční postupy patři přenosy DNA do rostlinných buněk prostřednictvím bakterie Agrobacterium tumefaciens. Tato bakterie vyvolává tvorbu nádorů na tělech rostlin. Patologické účinky A. tumefaciens souvisí s přítomností plazmidu označovaného jako Ti plazmid („tumor-inducíng"), který je po svém přenosu z bakterie do rostlinných buněk schopen vyvolat tvorbu nádoru. Za tento účinek zodpovídá část plazmidu označovaná jako T-DNA, která se integruje do chromozomu rostlinné buňky. Pokud se do T-DNA začlení žádaná nukleotidová sekvence, dojde k jejímu přenosu do rostlinných buněk. Přirozeně se vyskytující Ti plazmidy jsou však příliš velké (více než 200 kb) a proto nejsou vhodné pro klonovací účely. Tento problém však lze vyřešit pomocí tzv. binárního vektorového systému, který využívá dvou plazmidu. Prvním je malý pomocný plazmid E. coli, který nese část T-DNA Ti plazmidu. Do sekvence T-DNA tohoto plazmidu se klonuje žádaný gen a rekom-binantní plazmid se po pomnožení v buňkách E. coli přenese konjugací do buněk A. tumefaciens, v nichž je přítomen druhý plazmid. Tento plazmid je derivátem Ti-plazmidu s odstraněnou T-DNA, ale schopný navodit přenos T-DNA (včetně ktonovaného genu) z prvního plazmidu do rostlinné buňky. SELEKČNÍ SYSTÉMY ŽIVOČIŠNÝCH BUNĚK. Pro analýzu funkce a exprese transfekovaných genů je obvykle nezbytné dosáhnout stabilní integrace transfekční DNA do genomu hostitelské buňky. Po vstupu do buňky je transfekční DNA Částečně přenesena z cytoplazmy do jádra. Podle typu buňky může až 80 % buněk v populaci přechodně expri-movat transfekovaný gen. Během prvních několika hodin po transfekci prochází cizorodé molekuly DNA procesy nehomologni intermolekulární rekombinace a ligace, které vedou k tvorbě konkatemerů a k případné integraci do chromozomu buňky. Protože pravděpodobnost příjmu DNA buňkou, její integrace do chromozomu a exprese je velmi nízká, je získání stabilních transfektantů obvykle podmíněno selekcí buněk, které získaly nový fenotyp. Pro zajištěni možnosti selekce transfektantů se transfekční směs obohacuje o DNA, která hostitelské buňce zajišťuje rezistenci na určité antibiotikum. Buňky transfekované touto pomocnou DNA exprimující příslušný selekční maTker obvykle exprimují i testovaný gen přítomný v transfekční směsi a to i přesto, že obě kódující sekvence mohou být neseny dvěma samostatnými molekulami DNA. Původní selekční systémy vyvinuté v 70. letech 20, století byly založeny na principu obnoveni porušených metabolických drah v buňce. Prvním genem, který se používal pro zajištění selekce transfekovaných savčích buněk byl gen kódující tymidinkinázu (TK) viru herpes simplex. Mutantní buňky s inaktivní tymidinkinázou byly transfekovaný genem HSV--TK a získaly tak schopnost růstu na selekčním médiu obsahujícím aminopterin. TK kataly-zuje jednu z reakcí alternativní dráhy syntézy dTTP z tymidinu. Za normálních podmínek tento enzym není pro růst buněk nezbytný, protože buňky obvykle syntetizuji dTTP z dCDP. Avšak buňky rostoucí za přítomnosti aminopterinu nemohou tuto obvyklou dráhu syntézy dTTP používat a jsou tak závislé na přítomnosti funkční tymidinkinázy. Buňky TK" mohou v médiu obsahujícím aminopterin růst pouze tehdy, jestliže došlo k úspěšné stabilní transfekci a expresi cizorodého genu kódujícího TK, který byl přítomen v transfekční směsi. Slabinou tohoto přístupu však byla nutnost přípravy TK" variant každé buněčné linie určené k transfekci. V dalších letech se proto výzkum zaměřil na zavedení nových selekčních systémů a vedl k objevům dominantních selekčních markerů, které transfekováným buňkám umožňovaly růst za přítomnosti antibiotik. Mezi tyto novější selekční markery patří např. aminoglykosid fosfotranferáza (poskytující rezistenci na G418 nebo neomycin), hygromycin-B fosfotransferáza (poskytující rezistenci na hygromycin B), xantin-guanin fosforibozyl- 136 TRANSGENIKA transferáza (poskytující rezistenci na kyselinu mykofenolovou a aminopterin) a puromycin-jV-acetyl transferáza (poskytující rezistenci na puromycin}. Nejčastěji používaným selekčním činidlem při stabilních transfekcích je aminoglyko-sidové anatibiotikům G418, které je svou strukturou příbuzné neomycinu, gentamycinu a kanamycinu. G418 na buňky působí tak, že narušuje funkci ribozomů a tak blokuje proteo-syntézu. Bakteriální enzym aminoglykosid fosfotransferáza, pozměňuje G418 do netoxické formy. Hygromycin B je antibiotikum, které syntetizují bakterie Streptomyces hygrosco-picus. Jeho mechanizmus účinku spočívá rovně Ž v inhibici proteosyntézy jak prokaryotic-kých, tak eukaryotických buněk, kterou vyvolává zablokováním trans lokace. Inaktivaci hygromycinu B zajišťuje enzym hygromycin B fo s fotrans feráza, který je rovněž bakteriálního původu. Metotrexát je analogem dihydrofolálu, který účinně inhibuje jeden z enzymů nutných pro biosyntézu purinů - dihydrofolátreduktázu (DHFR). Zvyšující se hladina metotrexátu může vést k amplifikaci genu kódujícího DHFR s adekvátním zvýšením jeho exprese. Tento systém je proto velmi účinný prostředkem pro zvýšení počtu kopií současně transfekovaných genů. Kyselina mykofenolová specificky inhibuje inosinát dehydrogenázu, tj. enzym, který katalyzuje přeměnu inosinmonofosfátu na xanttnmonofosfát (XMP), což je jeden z kroků biosyntézy guáno s inmono fosfátu. Tento blok lze uvolnit za předpokladu, že buňky mají k dispozici xantin a funkční produkt genu gpt E. coli kódující enzym xantin-guanin fosfori-bozyltransferázu, který konvertuje xantin na XMP, Gen gpt lze proto použít za přítomnosti kysliny mykofenolové jako dominantní selekční marker transfekovaných savčích buněk. Účinnost selekce lze ještě zvýšit přidáním aminopterinu, který blokuje endogenní dráhu biosyntézy purinů. Puromycin, jako analog aminoacyl RNA, způsobuje předčasné ukončení syntézy aminokyselinových řetězců a působí tedy jako inhibitor proteosyntézy. Inhibice puromycinu lze dosáhnout jeho acetylací, kterou zajišťuje puromycin-W-acetyl transferáza. 2. Cílené zásahy do genové exprese Expresi genů lze ovlivnit mnoha různými způsoby, které lze rozdělit na přístupy genetické a epigenetické podle toho, zda jsou, nebo nejsou založeny na zásahu do primární struk-tury DNA. Genetickými přístupy lze posílit a nebo naopak oslabit, případně úplně eliminovat expresi určitého genu např. tím, že se přenosem cizorodého genu (tzv. transgenu) s vlastním promotorem stabilně obohatí genetická výbava dané buňky či organizmu nebo se gen změnou struktury kódující nebo regulační sekvence částečně nebo úplně vyřadí z funkce. Epige-netickými přístupy lze rovněž dosáhnout změny genové exprese, a to buď ovlivněním struktury chromá ti nu, změnou úrovně metylace DNA nebo zásahy do procesu genové exprese regulací stability transkriptu, na úrovni translace nebo na úrovní regulace funkce proteinového produktu. V předchozí částí této kapitoly jsme se věnovali metodickým přístupům pro přenos cizorodé DNA do buněk, které představují genetické zásahy do genové exprese. V následující části se zaměříme na přístupy epigenetické. METYLACE DNA, Jako metylace DNA se označuje DNA metyltransferázami kata-lyzované připojení metylové skupiny na C5 uhlík cytozinu, které vede k vzniku 5-metyl cytozinu v d i nukleotidech CpG. Donorem metylové skupiny je S-adenosyl-L-methionin. Metylací je v genomu obratlovců modifikováno 60-90 % všech CpG. Nemetylované 117 TRANSGENUCA sekvence CpG jsou zastoupeny v tzv, CpG ostrovech, které se nacházejí v oblastech promotorů. Hypermetylace těchto sekvencí způsobuje zastavení přepisu příslušných genů např. tím, že znemožní navázání transkripčních faktorů na cílová místa v DNA. Reaktivace exprese genů umlčených metylací lze dosáhnout působením inhibitorů metylace DNA. Mezi známá demetylační činidla patří např. 5-azacytidin, jeho analog 5-aza-2'-deoxycytidin nebo nově objevený zebularín. Tyto nukleosidové analogy inhibují metylaci DNA tím, že tvoří kova-lentní vazbu s DNA metyltransferázou a tak omezují její aktivitu. Demetylační činidla se používají při reaktivaci genové exprese při léčbě některých nádorových onemocnění. ACETYLACE HISTONŮ. Jako acetylace histonů se označuje přenesení acetylové skupiny z acetylkoenzymu A na lyzin, který je součástí N-koncové části histonů. Acetylace histonů je katalyzována histonovými acetyltransferázami (HAT), deacetylaci histonů kataly-zují histonové deacetylázy (HDAC). Aktuální úroveň acetylace histonů je výsledkem okamžitého vychýlení rovnováhy mezi těmito opačně působícími enzymovými aktivitami. Úroveň acetylace histonů ovlivňuje stmkturu chromatinu. Odstraněním acetylové skupiny získá lyzín pozitivní náboj, kterým zvýší afinitu k polyaniontu DNA a vzniká kompaktní chroma-tin, který není přístupný transkripci. Acetylované histony jsou proto spjaty s transkripčně aktivním chromatínem, zatímco deacetylované histony se nacházejí v inaktivním chromatinu a podílejí se na potlačení transkripce. Zásahy do úrovně acetylace histonů se proto mohou projevit změnou úrovně genové exprese. V terapii nádorových onemocnění nacházejí uplatnění inhibitory HDAC, protože v těchto buňkách bývá rovnováha mezi aktivitami HAT a HDAC Často narušena ve prospěch HDAC, což se projevuje např. umlčením exprese důležitých nádorových supresorových genů. Inhibitory HDAC se podle chemické struktury dělí na deriváty kyseliny hydroxamové (trichostatin A, pyroxamid, oxamftalin, scriptaid), mastné kyseliny (butyrát sodný, fenylbutyrát), cyklické peptidy (depsipeptid, apicidin) nebo benza-midy (MS-275). Některé inhibitory HDAC brání deacetylaci histonů přímou vazbou na HDAC (např. trichostatin A), u jiných není mechanizmus inhibice dosud popsán. PROTISMYSLNÉ NUKLEOVÉ KYSELINY. Do epigenetických přístupů regulace genové exprese patří také využití protismyslných nukleových kyselin, které jsou založeny na sekvenčně specifické hybridizaci nukleových kyselin pro eliminaci specifických tran-skriptů a dosažení cíleného potlačení jejich translace. Tohoto cíle může být dosaženo např. protismyslnými oligonukleotidy, protismyslnou RNA, ribozymy, DNAzymy, návnadovými oligonukleotidy nebo RNA interferencí. Protismyslné oligonukleotidy jsou sekvence DNA nebo peptidové nukleové kyseliny (PNA) dlouhé 6-30 nukleotidů, jejichž inhibiční účinek na genovou expresi vyplývá z vazby na komplementární sekvenci mRNA. Jsou popsány dva mechanizmy, kterými protismyslné oligonukleotidy inhibují genovou expresi: buď spouští degradaci příslušné mRNA buněčnou RNázou H nebo brání její translaci. Protismyslné oligonukleotidy snadno podléhají degradaci nukleázami, a proto byly vytvořeny jejich různě modifikované varianty s cílem dosáhnout zvýšení stability. Nejpoužívanějšími variantami oligonukleotidů jsou fosforothi-oáty, které jsou odolnější k exonukleázám i endonukleázám. Dalšími analogy jsou metylfos-fonáty, fosfoamidové analogy a PNA. PNA je syntetický analog DNA, u kterého je cukr-fosfátová kostra nahrazena pseudopeptidovou kostrou složenou z monomerů N-(2-amino-etyl) glycinu, ke kterým jsou připojeny dusíkaté báze. PNA jsou odolné k nukleázám a pro-teázám a ve srovnám s jinými oligonukleotidy vykazují vyšší specifitu a vysokou afinitu k RNA. PNA nemají elektrický náboj a na komplementární nukleové kyseliny se vážou Wat-son-Crickovým párováním bází pevněji než DNA nebo RNA. PNA, stejně jako některé další modifikované oligonukleotidy typu metylsulfonátů, neaktivují RNázu H a potlačují genovou expresi pouze tím, že blokují translaci daného transkriptu. 118 TRANSGENIKA Protismyslné RNA jsou přepisy tzv. protismyslných genů, které jsou do buněk přeneseny expresními vektory, Na rozdíl od protismyslných oligonukleotidů, které buňky nejčastěji pohlcují endocytózou, vznikají protismyslné RNA až v cílových buňkách transfeko-vaných expresním vektorem obsahujícím pod kontrolou promotoru obráceně orientovanou cDNA. Protismyslná RNA je tedy komplementární k mRNA, která vznikla přepisem cílového endogenu. Vzniklý duplex RNA nemůže být podroben translaci. Mezi katalytické nukleové kyseliny patří ribozymy a DNAzymy. Ribozymy jsou malé molekuly RNA, které katalyzují reakce ovlivňující cukr-fosfátovou kostru nukleové kyseliny. Pro zásahy do genové exprese jsou nejdůležitější ty katalytické nukleové kyseliny, které katalyzují štěpeni mRNA. Specifické rozeznání substrátu zajišťuje párování bází mezi sekvencemi ohraničujícími cílovou fosfodie ste rovu vazbu mRNA a sekvencemi ribozymu, které sousedí s jeho katalytickým jádrem. Po vazbě na cílovou sekvenci, jejím rozštěpem a degradaci dojde k uvolnění enzymu, který může hybridizovat s další molekulou mRNA obsahující stejnou cílovou sekvenci. Tento cyklus vazby a štěpení se opakuje mnohokrát, dokud enzym není sám degradován. Vzhledem k tomu postačuje pro degradaci dané mRNA v buňce relativně nízká koncentrace enzymu. DNAzymy jsou jednořetězcové molekuly DNA, které se skládají z vazebných ramen dlouhých 7-8 nukleotidů a katalytické domény složené z 15 nukleotidů. DNAzymy mohou štěpit jakoukoliv mRNA mezi purínovou a pyri-midinovou bází, jsou odolnější k nukleázám než ribozymy, ale jsou poněkud méně aktivní. Návnadové {„decoy") oligonukleotidy jsou krátké sekvence DNA nebo PNA, které odpovídají určitému endogennímu c/j-elementu přítomnému v regulační oblasti genu, jehož expresi chceme ovlivnit. Tím, že tyto sekvence napodobují vazebné místo na DNA pro daný transkripciu faktor, vyvolávají kompetici mezi endogenním m-elementem a návnadovým oligonukleotidem. Návnadové oligonukleotidy proto blokují vazbu transkripčního faktom na promotory cílových genů, což se projeví inhibicí jejich aktivity. Terapeutické využití těchto oligonukleotidů však komplikují nežádoucí vedlejší účinky, které vyplývají z potlačení funkce transkripčních faktorů nutných pro normální fyziologické procesy a z interference s jinými proteiny. Další problém představuje toxicita a imunogenita některých modifikovaných oligonukleotidů. RNA interference představuje další mechanizmus, kterým lze dosáhnout posttran-skripčního oslabení genové exprese. Podobně jako v předchozích případech využívá se i při RNA interferenci dvouřetězcové RNA, jejíž sekvence odpovídá struktuře cíleného transkrip-tu. Přítomnost této dvouřetězcové RNA v buňkách je obvykle důsledkem transkripce příslušné DNA, která se připraví manipulací in vitro, ligací se spojí s expresním plazmídovým vektorem a do buněk se přenese transfekcí. Transkripcí vzniká jednořetězcová molekula RNA, která se však vzhledem k přítomnosti autokomplementárních sekvencí skládá do podoby dvouřetězcové vlásenky. Tuto strukturu rozeznává nukleáza rodiny RNáz III zvaná „Dicer" a Štěpí ji na krátké fragmenty o velikosti 21-23 nukleotidů, které se označují jako siRNA („small interfering RNA"). V dalším kroku se pak siRNA vážou na nukleázový komplex označovaný jako RISC („RNA-induced silencing complex"). Jeho součástí je helikáza, která pravděpodobně oba řetězce duplexu siRNA odvíjí a jeden z nich - protismyslný řetězec siRNA navádí aktivovaný komplex RISC ke komplementární cílové mRNA, která je následně rozštěpena. Nevýhodou RNA interference je, že není zcela specifická pro určitý gen, ale může ovlivnit i expresi genů příbuzných. Cílené zásahy do genové exprese mechanizmem RNA interference jsou v současné době velmi populární. Další přístupy zaměřené na ovlivnění genové exprese in vivo se zaměřují na její poslední stádium, tj. ovlivnění aktivity již syntetizovaných proteinů. Specifické zablokování funkce určitého buněčného proteinu lze dosáhnout např. přenosem příslušné protilátky do TRANS G ENIKA 119 buňky elektroporací. Jiného mechanizmu využívají metody založené na principu dominantní negativity. Inhíbice aktivity normálního funkčního proteinu lze dosáhnout tehdy, pokud se jeho podjednotky smísí s mutantnímí polypeplidovými podjednotkami, které změní jeho konformaci do neaktivní podoby. Postupuje se např. tak, že se do buněk transfekcí přenese zkrácená varianta genu, jehož funkci chceme eliminovat. Nadbytek mutantního proteinu způsobí inhibici jeho endogenní funkční formy, i za její současné přítomnosti v buňkách, a proto se tento mechanizmus označuje jako dominantně-negativní. Příkladem použití dominant uč negativního přístupu je inhibice transkripcii id t fuk turu konirolovímýcli bnimony. jejichž funkce je závislá na tvorbě dimerů. Za přítomnosti nadbytku zkrácených variant tohoto proteinu lze dosáhnout účinné inhibice tvorby funkčních dimerů a tak cíleně eliminovat funkcí zvoleného proteinu. VIII. Analýza genové exprese Proces exprese genů lze rozdělit do dvou hlavních fází: transkripce (tj. přepisu DNA do RNA) a translace (tj. tvorby proteinu nebo polypeptidu podle templářů mRNA). Pro účely této kapitoly budeme předpokládat, že vznik polypeptidového řetězce je finálním produktem genové exprese. Záměrně zanedbáme posttranslačni modifikace, jako skládání polypeptidu do správné konformace, navázání specifických skupin, apod., jejichž analýza vyžaduje speciální testy aktivity proteinu. První metody zaměřené na studium genové exprese sledovaly přítomnost určité molekuly RNA nebo specifického proteinu v buňkách. Později se objevily nové metody, které umožňovaly komplexně studovat celé soubory produktů genové exprese. Zavedení současných pokročilých metod si dokonce vynutilo i změny v terminologii. Úplný soubor trans krip-tů určité buňky, tkáně nebo organizmu v daném čase se označuje jako transkriptom (podle analogie s termínem genom, který označuje úplný soubor genetické informace). Srovnávací studie transkriptů se proto nazývá transkriptomika. Úplný soubor proteinů přítomných v buňce, tkáni nebo organizmu v daném okamžiku se nazývá proteom a srovnávací analýza kompletní sady proteinů buňky se nazývá proteomika. V následující části budou popsány metody studia mRNA a proteinů. Nejprve se zaměříme na metody analýzy produktů jednotlivých genů a v další části na složitější přístupy, 1. Studium transkripce Metody zaměřené na studium transkripce můžeme rozdělit na metody analyzující množství určitého transkriptů přítomného ve studovaném vzorku v daném čase a na metody, kterými se stanovuje transkripční aktivita spojená s daným genem. Při jakémkoli měření hladiny mRNA v buňce je třeba mít v patrnosti dvě omezení: (1) množství určité molekuly mRNA v buňce je v daném okamžiku nejen důsledkem transkripční aktivity příslušného genu, ale také míry stability transkripm. Gen, který je transkribován relativně slabě, ale jeho transkrípt je stabilní, může poskytnout v daném okamžiku větší množství mRNA než gen, který je transkribován aktivněji, ale poskytuje nestabilní transkript; (2) množství mRNA nemusí nutně korelovat s množstvím jejího proteinového produktu, protože účinnost translace může významně kolísat. NORTHERNOVÝ PŘENOS. Nejstarší metody detekce specifické mRNA jsou založeny na její hybridizaci se specifickými značenými sondami. Nejběžnější z nich se označuje jako northernový přenos. Northernový přenos zahrnuje elektroforetickou separaci molekul RNA purifikovaných z buněk, jejich následnou imobilizaci na membráně a hybridizaci se specifickou sondou (obr, 77). Tento postup umožňuje detekovat přítomnost specifické mRNA a odhadnout její velikost za předpokladu, že sonda je dostatečně specifická. Jestliže provedeme pečlivou kalibraci, např. na základě srovnání se sílou hybridizačního signálu pomocného genu o známé úrovni exprese, můžeme norťheraovým přenosem získat informaci o relativní úrovni exprese daného genu (přesněji o relativním množství daného transkriptů) v buňce, Např. z obr. 77 je zřejmé, že vzorek B poskytl slabší signál než vzorek A, protože ve vzorku B je přítomno mnohem méně specifické mRNA než ve vzoTku A. Tento závěr však můžeme učinit pouze za předpokladu, že nižší úroveň signálu není důsledkem zvýšené 122 ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE degradace m RNA ve vzorku B. Ve vzorku C nebyla exprese daného genu zaznamenána \ Liboc, vzorek D obsahuje hledané sekvence na dvou různých molekulách mRNA. etekíroforéza RNA v denaturujícim agarózovém gelu - Obr. 77 Northernový přenos Technika northemového přenosu má dvě hlavní slabiny, které omezují jeho použití: (1) poskytuje možnost posoudit pouze relativní intenzím signálu, ale nemůže poskytnout údaje o absolutním množství dane mRNA; (2) citlivost metody není vysoká a vyžaduje použití poměrně vysokých množství RNA {obvykle alespoň 1 mikrogram mRNA nebo 10 mik-rogramů celkové RNA). Získání lakových množství výchozího materiálu nemusí být vždy snadné. Např. pokud studujeme expresi specifických genů v patogenní bakterii, která roste v infikovaném organizmu nebo chceme studovat mRNA izolovanou z materiálu získaného biopsií, může být velmi obtížné získat dostatečné množství mRNA pro provedení northemového přenosu. Výhodou northemového přenosu je (1) nižší riziko vzniku falešných artefaktů než u metod založených na PCR; (2) možnost určení velikosti specifického transkriptu a určení přítomnosti různých transkriptu daného genu. Např. na obr. 77 vidíme u vzorku D přítomnost transkriptu o nižší molekulové hmotnosti než u vzorků A a B. Právě tento fakt je velmi důležitý, vezmeme-li v úvahu, že z výsledků analýzy lidského genomu vyplývá, že počet genů je podstatně nižší než počet genových produktů. Toto pozorování lze vysvětlit existencí alternativního sestřihu, který se uplatňuje při zpracování transkriptu mnohých genů. Mezi důležité techniky, které analýzu alternativního sestřihu umožňují, patří právě northernový přenos. TEST OCHRANY PŘED ÚČINKEM RNÁZY („RNASE PROTECTION ASSAY", RPA). Zatímco hybridizace se u northemového přenosu provádí na filtru (membráně), test ochrany před RNázami je založen na hybridizaci v roztoku. Jeho smyslem je identifikace určité molekuly RNA ve směsi různých molekul RNA izolovaných z daného biologického vzorku. Jako sonda se používá značená RNA v protismyslné orientaci. Tento typ sondy může být jednoduše připraven prostřednictvím plazmidových klonovacích vektorů, např. typu pGEM, které obsahuji vazebná místa pro RNA-polymerázy (T3, T7 a/nebo SP6). V příkladě znázorněném na obr. 78 byl gen (případně jen jeho část) začleněn do vektoru mezi dva opačně orientované promotory. Po přidáni RXA-polyttK'ľá/y T7 a substrátů (NTP) bude vznikat normální kódující transkript daného genu. Protože tento gen je zároveň ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE 123 v obrácené orientaci vzhledem k promotoru SP6, bude jej RNA-polymeráza SP6 přepisovat v opačném směru, tj. bude kopírovat druhý řetězec DNA za vzniku protismyslného („anti-sense") tran skřip tu, který nebude mít kódující funkci. Produkty transkripce téhož genu RNA--polymerázou T7 a RNA-polymerázou SP6 budou komplementární a schopné vzájemné hybridizace. --——, „ - normální kódující řetězec RNA "protismyslný" nekódující řetězec RNA Obr. 78 Tvorba normální a „protismyslné" RNA obousměrnou transkripci sekvence DNA Po přidání značené sondy RNA, do vzorku všech molekul mRNA izolovaných z buněk, dojde k hybridizaci a tvorbě dvouřetězcové RNA pouze mezi sondou a komplementární hledanou sekvencí. Nespecifické molekuly mRNA zůstanou v jednořetězcové podobě. Následně lze všechny jednořetězcové mRNA rozložit RNázou, zatímco dvouřetězcové hybridní molekuly RNA budou před účinkem RNázy chráněny (obr. 79). Po dokončení štěpení RNázou se hybridizační směs nanese na polyakrylamidový gel, který se po elektroforéze vysuší a přiloží k citlivé vrstvě filmu, kde se přítomnost značené sondy navázané na cílovou sekvenci zviditelní. "protismyslná" RNA sonda i i i i i i i cílová RNA "protismyslná" RNA sonda i i i i i i i nespecifická RNA —i i ,i t \ i i— \ i p i i i i ' ■ ■ ' ' ' ' dvouřetězcové RNA je chráněná i r i i i i i hybridizace nenastává i i i i i i i RNáza jednořetězcová RNA -je degradována eíektroforetogram Obr. 79 Test ochrany před účinkem RNázy 124 ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE Popsaná metoda má některé výhody ve srovnání s northemovým přenosem. Je citlivější a umožňuje získat alespoň přibližnou představu o relativním zastoupení dané molekuly ve vzorku, Navíc toleruje částečnou degradaci vzorků RNA, protože pro úspěšnou hybridiza-ci postačuje, aby jen část molekul RNA bylo intaktních. Z jiného hlediska je tato výhoda zároveň nevýhodou, protože na rozdíl od northernového přenosu tento test neumožňuje určení velikosti transkriptu. Pohyblivost proužku, který po elektroforéze identifikujeme autoradi-ografií, je do značné míry ovlivněn velikostí sondy. Další nevýhodou je, že příprava sondy je pracnější než u northernového přenosu. Přes tyto nevýhody je tato metoda velmi atraktivní pro studium exprese určitých genů. REVERZNĚ TRANSKRIPČNÍ POLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE (RT-PCR). Mnohem citlivější přístup detekce specifických molekul mRNA je založen na využití polymerázové řetězové reakce (kapitola VI) ve variantě, která umožňuje jejich specifickou amplífikaci. Vzhledem k tomu, že tento přístup vyžaduje kopírování mRNA do cDNA zpětnou (reverzní) transkriptázou, označuje se jako reverzně trankripční PCR (RT-PCR). Citlivost této metody je tak vysoká, že umožňuje detekci specifické mRNA v jediné buňce. Právě v možnosti detekce takových molekul mRNA, které se v buňce vyskytují ve velmi nízkých hladinách a v možnosti analýzy genové exprese u buněk, které je obtížné získat ve větších počtech, spočívá hlavní výhoda této metody. Vysoká citlivost RT-PCR však přináší ještě další výhody. Pokud nás zajímá tkáňově specifická exprese nebo exprese genů v buňkách za různých fyziologických podmínek, je potřeba zajistit, aby všechny buňky, ze kterých extrahujeme mRNA, exprimovaly stejný soubor genů. V případě northernového přenosu musíme pracovat s relativně velkým množstvím mRNA extrahovaným z velkého počtu buněk a tato buněčná populace může být heterogenní. RT-PCR vyžaduje mnohem méně mRNA a tím také nižší počet buněk. Je proto pravděpodobnější, že všechny buňky jsou v obdobném fyziologickém stavu a získané profily genové transkripce budou více odpovídat realitě, Konvenční RT-PCR má svá omezení. Patří mezi ně obtížnost získání kvantitativních údajů o účinnosti transkripce. Nelze získat spolehlivé výsledky jednoduchou amplífikaci templářů a měřením množství získaného produktu, protože neexistuje jednoduchý a spolehlivý vztah mezi počátečním množstvím templátu a množstvím vytvořeného produktu, pokud polymerázová řetězový reakce neprobíhá opravdu exponenciálně. Exponenciální průběh reakce je narušen v okamžiku, kdy se nedostává některé z reagencií. Tento problém lze do jisté míry překonat přidáním známého množství druhého templátu, který je téměř stejný jako templát původní, amplifikovatelný identickou sadou primerů, ale odlišitelný po gelové elektroforéze. Obvykle se tento pomocný templát připravuje tak, že se do plazmidového vektoru nakloňuje produkt PCR a delecí se jeho malá Část odstraní. Přidáním známého množství modifikovaného templátu DNA do PCR a porovnáním relativních množství obou vzniklých amplifikátů lze dosáhnout mnohem větší přesnosti při kvantifikaci produktu. V praxi však tento přístup byl v poslední době nahrazen přesnější a jednodušší metodou PCR v reálném Čase. RT-PCR V REÁLNÉM ČASE. Jak je zmíněno výše, není spolehlivá korelace mezi počátečním množstvím templátu a konečným množství produktu PCR při pevném počtu cyklů. Jako spolehlivější se jeví vztah mezi množstvím templám a počtem amplifikačních cyklů nutných pro vytvoření detekovatelného produktu. Teoreticky by bylo možné sestavit různé amplifikační reakce, zastavit je po různém počtu cyklů a analyzovat, které reakce poskytly detekovatelný produkt. Tento postup by byl pracný a nákladný. Situace by se však podstatně zjednodušila, pokud by existoval způsob jak detekovat přítomnost produktu, aniž by se amplifikační reakce musely přerušovat. Právě to je základem PCR v reálném čase. ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE 125 Pro provedení PCR v reálném čase je proto nutné mít způsob, jak zjistit přítomnost produktu reakce v okamžiku jeho vzniku, a nikoliv až po zastavení reakce a provedení gelo-vé elektroforézy. Nejjednodussím způsobem jak tento problém vyřešit je přidání takového barviva do směsi PCR, které fluoreskuje po navázání na dvouřetězcovou DNA. Tento přístup však má své slabiny spočívající v tvorbě falešných signálů, jakmile se barvivo naváže na chybný produkt reakce. Vyšší specifity lze proto dosáhnout použitím sond, které se vážou pouze na specifický produkt. Pokud se PCR provádí ve speciálním přístroji, který nejen umožňuje provádět cyklické změny teplot, ale také detekci fluorescence, lze monitorovat postup PCR v reálném čase -vznik produktu v průběhu PCR. Nejprve je templát jednořetězcový a proto přístroj nezaznamená žádný signál. Při pokračující amplifikaci se vytvoří dvouřetězcový produkt, který emituje fluorescenční signál (obr. 80). Za předpokladu, že se vytvoří adekvátní množství produktu a hladina fluorescence je dostatečná, přístroj signál zachytí. V průběhu dalších cyklů se mÍTa emitované fluorescence bude dále zvyšovat. Extrapolací vzniklé křivky zpět k nule lze určit počet cyklů nutných pro vytvoření detekovatelného množství produktu. Tato hodnota, označovaná jako CT, závisí na prvotním množství templátu: čím je vyšší množství prvotního templátu, tím je nižší hodnota Cr. Na obr. 88 vzorek A poskytuje detekovatelný signál po 20 cyklech a jeho hodnota Cj je proto 20. Tomu odpovídá větší množství templátu než u vzorků B (CT=22) a C (CT=25). Obr. 80 PCR v reálném čase Při srovnávání hladiny mRNA v různých vzorcích je třeba zajistit, aby množství vstupního materiálu (počet buněk, celkové množství mRNA) bylo vždy stejné. Standardizace podle množství celkové RNA není zcela spolehlivé, protože obsah ribozomáíní RNA v buňce může velmi kolísat. NejpřesnějŠím způsobem standardizace reakcí je použití paralelní RT-PCR pro amplifikaci pomocného genu, o kterém je známo, že se exprimuje konstitutivně, nebo alespoň nemění míru své exprese za testovaných podmínek. Tímto způsobem pak lze vymezit rozdíly v úrovni exprese určitých genů za různých podmínek. RT-PCR v reálném čase je rovněž důležitá metoda pro kvantitativní detekci určitých sekvencí DNA a pro identifikaci specifických změn v sekvenci DNA včetně takových, které mají diagnostický význam v medicíně. 126 ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE HYBRÍDIZACE IN SITU. Hybridizace in situ představuje vedle hybridizace prováděné v roztoku a na membránách třetí variantu této metody, Hledaná sekvence (DNA nebo RNA) je v tomto případě imobilizována uvnitř buňky v mikroskopickém preparátu. V případě, že cílovou sekvencí je DNA, je obvykle smyslem této metody chromozómami mapování genů. Po hybridízaci značené sondy s buněčnými metafázovými chromozomy a specifickém barvení lze sondou lokalizovat hledaný gen do určité oblasti určitého chromozomu. V případě, že cílovou sekvencí je RNA, lze touto metodou např. identifikovat v tkáňovém řezu buňky, které aktivně transkribuj í určitý gen. Hybridizaci in situ lze rovněž využít pro detekci virů. V tomto případě je cílem buď DNA nebo RNA v závislosti na typu víru. Northemový přenos, test ochrany před RNázou a RT-PCR nám umožňují zjistit v jaké tkáni se exprimuje daná mRNA. Hybridizaci in situ lze získat ještě přesnější informaci o tom, která buňka exprimuje danou mRNA. V tom spočívá její hlavní výhoda. Naopak nevýhodou této metody je obtížnost získání kvantitativních údajů o míře exprese daného genu. TEST PRODLOUŽENÍ PR1MERU „PRIMER EXTENSION ASSAY". Při studiu genové exprese může být zajímavé nejen zjištěni do jaké míry se tvoří specifický tran-skrípt, ale také, kde přesně začíná a končí. Analýza 3'-konců eukaryotických molekul mRNA obvykle není problém. Většina cDNA knihoven se připravuje s použitím primerů otigo(dT), které se vážou na poly-A úseky mRNA a tím je zajištěno, že tato část molekuly mRNA je pro syntézu cDNA vždy využita. Naopak 5'-kone c mRNA nebývá vždy přepsán do cDNA. Zpětná transkripce nemusí proběhnout až na samotný 5 '-konec templátu mRNA. Důvodem může být částečná degradace templátu, přítomnost sekundárních struktur nebo proteinů, které RNA vážou a zastavují zpětnou transkríptázu. Test prodloužení primeru se používá pro přesné mapování 5'-konce mRNA. Ze vzorku tkáně nebo suspenze buněk, o kterých je známo, že daný gen účinně exprímují, se izoluje mRNA. Získaná směs různých molekul mRNA se smísí s radioaktivně značenými oligonukleotidy s funkcí primeru, které jsou specifické pro studovaný transkript a zároveň komplementární k oblasti sousedící s 5'-koncem dané sekvence. Zpětná transkripce pak zajistí prodloužení primeru až k samému 5'-konci mRNA, kde polymerační reakce automaticky skončí. Vzniklý radioaktivní řetězec c DNA se nanese na sekvenační gel, na který se v paralelních drahách nanesou také produkty sekvenaČních reakcí stejného genu, které vycházejí ze stejného primeru. Tímto způsobem lze identifikovat začátek transkripce s přesností na jeden nukleotid (obr. 81). Pokud se použijí fluorescentní značky, lze popsanou techniku přizpůsobit pro automatické sekvencování. 2. Srovnání transkriptomů Metody typu northernového přenosu jsou vhodné pro srovnání expresních profilů omezeného počtu genů. Proto se northemový přenos úspěšně používal a používá pro identifikaci genů v rámci skupiny již dříve známých kandidátních genů, které zodpovídají za určité choroby. Obvyklým badatelským cílem j e identifikace (1) genů, které se exprimují v jednom organizmu a ne v druhém, (2) genů s tkáňově specifickou expresí nebo (3) genů, jejichž exprese se mění v závis losa na vnějších podmínkách. Pro srovnání molekul mRNA expri-mováných v různých vzorcích bylo vypracováno několik technik, které jsou popsány v následujících odstavcích. Tyto metody mohou pomoci zodpovědět některé velmi důležité otázky, například určit, které geny se v různé míře exprimují ve zdravé a nemocné tkáni a mohou se podílet na vzniku dané choroby. Některé z těchto metod byly překonány zavedením Čipo-vých hybridizačních technik (DNA-array), ale jiné jsou stále široce používány. ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE 127 5' 3' 1)111 primer značený na 5'koncl i komplementární sekvence 5'. 11 11 in li 111111111 11111111 m 1111 3' 5" hybridizace primem se specifickými molekulami RNA 1 I I 1 I I » I I I I I I 1 11 II I I M I 11 I I M M L,----------LUXU^t I-1 87 nt prodlouženi primem k 5 konci mRNA zpětnou transkriptázou 1 prodlouženy G A T C primer 87 nt analýza sekvence značené cDNA studovaného genu velikost proužku udává vzdálenost 5 konce primeru od místa začátku transkripce nenavázaný primer Obr. 81 Určení 5'-konce mRNA metodou prodloužení primeru DIFERENCIÁLNÍ SKRÍNINK. Nejednodušší metodou identifikace genů, které se exprimují s odlišnou účinností, je diferenciální skrínink genové knihovny (obr. 82). Skrínink se provádí na dvou identických filtrech, obsahujících otisky DNA genové knihovny, které byly získány buď opakovaným přenosem ze stejné misky nebo přenosem ze dvou stejných misek vzniklých „razítkováním". Každá z těchto identických knihoven je podrobena skrínin-ku jinou sondou. První sonda se připraví zpětnou transkripcí směsi mRNA izolované z jednoho porovnávaného vzorku a druhá se připraví stejným způsobem z druhého porovnávaného vzorku. Přítomnost radioaktivně značených nukleotidů zajistí, že obě sondy budou značené. Klony, které vykazují po hybridizaci pozitivní signál s jednou, ale ne s druhou sondou, obsahují potenciální geny s odlišnou úrovní exprese. Tento postup předpokládá, že v jednom vzorku specifický transkript není vůbec přítomen (vzorek A na obr. 82). Takový 128 ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE předpoklad však často není správný, protože exprese genů obvykle nebývá úplně vypnuta. Pokud je v jednom vzorku větší a ve druhém menší množství dané molekuly mRNA, bude se po hybridizaci lišit intenzita příslušných skvrn. identifikace bodů přítomných na B a nepřítomných na A a izolace odpovídajících klonů Obr. 82 Diferenciální skrínink genové knihovny SUBTRAKTIVNÍ HYBRIDIZACE. Alternativní postup spočívá ve změně sondy, ze které jsou odstraněny sekvence shodné pro oba testované vzorky. Tento postup se nazývá subtraktivní hybridizace (obr. 83). Srovnáváme dva vzorky, z nichž jeden obsahuje hledaný transkript (tzv. „tester") a druhý nikoliv (tzv. „driver"). Předpokládejme, že „driver" odpovídá nemocným buňkám a naším úmyslem je nalézt gen, který se v těchto buňkách nemůže exprimovat. „Tester" odpovídá buňkám zdravým. Vlastní postup je možný v několika variantách. V příkladu znázorněném na obr. 83 je prvním krokem vytvoření cDNA podle templátu mRNA obou vzorků. cDNA vzorku označeného jako „driver" se označí biotinem (pro přehlednost je na obr. 83 použito koncové značení). Vzhledem k tomu, že biotin má silnou afinitu k streptavidinu, mohou být všechny molekuly s navázaným biotinem snadno odstraněny. V dalším kroku se smísí nadbytek cDNA „driveru" značené biotinem s cDNA „testem" a provede se jejich denaturace a následná renaturace. Všechny molekuly cDNA „testeru", které jsou komplementární cDNA „drivem" vytvoří hybridní molekuly, které mohou být vzhledem k přítomnosti biotinem označeného řetězce cDNA „driveru" odstraněny streptavidinem. Zároveň se tímto krokem odstraní dvouřetězcová DNA vzniklá renaturací řetězců cDNA „driveru". Směs cDNA, která není označena biotinem a zůstává ve vzorku, je obohacena o ty molekuly cDNA „testeru", které jsou jedinečné, tj. nejsou přítomny v populaci cDNA „driveru". Tuto směs lze následně použít jako sondu pro skrínink genové knihovny. Nevýhodou tohoto postupu je, že vzácné transkripty, které mohou být důležité, pravděpodobně nepo- ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE 129 skytnou dostatečně síiný signál, abychom příslušné geny mohli najit. Vhodným přístupem, který tento problém alespoň Částečně řeší, je vytvoření subtraktivní knihovny cDNA. V tomto případě se prostřednictvím adaptorů vkládá cDNA „testeru11 do vektoru ligací. Skrínink knihovny pak lze provádět opakovaně, např. systematickou analýzou všech klonů. Tato metoda bylo úspěšně použita pro identifikaci genů spojených s určitými chorobami. Její nevýhodou je, že vyžaduje relativně velká množství mRNA. Tuto slabinu částečně odstraňují metody kombinující přístupy subtraktivní bybridízace a PCR. mRNA "driveru" mRNA "testeru" WWVWVWNA biotin komplex "driver-drivef" Ol i ľ I M 11111J11111111J M M JIL11J i I i M M.........,111 komplex "driver-teste r" ......in...........MIH n m m i n...........n i n komplex "lester-tester" nimm 11 s i m nimi s n I I I M I M 1 í Ji.1 i.U .111.111.1 i,U st reptá vid irr —(jfy ......J n 11 MII M.....HtÄ HIHI II1111 IMII.M III UlQ streptavidin 1111111111JI M 11 M I M ! 11 i I i I I I M i 1 I j IJ I M M I 1J il I ľ I klonovéni jedinečné cDNA "testenj" sekvence "driveru'1 se odstráni prostřednictvím streptavidinu Obr. 83 Subtraktivní hybrid izace Mezi ně patří technika nazvaná ANALÝZA REPREZENTATIVNÍCH ROZDÍLŮ (RDA). U varianty RDA, která je ilustrována na obr. 84, se nejprve ke koncům cDNA „driveru'* a „testeru" připojí ligací linke ry, které budou představovat místa pro vazbu primerů při PCR. Po odstranění původních linkerů z produktu PCR se použije jiný pár linkerů, který se připojí pouze k produktu PCR „testeru" a ne „driveru". Po smísení a hybridizact velkého nadbytku produktu amplifíkace „driveru" s produktem „testeru" budou vznikat hybridní molekuly z těch jednořetězců (obou vzorků), které jsou vzájemně komplementární. Pouze jedinečné řetězce „testeru", které nemohou hybridizovat s nadbytkem DNA „driveru" budou tvořit specifické hybridy „tesler-tester", které lze amp li fíková t následnou PCR, kdy se jako primery použijí sekvence komplementární ke specifickým linkerů m „testeru". Amplifíkace hybridů „driver-driver" není možná, protože temp lát postrádá místa pro vazbu těchto primerů. Hybridní molekuly „driver-tester" mají nespárované konce, protože linkery byly přidány 130 ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE -,- RNA "testeru" RNA "driveru" zpětná transkripce -1 1 1 cDNA cONA 1 ligace linkerů a amplifikace 1 I Ml I I I III III I I I minim miitiiiinmiiiiii..... TI 111 H M H 11 1111! I M I U I ■ I I slitin.......nm.....in odštěpení íínkerů I I 1 II11IiIII M III i I H ľ I I I I Hlinu......I 11 l i l HIHI lil IIIIIIHH IM Nil H I H I 111 11III H 11 H H H I I přidáni jiných linkerů pouze k "testeru" I II I IIIIiIIIIIIIIiI!1 M I i I -"inu........I.....11111 = n ni ni rn i n n i n n m n U.ltUU.lU Ml H I H H I H I 1 smíšeni, denaturace, renaturace jedinečná cDNA "testem" I I i M I m 11 M I I I I I ! I 11 I I I i I : i.......U U I I U.....U I I I : I I I I 11 H M H I I I 11 H H H 1 H V 1111 u n n u 11111 umí 111 ■ ;; hybridní moiekuly "driver-tester1" TI 11111 M 111II11 M I I I I H ITTT'í HIUIHIIIHIMIUI1IMI1 odstránení jednoŕetézových presahu nukteázou M i n e11 I M I H 11 I i I M I M 11 U.L1.I..L.111.1.1 M I M ' M I Mi I 11 amplifikace PCR X amplifikace neprobíhá soubor jedinečných produktů amplifikace "testerů" Obr. 84 Analýza reprezentativních rozdílu pouze k „testeru" a mohou být odstraněny nukleázou specifickou pro jednořetězcovou DNA. Amplifikace ani těchto molekul polymerázovou řetězovou reakcí proto nebude možná. DIFERENCIÁLNÍ DISPLAY. Diferenciální display je metoda založená na PCR, kterou lze srovnat dvě populace cDNA. Jeden z primerů je připraven tak, aby se vázal na poly-A konec mRNA a druhý tak, aby se vázal na mRNA náhodně. Polymerázovou řetězovou reakcí prováděnou při velmi nízké připojovací teplotě se amplifikuje část molekul cDNA ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE 131 přítomných ve vzorku, které se podrobí elektroforéze v polyakrylamidovém gelu. Pokud se provedou polymerázové řetězové reakce za stejných podmínek u dvou různých vzorků, lze po elektroforéze nalézt ty druhy cDNA, které se u obou vzorků vyskytují v různé míře, vyjmout je z gelu, znovu amplifikovat a sekvencovat. Pokud se jedná o dosud nepopsané sekvence, lze identifikaci genu provést skríninkem knihovny nebo technikou RACE (str. 91). Přítomnost těchto druhů cDNA ve směsi amplifikovaných molekul je náhodná a vyplývá ze stupně příbuznosti její sekvence se sekvencí primerů, tj. samotná metoda nezajistí preferenční amplifikaci transkriptů syntetizovaných ve srovnávaných vzorcích s různou účinností. Proto je třeba pracovat s různými kombinacemi primerů a je málo pravděpodobné, že by tento typ analýzy mohl poskytnou úplný seznam diferenciálně exprimovaných genů. Nicméně tato metoda má své specifické výhody: vychází z malého množství výchozího materiálu a nevylučuje zachycení i velmi vzácných transkriptů. V současné době se však častěji používá RDA nebo technologie DNA čipů. METODY ZALOŽENÉ NA TECHNOLOGII DNA ČIPŮ („DNA MICRO-ARRAYS"). Techniky typu subtraktivní hybridizace umožnily hledání produktů genů s odlišnou mírou exprese. Častým cílem je nalezení genu, jehož aberantní exprese přimo souvisí se vznikem určité choroby. Northernový přenos nebo RT-PCR mohou být užitečné při studiu exprese jednoho nebo několika málo genů splňujících daná kritéria, ale tyto metody nejsou vhodné pro analýzu velkého počtu genů. Ještě důležitější je fakt, že jejich použití je omezeno pouze na geny, které jsou již popsány. Vzhledem k rychlému vývoji sekvenač-nich technik je možné si klást nejen specifické, ale také globálnější otázky, jako např. jaké je celkové spektrum genů exprimovaných za určitých podmínek a ne za jiných. K tomuto problému můžeme přistoupit použitím metod založených na DNA čipech („DNA microarrays"), které byly popsány v kapitole věnované metodám analýzy genomu. V tomto případě se sondy DNA, reprezentující část nebo celý genom daného organizmu, imobilizují kovalentní vazbou na skleněnou destičku a použijí k hybridizaci s fluorescenčně značenou cDNA izolovanou z kontrolního vzorku (zelená fluorescenční značka) a zároveň ze vzorku testovaného (červená fluorescenční značka). Imobílizace sond na podložní sklíčko se provádí ve speciálním zařízení tak, aby vazba vydržela vysoké teploty nutné pro následnou hybridizaci. Detekci fluorescence po hybridizaci zajišťuje konfokální laserový skener, spojený s počítačem, který provede analýzu dat. Sondy, které hybridizují s cDNA a fluoreskuj í červeně, reprezentují geny, které jsou specificky exprimovány v testovaném vzorku. Sondy, které hybridizují s cDNA a fluoreskují zeleně, reprezentují geny, které se specificky expri-mují v kontrolním vzorku. Sondy, které hybridizují s cDNA a fluoreskují žlutě, reprezentují geny, které se exprimují v kontrolním i testovaném vzorku. Protože lze připravit mnoho identických kopií destiček s imobilizovanou sondou, je možné tuto techniku použit pro testování přítomnosti mnoha specifických molekul cDNA v buňkách rostoucích za různých podmínek. Z koncepčního hlediska se popsaný přístup neliší od diferenciálního skrininku. Subtraktivní knihovny cDNA v plazmidových vektorech byly často pracně testovány klon za klonem. Nástup robotizace a elektronické analýzy obrazu nejen usnadnil technickou přípravu DNA čipů, ale také eliminoval požadavek na přípravu čipů pouze pro nevelkou populaci obzvlášť zajímavých transkriptů. Znalost úplné sekvence genomu daného organizmu navíc umožňuje vytvořit čipy z malých fragmentů DNA (buď syntetizovaných nebo amplifikovaných PCR), kterými lze identifikovat všechny možné otevřené čtecí rámce. Čipy pro úplný genom jsou v současné době k dispozici pro některé bakteriální kmeny a prvoky. Vedle technologie DNA čipů založených na hybridizacích molekul DNA-DNA nebo DNA-RNA, existují rovněž proteinové čipy („protein microarrays"), vypracované pro analýzu meziproteino-vých interakcí. 132 ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE Čipy EST („expressed sequence tag"). Nejjednodušším způsobem, jak vytvořit cDNA „čip", je vyset knihovnu klonů cDNA určité tkané a testovat klony jeden po druhém. Tento přistup má své nevýhody: (1) jeho použitelnost je omezena pouze pro původní tkáň, protože v jiných tkáních mohou expresní profily vypadat jinak; (2) i když se knihovna cDNA zbaví sekvencí r RNA a tRNA tím, že se založí na matrici poly-A-mRNA, bude stále obsahovat velké množství opakujících se sekvencí. Je to způsobené tím, že na rozdíl od genomové knihovny je frekvence daného genu v knihovní cDNA dána mírou jeho exprese. V knihovně cDNA jsou proto ve velké převaze strukturní geny, provozní („housekeeping") geny a geny specifické pro danou tkáň. Oba zmíněné nedostatky řeší čipy EST. Klony EST jsou klony cDNA z knihoven buněk různých tkání, které byly testovány jeden po druhém s využitím robotu. Každá z těchto molekul cDNA byla charakterizována jednorázovým sekvencováním od jednoho konce, takže vznikla databáze koncových značek cDNA, která je archivována a dostupná v GenBank při hledání sekvencí příbuzných genu, který studujeme. Systematickou počítačovou analýzou byly nalezeny jedinečné klony cDNA, které lze využít pro vytvoření čipů cDNA zbavených nadbytečných opakujících se sekvencí. Nakapáním těchto vzorků na membránu (tzv. „DNA-macroarray" , makročip) nebo sklíčko (tzv. „DNA-rnicroarray" , mikročip) vzniká systém umožňující současné studium většiny genů lidského, myšího a krysího genomu. Pokud se připraví dva identické čipy, které se použijí ke skríninku značených populací cDNA „driveru" a „testeru", lze jednorázovým experimentem získat více výsledků než několikaměsíční prací technikou „diferenciální display". Využití PCR pro přípravu čipů. Pro bakterie sice nejsou k dispozici Čipy EST, ale znalost úplné sekvence genomu několika bakterií umožňuje použít ještě účinnější systém přípravy čipů. Nejprve se s využitím počítačů určí všechny otevřené Čtecí rámce dosahující alespoň určité minimální velikosti, které reprezentují předpokládané geny. Pro každý z nich se připraví dvojice primerů, prostřednictvím kterých lze amplifikovat část tohoto genu o vhodné velikosti. Amplifikované fragmenty DNA se využijí pro přípravu makročipů nebo mikroČipů. Charakteristika hybridizací prováděných na čipech. Způsob provedeni hybridiza-ce na Čipech je opačný ve srovnání s klasickou hybridizací typu Southemova přenosu. U klasických technik je studovaná DNA (nebo RNA) imobilizována na filtr a zde podrobena hybridizaci se specifickou značenou sondou. U makro- a mikroČipů jsou k pevnému podkladu upevněny neznačené specifické fragmenty (sondy) a ty jsou hybridizovány se značenou cílovou molekulou. Technologie čipů je velmi nákladná. Nejenže vyžaduje pořízení nákladné přístrojové techniky, ale také syntéza velkého počtu primerů i vlastní provedení PCR, jsou drahé. Jakmile je však příprava Čipu ukončena, jsou další kroky podstatně levnější. Je výhodné, že lze snadno připravit mnoho kopií téhož čipu a že provedení hybridizace a odečtení výsledků je podstatně levnější. Zvláště v případě makročipů je vyhodnocení výsledků jednoduché, protože není nutné speciální zařízení pro analýzu obrazu. Ve všech variantách diferenciální a subtraktivní hybridizace a skríninku se objevují artefakty a nepřesnosti. Je pravděpodobné, že ryto metody nikdy zcela nenahradí klasické hybridizační metody, které budou stále nutné pro jednoznačné potvrzení údajů získaných technologií čipů a pro získání informací o odpovídajících transkriptech. ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE 133 3. Analýza promotorů a interakcí protein - DNA f r REPORTÉRSKE GENY. V mnoha případech pri analýze genové exprese selhávají i nej propracovanější metodické prístupy, které byly popsány v předchozí kapitole. Například při studiu buněčné diferenciace v mnohobuněčném organizmu si můžeme klást otázku, ve kterých buňkách nebo tkáních se určité geny začínají exprimovat, a ve které fázi vývoje k tomuto dochází. Jednou z možností, jak tomuto problému přistoupit, je využít reportérskych genii, které se využívají nejen při analýze promotorů, ale také transkripčních faktorů a při tvorbě transgenních organizmů. Konstrukce reportérskych genů vychází z technologie rekombinantní DNA. Cílem je vytvořit takový konstrukt, ve kterém je sekvence DNA pocházející z promotorové oblasti určitého genu (obsahující kromě promotoru také potencia ní regulační sekvence), uměle spojena s jiným genem, který kóduje snadno detekovatelný produkt - reportér. Mezi obvykle používané reportéry patří p-galaktozidáza (detekovatelná chromogenním nebo nuorogenním substrátem), zelený fluorescenční protein (GFP, přirozeně fluoreskující protein izolovaný z medúzy) a lucíferáza ze světlušek (jehož enzymovou aktivitu lze detekovat podle emitovaného viditelného světla). Pokud se reportérsky konstrukt vnese do organizmu, lze podle míry exprese reportérskeho genu usuzovat na míru exprese genu, jehož promotorové sekvence jsou reportérskemu genu předřazeny, např. v průběhu diferenciace. Analogicky lze technologie reportérskych genů využít pro studium úrovně transkripce vybraných genů v buňkách nebo tkáních vystavených různým podmínkám. Dokonce i v případě, že exprese je aktivována pouze přechodně, takže detekce mRNA je ztížena, lze vzhledem k větší stabilitě reportérskeho genu určit okamžik, ve kterém je exprese aktivována. LOKALIZACE PROMOTORU. Reportérske geny se významně uplatňují při lokalizaci sekvencí, které jsou nutné pro aktivitu promotoru a pro studium regulačních funkcí oblastí DNA umístěných proti proudu transkripce od vlastního promotoru. Při identifikací promotoru daného genu lze postupovat tak, že se klonují fragmenty DNA předcházející místu počátku transkripce do vektoru nesoucího reportérsky gen postrádající promotor. Bezpro-motorový reportér (tzv. promotorova sonda) je možno rovněž využít k vyhledávání promotorů s určitou funkcí v rámci celého genomu. V tomto případě se vytvoří knihovna náhodných fragmentů DNA v bezpromotorovém reportéru, ze které se vyberou ty klony, které vykazují expresi reportéru za daných podmínek. Cíle přístupů využívajících promotorových sond jsou podobné těm, které si kladou studie genové exprese založené na technologii mikročipů. Jediný rozdíl mezi oběma přístupy spočívá v cílové molekule: zatímco mikročipy studují hladiny mRNA, promotorové sondy testují aktivitu promotoru. Oba přístupy se v určitém smyslu doplňují. Mikročipy slouží k přímé identifikaci zřetelně se exprímujících genů, zatímco promotorové sondy jsou úspěšnější pří detekci přechodné a slabé aktivity promotorů, Promotorové sondy maji navíc výhodu v tom, že vycházejí z náhodných fragmentů DNA a jejich použití nevyžaduje znalost sekvence genomu. Jakmile se získají pozitivní klony, je však nutné daný fragment identifikovat. Vážnou nevýhodou reportérskych systémů je, že nelze vyloučit možnost, že fragmenty DNA umístěné mimo svůj přirozený kontext, mohou vykazovat odlišné účinky na proces iniciace transkripce, Některé promotory nefungují správně, pokud jsou umístěny v plazmidu a naopak některé fragmenty DNA, které poskytují pozitivní signály v promotorových sondách, nefungují při následných testech jako reálné promotory. Reportérske geny poskytují spolehlivější výsledky tehdy, jsou-li umístěny v chromozomu a nikoli v umělém prostředí plazmídu. ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE IDENTIFIKACE PROMOTOROVÝCH REGULAČNÍCH ELEMENTŮ A PROTEINŮ VÁŽOUCÍCH DNA, Nejpřesnější metodou lokalizace promotorových sekvencí, stejně jako jiných sekvencí DNA, které tím, že představují vazebná místa pro specifické proteiny, ovlivňují transkripcí, je ověření jejich schopnosti interagovat s příslušnými proteiny. K tomuto účelu slouží kvasinkové .jednohybridní" testy, stopováni DNázou I („DNase I footprínting") a gelová zpomalovací anaiýza („gel retardation assay"). a) za nepřítomnosti Uartskripčniho faktoru nedochází k vazbé na testovanou sekvenci: reportérsky gen se neexprimuje -- __ reportérsky gen j kopie testované sekvence u) za prítomnosti í ran skripčni ho faktoru schopného vazby na testovanou sekvenci: exprese reportérskeho genu transkripční faktor Obr. 85 Kvasinkový jednohybridní systém Kvasinkové jednohybridní testy. Cílem kvasinkového jednohybridního systému je identifikace proteinů, které interagují s definovanou sekvencí DNA nebo naopak lokalizace oblastí DNA, které vážou známé transkripční faktory. Postupuje se tak, že se zkoumané nukleotidové sekvence začlení proti proudu transkripce od reportérskeho genu. Vzniklý konstrukt se pak včlení do kvasinkového genomu. Za nepřítomnosti transkripčních faktorů, které mají vazebnou afinitu k testované sekvencí, se reportérsky gen exprimovat nebude (obr. 85a). Pokud se však rekombinantni kvasinkový kmen transformuje cDNA pocházející z expresní knihovny a vzniknou klony, které daný transkripčni faktor vytvoří, dojde k jeho interakci s testovanou sekvencí a aktivaci transkripce reportérskeho genu (obr. 85b). Použití tohoto systému může být rozšířeno na další proteiny vzhledem k tomu, že eukaryotické transkripční faktory mají duální povahu. Obecně platí, že se skládají ze dvou domén: jedna doména zajišťuje specifický kontakt s určitými sekvencemi DNA (DNA-vazebná doména), ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE 135 druhá zodpovídá za aktivaci transkripce (aktivační doména). Tyto domény lze od sebe oddělit, aniž by tím byla jejich funkce ovlivněna. Lze proto spojit aktivační doménu jednoho proteinu s DNA-vazebnou doménou jiných proteinů. Vzniklá proteinová chiméra bude aktivovat transkripcí jiných genů podle specifity nové DNA-vazebné domény, Nej lepším příkladem je kvasinkový aktivátor GAL4, který zodpovídá za transkripcí genů zapojených do metabolizmu ga laktózy. Po odstranění DNA-vazebné domény proteinu G A L4 a jejím nahrazení jinou DNA-vazebnou doménou, bude hybridní protein aktivovat transkripci jiné sady genů. Této vlastnosti lze využít při tvorbě knihovny c DNA s v'yužitím speciálního vektoru obsahujícího sekvencí kódující aktivační doménu GAL4. V této knihovně budou produkty exprimovány v podobě proteinových chimér. Pokud se budou vázat na testovanou sekvenci, aktivační doména GAL4 bude aktivovat transkripci reportérskeho genu (obr. 85c). Protože transkripci zajistí aktivační doména GAL4, tento systém dokáže detekovat široké spektrum proteinů schopných vazby na DNA a nejen transkripční faktory. Vylepšenou verzí tohoto přístupu představuje kvasinkový dvouhybridní systém, který se používá pro studium interakcí mezi proteiny (str. 148). Stopování DNázou I („DNase I footprinting11). Metoda stopování DNázou I (nebo jen stopování) slouží k identifikaci té částí testovaného promotoru, která představuje vlastní vazebné místo pro transkripční faktor, Z jader izolovaných z příslušných buněk se nejprve purifikují proteiny. Tato směs, nebo z ní dále puntíkovaný specifický protein, se smísí s fragmentem DNA, který je předmětem analýzy. Paralelně se sestaví kontrolní reakce, ve které n en i zastoupen žádný protein. V obou reakcích je DNA radioaktivně značena na 3-konci. Následně se do obou reakcí přidá nukíeáza DNáza I, která rozštěpí všechny fosfo-d i esterov é vazby ve všech řetězcích DNA, ke kterým se dostane. Podmínky štěpení se však nastaví tak, aby reakce nemohla proběhnout úplně: jejím výsledkem v kontrolním vzorku bude náhodná fragmentace DNA do podoby žebříčku, ve kterém se budou vyskytovat fragmenty všech velikostí od neštěpené původní DNA, až po jednu bázi. Ve vlastním testovaném vzorku však DNáza J nebude mít přístup ke svému substrátu v těch místech, ve kterých byla DNA chráněna navázaným proteinem. Pokud se tyto dva vzorky nanesou na sekvenační gel a podrobí elektroforéze, je možné vymezit oblasti, ve kterých je pravidelné rozdělení fragmentů DNA kontrolního vzorku přerušeno - tzv. otisk proteinu. Tyto oblasti odpovídají chráněným oblastem DNA, na kterých v důsledku navázáni proteinu nedošlo k fragmentaci DNA nukleázou (obr. 86). Gelová zpomalovací analýza („gel retardation assay", „electrophoretic mobility shift assay"). Jiným způsobem, jak určit, zda je určitá sekvence DNA místem vazby daného proteinu, je využití gelové zpomalova- Obr.Só Stopování DNázou I cí a™1*^- Fragment testované značené DNA (sondy) se smísí s purifikovaným proteinem nebo směsí jaderných proteinů a DNA protein i chráněná ! Oblast X :.íi p. : OMézou -& - radioaktivní značka gelová elekUoforéza a autora d lografie A B A: kontrola bez proteinů B. testovaný vzorek otisk proteinu 136 ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE komplex protein-DNA provede se test pohyblivosti DNA elektroforézou. Jestliže se jeden nebo více z těchto proteinů váže k DNA, způsobí snížení její pohyblivosti v polyakrylamidovém nebo agarózovém gehi. Stupeň snížení pohyblivosti lze snadno demonstrovat při srovnání s kontrolní m vzorkem bez přidaného proteinu (obr. 87). Pro ověření specifity interakce protein - DNA se používají dva přístupy: (1) stejná reakce se provádí za přítomnosti zvyšujícího se množství proteinu a zvýšená dávka proteinu by se měla projevit úměrným snížením množství nenavázané sondy DNA a zvýšením množství fragmentu DNA s navázaným proteinem (obr. 87); (2) do reakce se přidá kromě proteinu a DNA sondy také protilátka specifická pro suspektní protein. Navázání této protilátky na cílový protein v komplexu s DNA se projeví dalším snížením pohyblivosti sondy (obr. 88). Jak stopování DNA, tak zpomalovací analýza jsou metody, které je možno použít pro analýzu interakcí jakýchkoliv proteinů s DNA a nejsou omezeny jen na studium interakcí transkripěních faktorů 3 DNA. značená DNA Obr. 87 Gelová zpomalovací analýza za přítomnosti puntíkovaného proteinu —! protein tnkubace za přítomnosti proteinu e protilátky -Y>-X protilátka i.imj.in.i.iMu'iptiij numjjt. L r._ . . nnj* I I III II I I I II I II [ IJ III! III I I II 1(14 fragment una 95 miliard nukleotidů ve více jak 54,1 milionu sekvencí pocházejících celkem od více než 200 000 různých organizmů nebo virů. Všechny tři genomo-vé databáze jsou volně dostupné a pHjimají data získaná v genomových centrech nebo na odborných pracovištích zabývajících se sekvencováním nukleových kyselin. Nové sekvence 163 BIOINFORM ATIKA nukleových kyselín se do databází vkládají pomocí speciálního WWW formuláře nazvaného Banklt pro databázi GenBank, Webln pro databází EMBL nebo Sakura pro daiabází DDBJ, Sekvence proteinů, u nichž bylo experimentálně stanoveno pořadí jejich aminokyselin, charakterizovány jednotlivé proteinové domény a stanovena jejich funkce, jsou ukládány v databázi SWISS-PROT založené na Univerzitě v Ženevě v roce 1986. Databázi spravuje Švýcarský institut pro bíoinformatiku (S1B), který se podílí na vytváření sítě propojených Jíitabázi sekvencí, Kompletní databázi sekvenci proteinů obsahuje SWISS-PROT spolu s doplňkem označeným TrEMBL, který obsahuje automaticky doplňované překlady kódujících oblastí z databáze sekvencí nukleových kyselin EMBL. Další důležitou databází z oblasti molekulární biologie je PDB {The Protein Databank), která se zabývá archivací a analýzou proteinových struktur a komplexů informačních biomakromolekul. 2. Textové vyhledávání v databázích Množství důležitých molekulárně-biologických dat se zvyšuje tak rychle, že je nezbytné mít k dispozici prostředky, pomocí kterých můžeme k těmto datům snadno přistupovat. Existují tří hlavní prostředky na získávání informací, které umožňují vyhledávání v molekulárně biologických databázích. Tyto prostředky jsou vstupním bodem do mnoha integrovaných databází a každý z nich byl vyvinut v jednom ze ttí hlavních center pro bíoinformatiku. Navzájem se liší v databázích, které mohou prohledávat, ve vazbách, které vytvářejí mezi jednotlivými databázemi a ve vazbách vztahujících se k dalším informacím (obr. 110). Obr. 110 Ukázka propojení databází na příkladu vyhledávače Entrez 164 BIO INF O RM ATIKA Vyhledávací systém pro molekulárně biologické databáze vyvinutý v NCBI se nazýva Entrez (URL http://www.ncbLnlm.nih.gov/Entrez/). Je vstupním bodem pro průzkum 45 různých integrovaných databází, z nichž řada je virtuálních. K nej významnějším databázím patří databáze PubMed umožňující přístup k literární databázi MEDLINE, databáze sekvencí nukleových kyselin a proteinů, databáze 3-D struktur MMDB (Mole cul ar Model ing Database) odvozená z P DB, skupina databází genomů a taxonomická databáze usnadňující získávání sekvencí na základě taxonomických skupin (obr. 111). Ze tří vyhledávacích prostředků je Entrez uživatelsky nej přijatelnější, ale zejména ve srovnání se SRS nabízí omezené, avšak pro základní účely postačující vyhledávací prostředky. NCBI search across databases J Help ^__Welcome to ttie new Entree cross-database search page P ubM e d: h i orr.e d i call iterative- citation 5 and ab slraets Hi ■ (tj Book*: online book* 1^ ONIN: Online Mendefian Inheritance in Maň PubMed Central: free, full text journal articles be Journal*: details J information about journals in Entrez MeSM: detailed information at out NLM's eontroiled vocabulary m Site Search: NCBI web and FTP sites J£ Nucleotide: 5equer1.cn database (GsnBirii*) (S Protein: sequence database S |{j Genome: whole flenoma sequences QJ Structure: three-dimensional macromolecular structures 03 •* T*nonomir: organisms in GenBank i3 itTll SNP: single nucleotide polymorphism ® ^ Gene: gene-centered information © JniGene: gene-oriented clusters of transcript sequences EDO: conserved protein domain database Q£& 3D Domains: domains from Entrez Structure UniSTSr markers and mapping d*ta Qq PnpSet: population study daw sets GEO: expression and molecular abundance profiles GEO DataSets: experimental sets of GEO date Obr. Ill Výchozí internetová stránka vyhledávače Entrez Významným databázovým nástrojem je SRS, homogenní rozhraní pro přístup k více než 160 molekulárně biologickým databázím vyvinuté v EBI (URL http://srs.ebi.ac.uk/). Typy databází zahrnují sekvence a z nich odvozená data, metabolické dráhy, transkripciu faktory, 3-D stmktury, genomy, mapování, mutace, jednonukleotidové polymorfLzmy a výsledky získané pomoci analytických nástrojů. Webové rozhraní umožňuje provádět před vyhledáváním výběr z jednotlivých databází a poskytuje alternativní formuláře pro zadávání vyhledávacích dotazů (obr. 112) (SRS). Na Internetu běží několik verzí SRS a každá z nich obsahuje jinou sadu databází a analytických nástrojů. I fi5 BIOINFORM ATIKA Library PW Fain_TooU Bacíte_Projag»« IJN I t Qutch SearchJ Se dieli ť )j)! i (pi i s ■ ftv ;i i I - rl 11 f u íi i ti 11 mír í. 1 Select tha databank* ysu wane to math I.Enter your sparih terms in the Qgitk Sunn li : rjr. chaos* i query farm i tatended »>^f ^ i are > vrju tan browse through -li the entries m any First, select the databanks ycu want to browse, disri dick: ■ fj, uu'.r clitricii ► bookmark this Ua(s to eturri to your project > LirtKU-.ť; to sr.?? - Pbaase read Bit* dottjmant (oi importani informátor) ■ ■igäiiiirtg lint mo to our SR$ -;erver. BUukiVVirkl e>tS ^rattan 5«o ONa/ENa Sag Structure!; r,nand JU Cf^iasuil ShOW £l3tab»r!ks turnus; E n FMftl. tUtidatesl □ FMRL fwGSi □ EiE5£U □ EHSEMBL HVMAH n FNSf MtU FlfiH H INK, tula □ UniPBflOO □ UniRsftO □ UmRefSO Lfj Literatur*, Bibliography and Retrrtmrc Database* i~J Nif tlifulidfr »quflnte dä-tatiii ^ SSI □ EMBi rj EMBL fJBBMdMl □ embl Protein [Translate] o Similarity searches [BLAST] o Pattern and profile searches [SeanProsite] o Post-lranslational modification and topology prediction o Primary structure analysis IProtParam. pI/MW. Protacalel o Secondary and tertiary structure prediction [SWISS-MODEL. Swiss-PdbViewtrl o Alignment [T-COFFEE. SIM] p Biological text analysis • Metallic 4 - Software for 2-D PAGE analysis • Roche Applied Science's Biochemical Pathways Dociuui-nlatioii • SWISS FLASH electronic bulletins • Swiss Prot documents • How to create HTML ttnks to ExPASv • Complete table of available documents Links (o some major molecular biology serve • European Bioinformatics Institute (EBt) • National Center for BiQleclwologv Information (WCBD • Japanese GenomeNet • Australian National Genomic: Infonnation Sendee (ANGIS> • ISREC bloinformaties group • BIQSCI/blonei Electronic Newsgroup Network for Biology • EMBnet Local lhiks • Geneva and Swiss local nates * Swiss Institute of BlotnftuT"? Hr s (str) . I lie Healtli On the vi foundation fHONj * Geneva ftiomfomiarirs (GeneBio) • G_enePrpt . Pi ptéiiies :í Ja «1 i 111- =-.- Obr. 113 Výchozí internetová stránka proteotnického serveru ExPASy 167 BIOINFORMATIKA 3. Vyhledávání podobností sekvencí Pro stanovení podobnosti sekvencí nukleotidů v nukleových kyselinách a aminokyselin v molekulách proteinů se používají nástroje pro seřazení („alignmenť') těchto sekvencí. Tyto nástroje mohou být použity i k dalším účelům jako je stanovení jejich struktury a evoluce. Sekvence mohou být srovnány buď na základě celkového nebo lokálního seřazení v závislosti na účelu tohoto srovnání. Běžnou otázkou, která vyvstane po sekvencování nových genů je, zda-li je podobná nebo shodná sekvence již známá a vyskytuje se v současných databázích. Rovněž při sestavování sekvencí rozpracovaných genomů do ucelených kontigů, a v konečné fázi celých genomů, se uplatňuje vyhledání shodných, překrývajících se úseků náhodných fragmentů sekvencí nukleových kyselin. Nejčastěji používané algoritmy pro případy tohoto lokálního seřazení sekvencí jsou velmi rychlé algoritmy programů BLAST (URL http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTO nebo FASTA (URL http://www.ebi.ac.uk/ fasta3/), využívající heuristickou strategii založenou na hledání úseků sekvencí vykazujících nej vyšší stupeň podobnosti. Pří srovnávání sekvencí nukleových kyselin variantou programu BLAST (BLASTN) je soubor všech sousedících x-merů (kde x je délka fragmentu sekvence (okno) zpravidla nastavená na hodnotu 11) postupně srovnáván s každou sekvencí v databázi. Nalezené shodné oblasti jsou potom rozšiřovány v obou směrech s použitím méně přísných podmínek pro nalezení shody. Během seřazení sekvencí jsou do sekvencí vkládány mezery tak, že úseky s úplnou nebo částečnou homologií jsou seřazeny nad sebou a navíc mohou být maskovány oblastí s nízkou komplexitou včetně definovaných repetitivních sekvencí (obr. 114). K posouzení významnosti shody nalezených úseků se používá numerická hodnota označovaná jako skóre seřazení sekvencí (S), která popisuje celkovou kvalitu seřazení sekvencí na základě porovnání pravděpodobnosti výskytu nalezených segmentů o určité sekvenční podobnosti s pravděpodobností, že se taková podobnost vyskytne mezi dvěma náhodnými sekvencemi. Vyšší číslo potom odpovídá vyšší podobnosti. Ekvivalentem skóre S je hodnota E (.^Expectation value"), která vyjadřuje počet různých seřazení sekvencí se skórem shodným nebo vyšším než je hodnota S, jejíž výskyt je očekáván při náhodném vyhledávání v databázi. Potom platí, že čím je hodnota E nižší, tím je skóre významnější. Jak sada programů BLAST, tak FASTA umožňují i další možnosti srovnání nukleotidových nebo aminokyselinových sekvencí s údaji v databázích včetně porovnáni translačních produktů všech čtecích rámců dotazované sekvence nebo celé databáze (tabulka 7). Tabulka 7 Využití jednotlivých variant programů BLAST Program Dotaz Databáze Úroveň srovnání Použití blastn DNA DNA DNA Hledání identických sekvencí DNA blasp Protein Protein Protein Hledání homologních proteinu blastx DNA* Protein Protein Hledání genů a homologních proteinů na nové DNA iblastn Protein DNA* Protein Hledání genů u necharakterizovaných DNA tblastx DNA* DNA* Protein Studium struktury genů Poznámka: * jsou srovnávány přeložené sekvence DNA ve všech čtecích rámcích 168 BIOINFORM ATIKA 40-50 50-80 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 ************************* m m * m Score = 202 bits (102), Expect = 5e-48 Identities = 179/207 (86%) Strand *! Plus / Plus Query: 2500 aagttaacttaaataatgegcaaggc-------gatttgggatatttaactgctggtaat 2559 I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I II I ! I I I I I I I I I I I I i i Sb^ct; 36439 aagttaacttaaataatgcgcaagggcgtttgggatttgggatatfctaactgctggtaat 364 98 Query: 2560 tactafcgcaacaagagtgccggatttaccaggtagcgttgaaagttatgagggttattta 2619 I I I I I I i I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I ! II I Sbjct: 36499 tactatgcaacaagagtgccggattt-ccaggtagcgttgaaagttatgagggttattta 36558 Query: 2620 actttagatgctatccagagggaaagacagatagacgnnnnnnnnnrigaaagaaaacgac 2679 I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I i I I I I I I I i I I I Sbjct: 36559 accttaga tgc ta 11 caaaaagaaaga gaaa tagatgaaaaga aaaagaa aga aaa tga t 3 6 613 Query: 2680 aaaaatatacgcgatatgaaaatgtgg 2706 II ! I I I I i I I I I I I I I ! i I I I I I i Sbjct: 36619 aagaacatacgtgatatgaaaatgtgg 36645 Obr. 114 Příklad grafického výstupu programu BLAST (horní část obrázku), znázorňujícího nalezené sekvence v databázi s určitou mírou identity a textového výstupu (dolní část obrázku), znázorňující lokální seřazení sekvencí s identickými bázemi nad sebou, vloženými mezerami a maskovanými místy s nízkou komplexitou (n) V případě seřazení aminokyselinových sekvencí porovnávaných proteinů je používáno pro každý pár aminokyselin substituční skóre, které bývá nejčastěji založeno na poměru pozorovaných substitucí, odvozeném z frekvence substitucí v mnohonásobných seřazeních sekvencí příbuzných proteinů. Skóre se počítá z frekvence výskytu aminokyselinových zbytků pro každou dvojici aminokyselin v evolučně příbuzných sekvencích a poskytuje hodnotu pravděpodobnosti seřazení dvou aminokyselin. Kompletní sada těchto skóre pro všechny kombinace párů aminokyselin se nazývá aminokyselinová substituční matice. Dva nejčastěji používané typy matic jsou PAM a BLOSUM. Zatímco matice PAM jsou založeny na konceptu akceptovatelných bodových mutací za 10s let v globálních mnohonásobných seřazeních blízce příbuzných proteinů, matice BLOSUM (blokové substituční matice) jsou odvozené z lokálních mnohonásobných seřazení bloků (motivů) více vzdálených proteinů v databázi BLOCKS. Míra podobností souboru sekvencí proteinů je tedy přímo ovlivněna výběrem určitého typu substituční matice. Vyhledání může být provedeno buď v základních 169 BIOIN FORM ATIKA genomových databázích, které obsahují většinu známých sekvencí nukleových kyselin, což je vhodné při hledáni nových dosud necharakterizovaných genů, nebo v databázích STS a EST (kapitola IV), což je vhodné při hledání nových homologických genů, při analýze exprese nebo lokalizaci na genomových mapách. Pro detailní celkové srovnání dvou nukleotidových nebo proteinových sekvencí se lze použít metodu grafického vykreslení tečkové matice, ve které je každý zbytek z jedné sekvence srovnáván š každým zbytkem ve druhé sekvenci. První sekvence tvoří osu x a druhá sekvence osu y. V oblastech, kde jsou si obě sekvence navzájem podobné tvoří řádek vysokých skóre diagonální linii přes tečkovou matici, podobné sekvence pak tvoří přerušované diagonální linie. Výsledkem je grafické vykreslení podobností sekvencí ve formě čtvercové nebo trojúhelníkové matice zobrazené v Šedé škále (obr. 115). Obr. 115 Příklad celkového vizuálního srovnání sekvencí označených V-l, V-2 a V-3 se sekvencemi H-l, H-2 a H-3 formou grafického znázornění podobností prostřednictvím tečkové matice Dalšim krokem v analýze sekvencí je jejich mnohonásobné seřazení, představující srovnání tří a více sekvencí s mezerami vloženými do sekvencí tak, že úseky sekvencí s úplnou nebo částečnou homologií jsou seřazeny ve stejném sloupci (obr. 116). To může odkrýt funkci genů, která není jasná z jednotlivých homologií sekvencí. Základní program používaný pro mnohonásobné seřazení sekvencí je ClustalW. Specializované softwary pak mohou na základě mnohonásobného seřazení sekvencí vybrat profily, které zahrnují pozičně specifickou informaci, která je odvozená od frekvence, se kterou se každý zbytek vyskytuje v daném sloupci. Skupiny sekvencí s určitou příbuzností jsou charakterizovány obvykle určitými konzervativními motivy a tato informace v mnoha případech umožňuje citlivé vyhledávání v databázích. Metody pro mnohonásobné seřazení sekvencí mohou být navíc rozvinuty do oblasti důležité pro fylogenetické analýzy a srovnávací genomiku. Obr. 116 Příklad mnohonásobného seřazeni sekvencí programem ClustalW --1--l„_„_,_1_1—, -. ., % s \ \ \ \ - \ \ v-3 H-3 V-1 V-2 170 B10 INFORMATIKA 4. Vyhledávání genů a funkčních oblastí Jednou z důležitých otázek analýzy sekvencí nukleových kyselin je způsob, jakým detekovat kódující oblasti genomové DNA. Mezi klíčové prvky, které jsou vyhledávány počítačovými metodami, patří iniciační a terminaČní kodony, místa sestřihuf promotory a terminátory transkripce, polyadenylační místa, vazebná místa pro ribozómy (RBS), vazebná místa pro topoizomerázy typu II, místa štěpení pro topoizomerázy typu I a vazebná místa pro tran-skripČní faktory. Takováto místa se nazývají signály. Vedle toho existují metody pro vyhledávání delších úseků genomu s variabilní délkou jako např. exony, introny, repetice, nebo geny pro funkční RNA, které tvoří obsahovou složku genomu. Metody pro vyhledávání signálů jsou založené na jednoduchém principu hledání konvenční sekvence spolu s možnostmi přípustných odchylek. Citlivější metody mohou být založeny namísto hledání signálů jako konvenčních sekvencí na použití vážených matic, ve kterých každá pozice vzoru připouští shodu s jakýmkoli zbytkem, ale různé zbytky mají v každé pozici přiřazenou jinou významnost. Ještě více propracované metody využívají statistické přístupy jako např. neuronové sítě. Nej důležitější metodou pro hledání obsahových složek genomu je předpovídání kódujících oblastí. U prokaryot je možné lokalizovat většinu genů jednoduchým hledáním otevřených čtecích rámců doplněným např, hledáním signálů pro vazebná místa ríbozómu. U euka-ryot jsou používány pro rozlišení kódujících oblastí genomu od nekódujících statistické modely frekvencí nukleotidů a závislostí přítomných ve struktuře kodonů. Nejčastěji používané statistické modely jsou známy jako Markovovy modely, využívané např. programem GeneMark. Integrované metody pro vyhledávání genů navíc zvažují skryté proměnné spojené s každým nukleotidem v konkrétní pozici; např. zbytek G může být součástí 5r-místa sestřihu nebo třetí pozice iniciačního kodonu a zbytek A může být součástí 3'-místa sestřihu nebo místa větvení. Takovéto modely jsou nazývány skryté Markovovy modely (HMM). Některé systémy pro vyhledávání genů kombinují mnohočetné statistické přístupy s hledáním homologie v databázích získaných translací všech čtecích rámců DNA do proteinu. Databáze sekvencí proteinů a databáze EST jsou potom používány pro ověření předpovídaných genů, 5. Klasifikace proteinů Pro účely efektivní automatické klasifikace a charakterizace proteinů byly vyvinuty sekundární klasifikační databáze proteinů shromažďující informace získané z primárních databází sekvencí ve formě charakteristických vzorů aminokyselinových sekvencí, které indikují určité strukturní nebo funkční prvky molekul. Hledání v těchto kolekcích je příkladem vysoce citlivého stylu vyhledávání určitého reprezentativního profilu charakteristického pro sekvenční rodinu a umožňuje identifikaci nových sekvencí proteinů s možností provedení predikce jejich funkce. Databáze charakteristických vzorů proteinů jsou založeny na různých přístupech a mohou obsahovat jednotky typu proteinových domén odvozených ze známých 3-D proteinových struktur, proteinové sekvence seřazené do skupin sekvenčních rodin na základě jejich identity neho z těchto rodin extrahované sekvence s charakteristickými vlastnostmi uložené ve formě popisu motivů. Pro seřazení motivů sekvencí jsou používány dynamické algoritmy programování. Výpočetní techniky používané pro vytvoření motivů mohou být rozděleny do čtyř tříd. Standardní metoda tvoří motiv na základě pozorovaných odchylek ve sloupcích mnoho- BlOÍNFORM ATIKA 171 násobného seřazení aminokyselinových sekvencí dané rodiny. Jiné techniky využívají automaticky se zdokonalující algoritmy, které se pokouší vytvořit motivy bez nutnosti mnohonásobného seřazení. Metody skrytých Markovových modelů se snaží umístit dostupná data na sekvenci s použitím místních optimalizačních algoritmů na základe pravděpodobnosti distribucí. A konečně některé techniky jsou tvořeny opakujícími se algoritmy, které zobecňují motiv opakovaným hledáním sekvence v databázi a používají vyvíjející se motiv. V současné době tvoří několik původně nezávislých sekundárních proteinových databází (PROSÍTE, Ptám, PRÍNTS, ProDom, SMART a TIGRFAMs) konsorcium poskytující integrovanou klasifikační databázi proteinů InterPro, která je dostupná prostřednictvím webového serveru (URL http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/), Využiti InterPro zahrnuje celou řadu biologicky důležitých oblastí, zejména automatické anotace proteinových sekvencí (obr. 117) a několik typů statistických a srovnávacích analýz genomových sekvencí jako hledání ortologních a paralogních genů, analýzu ontológie genů a strukturní informace proteinů. Mannosyl-g lycoprotei n endo-beta-N-ac etyig 1 ucosam id ase PF01&32Ů ^_ Lysoiyme subfamiiy CHAP r^HAP rfnmain PSÍ0&11 -,-, HHAP TMP :PFQ5017.3 «1« t nn rlBtrriphnn Päptidasa M23B PF01551.6 Prtpíirfasfl family M?3 t-snare SSF47661 w unifi(Ěgrat&d PD043582 ......... _ . ORI TH4 WArtfl/ nai TW^ PC 142729 ^^^^m Q8LTH4 WVW QSLTH4 P D4 64 651 imnnír nfll TH4 \AA/W nfli 1»^ PD48645S ^^^B Q8LTH4 WVW Q8LTH4 PD537455 - OfllTH4 WVW ňňtTHa PD552120 , (Tv^n* vww n^Ryfľ; PD565482 H Ofll TH4 WVW ľľlítt TH4 nm tw wvw nsi tvu SSF53S5Í ^_ Lysoíyme-liků Obr, 117 Příklad identifikace proteinu bakteriofágového bičíku pomoci integrované klasifikační databáze InterPro SEZNAM ANGLICKÝCH ZKRATEK 3SR Self-Sustaining Sequence Replication AFLP Amplification Fragment Length Polymorphism ALFA Automated Laser Fluorescence analysis APEX Arrayed Primer Extension AP-PCR Arbitrary Primed Polymerase Chain Reaction ARMS Amplification Refractory Mutation System ASA Allele-Specific Amplification ASO Allele Specific Oligonucleotide AS-PCR Allele Specific Polymerase Chain Reaction AS-PE Allele-Specific Primer Extension capture BAC Bacterial Artificial Chromosome BLAST Basic Local Alignment Search Tool BLOSUM BLock Substitution Matrix CFLP Cleavase Fragment Length Polymorphism CGH Comparative Genomic Hybridization COP Competitive Oligonucleotide Priming CPT Cycling Probe Technology DAF DNA Amplification Fingerprinting ddF Dideoxy Fingerprinting DDGE Denaturing Detergent Gradient Gel Electrophoresis DDRT-PCR Differential Display Reverse Transcriptase-PCR DEAE Diethylaminoethyl DEIA DNA Enzyme Immunoassay DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis. DHFR Dihydrofolate Reductase DMSO Dimethyl Sulfoxide DOL Dye-labeled Oligonucleotide Ligation DOP-PCR Degenerate Oligonucleotide Primed-PCR D-PCR Degenerate-PCR DSCP Double-Strand Conformation Polymorphism EBI European Bioinformatics Institute EC-PCR Expression Cassete-PCR EDTA Ethylenediarnine-N.N.N'^'-tetraacetic acid EMBL European Molecular Biology Laboratory EMSA Electrophoretic Mobility Shift Assay ERIC-PCR Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-PCR ESI Elecrrospray Ionization EST Expressed Sequence Tag ExPASy Expert Protein Analysis System E value Expectation value FACS Fluorescence-Activated Cell Sorter FERP Fluorophore-Enhanced REP-PCR FIGE Field Inversion Gel Electrophoresis FISH Fluorescence In situ Hybridization FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer 174 SEZNAM ANGLICKÝCH ZKRATEK GFP Green Fluorescent Protein GPT Guanine Phosphoribosyl Transferase GSLPA Genome Segment Lenght Polymorphism Analysis GSS Genome Survey Sequence HAT Histone Acetyltransferase HDAC Histone Deacefylase HGPRT Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyltransferase HMA Heteroduplex Mobility Assay HMM Hidden Markov Model HSV herpes simplex virus HTA Heteroduplex Tracking Assay IPCR Inverse Polymerase Chain Reaction IPTG Isop.ropyl-ß-D-thiogalactoside IRS-PCR Infrequent-Restriction Site Amplification ISH In situ Hybridization 1SSR Inter-Simple Sequence Repeat amplification ISTR Inverse Sequence-Tagged Repeats ITS-PCR Internal Transcribed Spacer-PCR kb kilo-base pair = 1 000 base pairs LCR Ligase Chain Reaction LDR Ligase Detection Reaction LUX Light Upon extension MAAP Multiple Arbitrary Amplicon Profiling MALDI Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization MALDI-TOF MS Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry MB Molecular Beacons MLST Multilocus Sequence Typing MPCR Multiplex PCR NASBA Nucleic Acid Sequence Based Amplification NCBI National Center for Biotechnology Information NLM National Library of Medicine NMR Nuclear Magnetic Resonance OLA Oligonucleotide Ligation Assay ORF Open Reading Frame PAC PI-derived Artificial Chromosome PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis PAM Point Accepted Mutation PAMSA PCR Amplification of Multiple Specific Alleles PASA PCR Amplification of Specific Alleles PCR Polymerase Chain Reaction PCR-EIA PCR-Enzyme Immunoassay PCR-ELISA PCR-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay PCR-ISH PCR-/n situ Hybridization PCR-OL A PCR followed by Oligonucleotide Ligation Assay PCR-RFLP PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism PFGE Pulsed-Field Gel Electrophoresis PMSF rjhenyl-methyl-sulphonyl fluoride PNA Peptide Nucleic Acid SEZNAM ANGLICKÝCH ZKRATEK PRINS Primed in situ labelling QBR OP-Replication assay QC-PCR Quantitative Competitive PCR QPCR Quantitative PCR RACE Rapid Amplification of cDNA Ends RAPD Random Amplified Polymorphic DNA RBS Ribosomal Binding Site RCA Rolling Circle Amplification RDA Representational Difference Analysis REA Restriction Endonuclease Analysis REAP Restriction Endonuclease Analysis of Plasmid DNA REP-PCR Repeat sequence primed PCR RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism RISC RNA-Induced Silencing Complex RPA Ribonuclease Protection Assay RS-PCR Ribosome Spacer-PCR RT-PCR Reverse Transcriptase-PCR SAMPL Selective Amplification of Microsatellite Polymorphic Loci SBH Sequencing by Hybridization SDA Strand Displacement Amplification SDS Sodium Dodecyl Sulfate SF-REA Small Fragment Restriction Endonuclease Analysis SIB Swiss Institute of Bioinformatics siRNA small interfering RNA SNP Single Nucleotide Polymorphisms SPAR Single Primer Amplification Reactions SRFA Selective Restriction Fragment Amplification SRFH Selective Restriction Fragment Hybridization SRS Sequence Retrieval System SSAP Sequence Specific Amplification Polymorphisms SSCP Single Stranded Conformational Polymorphism SSLP Simple Sequence Length Polymorphism SSR Simple Sequence Repeat SSSR Self-Sustaining Sequence Replication STR Short Tandem Repeat STS Sequence Tagged Site TAS Transcription-based Amplification System TGGE Temperature-Gradient Gel Electrophoresis T„ Annealing Temperature TK Thymidine Kinase Tm Melting Temperature TMA Transcription-Mediated Amplification URL Universal Resource Locator VNTR Variable Number Tandem Repeat XMP Xanthosine 5'-monophosphate YAC Yeast Artificial Chromosome REJSTŘÍK P-merkaptoetanol, 10 „melting temperature", 21 „nick translation", 23 2\3'-dideoxyTÍbonukleosidtrifosfát, 62 2,-deoxyadenozin-5'-a-tio-trifosfát, 69 2,-deoxyuridin-5'-trifosfátí 77 3 SR, 104 5-azacytidin, 117 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-fi-D- galaktozid, 34 5-metylcytozin, 67 absorbance, 10 aceíylace histonů, 117 acetyltransferázy histonové, 117 adaptor, 30 adenozin 5'-fosfosuifát, 68 AFLP viz polymorfizmus délky amplifikovaných fragmentů agaróza, 13 ALFA viz analýza fluorescenční laserová automatická alfa-komplementace, 34, 38 alkalická fosfatáza, 18 amplifikace alelově specifická, 89 amplifikace DNA vytěsňováním řetězce, 104 amplifikace konců cDNA rychlá, 91 amplifikace mezerníků vnitřních přepisovaných, 98 amplifikace mezi jednoduchými repetitivními sekvencemi, 101 amplifikace mikrosatelitaích polymorfnlch lokusů selektivní, 104 amplifikace nukleových kyselin za nepřítomnosti termofilní DNA- polymerázy, 104 amplifikace otáčivou kružnicí, 108 amplifikace polymorfní DNA náhodná, 99 amplifikace replikázou QP, 106 amplifikace restrikčních fragmentů selektivní, 102 amplifikace sondy, 106 amplifikace úseku DNA, 75 amplifikace vzácných restrikčních míst, 102 amplifikační reakce s jedním primerem, 101 amplifikační systém transkripční, 104 amplikon, 75 analýza fluorescenční laserová automatická, 101 analýza fragmentů RNA štěpených RNázouTl, 153 analýza gelová zpomalovací, 14,135 analýza konformačního polymorfizmu jednořetězců, 57,156 analýza otisku RNázaTl-oligonukleotidů, 152 analýza pohyblivosti heteroduplexů, 58, 157 analýza polymorfizmu délky segmentů genomu, 152 analýza reprezentativních rozdílů, 129 analýza reštrikční endonukleázová, 55 analýza retardační, 14 APEX, 69 AP-PCR viz reakce polymerázová řetězová náhodná APS, 63 apyráza, 68 ARMS viz mutační systém amplifikaci nedostupný ASA viz amplifikace alelově specifická ASO viz oligonukleotidy alelově- specifické AS-PC R viz reakce polymerázová řetězová alelově specifická AS-PE, 69 Aspergillus oryzae, 153 ATP sulfuryláza, 68 avidin, 23 BAC viz umělý bakteriální chromozom bakteriofág lambda, 36 bakteriofág Qp\ 106 banka genomová, 41 banka genová, 41 barviva fenantridinová, 10 barviva kyaninová fluorescenční, 80 betain, 79 bezchybnost syntézy DNA, 78 bioinformace, 162 182 REJSTŘÍK bioinforrnatika, 161 biotin, 23, 155 BLAST, 167 BLOSUM, 168 bod tání DNA, 21 BOX-PCR, 101 buňky kmenové embryonální, 113 cDNA, 32 celuláza, 7 centrifugace diferenciální, 11 centrifugace izokinetická, 11 centrifugace izopyknická, 12 centrifugace zonální, // CFLP viz polymorfizmus délky fragmentů DNA vytvořených cleavasou CGH viz hybridizace srovnávací genomová CIB, 162 cleavasa I, 56 ClustalW, 169 COP viz připojení oligonukleotidu kompetitivní CPT viz technologie sondy cirkulující cytometrie průtoková, 146 čas reorientační, 15 činidlo chelatační, 75 čip DNA, 69,131 čip EST, 132 DAF, 99 databáze DDBJ, 162 databáze EMBL, 162 databáze GenBank, 162 databáze genomová, 162 databáze InterPro, / 71 databáze MEDLINE, 162 databáze MMDB, 164 databáze molekulárně biologické, 162, 163 databáze PDB, 163 databáze Pfam, 171 databáze PRJNTS, 171 databáze ProDom, 171 databáze PROSÍTE, 171 databáze proteinů sekundární klasifikační, 170 databáze SMART, 171 databáze SWISS-PROT, 163 databáze TIGRFAMs, 171 ddF viz dideoxy-fingrprinting ddNTP viz 2\y- dideoxyribonukleosidtrifosfát DDRT-PCR. viz display diferenciální deacetylázy histonové, 117 DEAE-dextran, 112 DEIA, 152, 159 delece přilehlé - vytváření, 66 denaturace alkalická, 8 denaturace DNA, 20 deoxyribonukleáza, 19 DGGE viz elektroforéza gelová denaturační gradientova DHFR, 116 diagnostika molekulární, 54 diagnostika prostřednictvím PCR, 82 Dicer, 118 dideoxy-fingrprinting, 94 dietylpyrokarbonát, 10 digoxigenin, 23 dimetylsulfát, 60 dimetylsulfoxid, 79,112 display diferenciální, 130 display fágový, 149 dithiotreitol, 10 DMSO viz dimetylsulfoxid DNA cizorodá, 29 DNA klonovaná, 29 DNA metyltransferáza, 116 DNA-macroarray (DNA-makropole), 132 DNA-microarray (DNA-mikropole), 69, 131,132 DNA-pol I viz DNA-polymeráza I DNA-polymeráza disponující 3-exonukleázovouaktivitou, 78 DNA-polymeráza fága 29, 108 DNA-polymeráza l, 17 DNA-polymeráza Pfu, 78 DNA-polymeráza Pwo, 78 DNA-polymeráza Taq, 73 DNA-polymeráza Tth, 79, 91 DNáza I, 19,135 DNáza I pankreatická, 66 DNAzym, 118 DOL, 108 domény proteinové, 170 dominantní negativita, 119 REJSTŘÍK 183 DOP-PCR viz reakce polymerázová řetězová s degenerovanými oligonukleotidovými primery D-PCR viz reakce polymerázová řetězová degenerovaná DSCP viz polymorfizmus konformace dvouřetězců EBI, 162 EC-PCR, 89 EDTA, 7 elektroforéza, 13 elektroforéza dvourozměrná, 144,145, 153 elektroforéza gelová, 13 elektroforéza gelová denaturační gradientova, 16 elektroforéza gelová polyakrylamidová, 140 elektroforéza gelová pulzní, 14 elektroforéza horizontální, 13 elektroforéza kapilární, 13 elektroforéza vertikální, 13 elektroporace, 33,112 EMSA, 14 Entrez, i 64 ER1C-PCR, 10! EST viz místo s expresní adresou etidiumbromid, 10,14 exonukleáza Bal31, 19, 67 exonukleáza III, 19, 67 ExPASy, 165 exprese genová, 116,121 exprese heterologní, 29 extrakt sbalovací, 37 FACS, 95 FASTA, 167 fenotyp Spi", 38 FERP viz reakce polymerázová řetězová interrepetitivní fluorescenčně zdokonalená fingrprint DNA, 55 FÍSH viz hybridizace fluorescenční in situ fluorescein, 23, 80 fluorescence, 79 fluorofor, 79 fokusace izoelektrická, 144 fosfatáza, 17 FRET viz přenos energie fluorescenční rezonancí G418, 116 gel agarózový, 13 gel polyakrylamidový, 13,16 gen cl, 38 gen en v, 159 gen gag, 153 gen reportérsky, 133 genom, 121 geny ortologní, 97 GFP, 133 gradient CsCI, 13 gradient diskontinuální, 12 gradient hustotní, 12 gradient kontinuální, 12 gradient sacharózový, 12 GSLPA viz polymorfizmus délky genomových segmentů GTC víz guanidin thiokyanát guanidin thiokyanát, 152 HAT, 117 HDAC, 117 heteroduplex, 58, 157 HIV, 152,157 HMA viz analýza pohyblivosti heteroduplexů HMM viz modely Markovovy skryté hodnota E, 167 hodnota S, 10 homoduplex, 58, 157 HTA, 152,159 HTLV-1, Í52 HTLV-2, 152 hustota vznáší vá, 12 hybridizace, 34 hybridizace fluorescenční in situ, 27 hybridizace in situ, 27, 97,126 hybridizace kolonií, 25 hybridizace nukleových kyselin, 20 hybridizace plak, 25 hybridizace restrikčních fragmentů selektivní, 55 hybridizace srovnávací genomová, 95 hybridizace subtraktivní, 128 hybridizace tečková (kapková), 25 hybridizace zpětná (reverzní), 25, 152 hybridizační podmínky málo přísné, 25 hybridizační podmínky přísné, 25 hydrazin, 60 hygromycin B, 116 184 REJSTŘÍK chiméra proteinová, 38 chlorid česný, 12 chlorid litný, 151 chromatografie afinitní, P chromatografie gelová, 9 chromatografie iontoměničová, 9, 145 chromatografie sloupcová, 145 identifikace DNA, 54 imunoprecipitace, 142 inaktivace genu cl, 38 inaktivace inzerent, 34 inaktivace produktu PCR, 77 inhibitor syntézy DNA koncový, 62 interkalace, 10 internet, 161 inzert, 29 inženýrství genové, 29 IPCR viz reakce polymerázová řetězová obrácená IPTG viz izopropyl-P-D-tiogalaktozid IRS-PCR viz amplifikace vzácných restrikčních míst ISH viz hybridizace in situ ISSR viz amplifikace mezi jednoduchými repetitivními sekvencemi ISTR viz repetice inverzní sekvenčně značené ITS-PCR viz reakce polymerázová řetězová vnitrních přepisovaných mezerníků izopropyl-p-D-riogalaktozid, 34 izoschizomer, 19 jednotka Svedbergova, / / kapacita klonovací, 36 kináza, 17 Klenowův enzym, / 7 Klenowův fragment DNA-pol l, 17 klon DNA, 29 klon molekulární, 29 klonování DNA, 29 klonování genů, 29 klonování molekulární, 29 klony přeskakovací, 44 klony spojující, 50 knihovna cDNA, 41 knihovna genomová, 41, 54 knihovna genová, 41 knihovna genová expresní, 41 knihovna pro přeskakování, 44 knihovna spojujících klonů, 50 koeficient sedimentační, 10,11 konec kohezní, 30 konec lepivý, 30 konec primeru lepivý, 89 kontaminace DNA při PCR, 76 kontig, 48, 50, 66 kontroly při PCR, 76 kosmid, 38 kyselina hydroxamová, 117 kyselina katalytická nukleová, 118 kyselina mykofenolová, /16 laurylsíran sodný, 7,141 LCR viz reakce ligázová řetězová LDR viz reakce ligázová detekční ligáza, 17,107 lipozom, 112 luciferáza, 23, 68, 133 luciferin, 68 lysozym, 7 lyže buněk, 7 MAAP, 99 majáky molekulární, 82 MALDI, 161 mapa fyzikální, 45 mapa kontigová, 50 mapa makrorestrikční, 47, 48 mapa reštrikční, 45 mapování kontigové, 48 mapování reštrikční, 45 marker selekční, 33 matice substituční aminokyselinová, 168 matice tečková, 169 MB viz majáky molekulární metotrexát, 116 metylace DNA, 67,116 metyláza, 17 mikročipy proteinové, 146 mikroinjekce, 113 mikrosatelit, 52, 56, 99 minisatelit, 52, 56 minisekvencování, 69 místo mnohočetné klonovací, 33 místo reštrikční, 19 místo s expresní adresou, 52 místo se sekvenční adresou, 52 místo štěpení, 19 místo vazebné pro ribozóm, / 70 modely Markovovy, / 70 REJSTŘÍK 185 modely Markovovy skryté, 170 modifikace konců DNA, 89 molekula DNA rekombinantní, 29 mutační systém amplífikaci nedostupný, 89 NASBA, 104 NCBI, 162 NIG, 162 NLM, 162 NMR, 161 nukleáza, 17 nukleáza SI, 19 nukleová kyselina protismyslná, / / 7 OLA viz stanovení liga ční olígonukleotidové oligonukleotidy alelově-specifické, 76 oligonukleoiidy návnadové („decoy"), 118 oligonukleotidy protismyslné, 117 organizmus transgenní, 29 otisk DNA, 55 PAC viz umělý chromozom odvozený z bakteriofága P1 P AM, 168 PAMSA, 90 panel radiačních hybridů, 54 PASA viz amplifikace ale lově specifická PCR viz reakce polymerázová řetězová PCR-EIA, 76 PCR-ELISA, 76 PCR-ISH viz reakce polymerázová řetězová in situ PCR-OLA, 108 PCR-RFLP viz polymorfizmus délky restrikčních fragmentů u produktů PCR PCR-ribotypizace, 99 PCR-SSCP, 57, 152 peptidová nukleová kyselina, 24 peroxidáza, 23 PFGE viz elektroforéza gelová pulzní piperidin, 60 plazmid pBR322,34 plazmid Ti, 115 PMSF viz fenylmetylsuifonylfluorid PNA viz peptidová nukleová kyselina pohyblivost elektroforetická, 14 pohyblivost heteroduplexů, 58 polyakrytamid, 13 polylinker, 33 polymeráza, 17 polymorfizmus amplifikační sekvenčně specifický, 104 polymorfizmus délky amplifikovaných fragmentů, 5(5,102 polymorfizmus délky fragmentů DNA s jednoduchou repeticí, 56 polymorfizmus délky fragmentů DNA vytvořených cleavasou, 56 polymorfizmus délky genomových segmentů, 159 polymorfizmus délky jednoduchých repetit i vních sekvencí, 99 polymorfizmus délky restrikčních fragmentů, 55 polymorfizmus délky restrikčních fragmentů u produktů PCR, 85 polymorfizmus konformace dvouřetězců, 57 polymorfizmus konformace j ednořetězců, 57 polymorfizmy genomů, 54 polymorfizmy jednonukleotidové, 69 polymorfizmy korďormačni, 55 posun jednořetězcového zlomu, 23 prime r ale lově specifický, 90 prime r AmpliFluor, 82 primer LUX, 82 prime r oligo(dT), 91 primer pro AFLP, 102 primer pro ligázovou řetězovou reakci, 107 primer pro PCR, 73 primer pro sekvencování, 61 primer SDA, 105 příměry degenerované, 96 primery degenerované olígonukleotidové, 95 primery navrhování, 74 primery sekvenační univerzální, 62 primery vnější, 87 primery vnitřní, 87,159 PRÍNS viz značení in sítu zprostředkované příměrem prodlužování příměru, 23 produkt PCR, 75 procházení po chromozomu, 42 procházení příměrem, 66 186 REJSTŘÍK promotor SP6, 104,155 promotor T7,104, 155 pronáza E, 8 proteáza, 8 proteináza K, 8 proteom, 121 protilátka/anrigen, 142 protilátky monoklonální, 137 protilátky polyklonální, 137 přenos energie fluorescenční rezonancí, 80 přenos northernový, 26,121 přenos po eíektroforetické separaci, 26 přenos Southernův, 26,152 přenos westernový, 26, 140 přeskakování po chromozomu, 44 připojení oligonukleotidu kompetitívní, 89 psoralen, 77 puromycin, 116 Pyrococcus furiosus, 78 Pyrococcus woesei, 78 pyrosekvencování, 67 QBR viz amplifikace replikázou Q p QC-PCR viz reakce polymerázová řetězová s kvantitativně kompetitivním stanovením QPCR viz reakce polymerázová řetězová kvantitativní RACE viz amplifikace konců cDNA rychlá RAPD viz amplifikace polymorfní DNA náhodná RBS viz místo vazebné pro ribozóm RCA viz amplifikace otáčivou kružnicí RDA viz analýza reprezentativních rozdílů REA viz analýza reštrikční endonukleázová reakce ligázová detekční, 108 reakce ligázová řetězová, 107 reakce polymerázová řetězová, 24, 73 reakce polymerázová řetězová ale lově specifická, 89 reakce polymerázová řetězová Alu-sekvencí, 101 reakce polymerázová řetězová asymetrická, 64, 94 reakce polymerázová řetězová degenerovaná, 96 reakce polymerázová řetězová "hot~start", 76 reakce polymerázová řetězová in situ, 97 reakce polymerázová řetězová interrepetitivní fluorescenčně zdokonalená, 101 reakce polymerázová řetězová inverzní, 88 reakce polymerázová řetězová kolonií, 88 reakce polymerázová řetězová kvantitativní, 79 reakce polymerázová řetězová mnohonásobná, 85 reakce polymerázová řetězová náhodná, 99 reakce polymerázová řetězová obrácená, 88 reakce polymerázová řetězová odstupňovaná, 87 reakce polymerázová řetězová pro amplifikaci dlouhých úseků DNA, 78 reakce polymerázová řetězová repetitivní, 100 reakce polymerázová řetězová s degenerovanými oligonukleotido- vými primery, 95 reakce polymerázová řetězová s kvantitativně kompetitivním stanovením, 79 reakce polymerázová řetězová vmtřních ribozomálních mezemíků, 99 reakce polymerázová řetězová zpětná, 90, 124 rehybridizace, 27 renaturace DNA, 20 reorientace, 15 repetice Alu, 101 repetice inverzní sekvenčně značené, 101 repetice tandemové, 99 replikáza Qp, 106 REP-PCR viz reakce polymerázová řetězová repetitivní reštrikční endonukleázy, 19 reštrikční fragment, 19 retro viry, 113 RFLP viz polymorfizmus délky restrikčních fragmentů REJSTŘÍK 187 ribonukleáza, 7, 19 ribotypizace, 56 ribozym, 118 RISC, 118 RNA interference, 118 RNA-polymeráza, 123 RNáza, 19 RNáza H, 104, 108 RNáza iii, 106 rodamin, 23 rozpoznávací (cílové) místo, 19 roztok gradientní, / / RPA víz test ochrany před účinkem RNázy A RS-PCR viz PCR-ribotypizace, viz reakce polymerázová řetězová vnitřních ríbozomálních mezemíků RT-PCR viz reakce polymerázová řetězová zpětná RT-PCR v reálném Čase, 124 RT-PCR-RFLP, 152 rychlost úhlová, 11 sacharóza, 12 SAMPL viz amplifikace mikrosatelitních polymorfních lokusů selektivní SBH viz sekvencování pomocí hybridizace SDA viz amplifikace DNA vytěsňováním řetězce SDS-PAGE, 141 sekvence AIu, 101 sekvence aminokyselinová, 59 sekvence DNA, 59 sekvence jednoduchá repetiti vní, 99 sekvencování +1 -,61 sekvencování celogenomové, 52, 66 sekvencování DNA, 16, 59 sekvencování DNA automatické, 63 sekvencování enzymové, 61 sekvencování genomu, 66 sekvencování genomu virů, 153 sekvencování hydrogensiřičitanové genomové, 67 sekvencování chemické, 59 sekvencování Maxamovo-Gtlbertovo, 59 sekvencování náhodné, 66 sekvencování pomocí hybridizace, 69 sekvencování Sangerovo, 61 sekvencování uspořádané, 66 Sequenase, 62 seřazení sekvencí celkové, 167 seřazení sekvencí lokální, 167 seřazení sekvencí mnohonásobné, 169 siRNA, 118 skóre seřazení sekvencí, 167 skrínink diferenciální, 127 skříni nk dvouhybridní, / 48 SNP víz polymorfizmy jednonukleotidové sonda cirkulující, 108 sonda hybridizační, 22 sonda pro vyhledání produktů hledaných genů, 42 sonda pro vyhledání sekvencí DNA, 42 sonda Scorpion, 82 sonda TaqMan, 80 sondy jednolokusové, 56 sondy rrmoholokusové, 56 SPAR viz ampiifikační reakce s jedním příměrem spec i íi ta relaxovaná (uvolněná), 20 spektrometrie hmotnostní, 145 spermidin, 79 spin column, 9 spojka (linker), 30 SRFA viz amplifikace restrikčních fragmentů selektivní SRFH viz hybridizace restrikčních fragmentů selektivní SRS, 164 SS AP viz polymorfizmus ampiifikační sekvenčně specifický SSCP vjz analýza konformačního polymorfizmu jednořetězců, viz polymorfizmus délky fragmentů DNA vytvořených cleavasou, viz polymorfizmus konformace jednořetězců SSLP viz polymorfizmus délky fragmentů DNA s jednoduchou repeticí SSR viz sekvence jednoduchá repetiíivní standard hmotnostní, 14 standard velikostí, 14 stanovení ligační oligonukleotidové, / 08 stanovení sekvence DNA nepřímé, 69 stanovení sekvence DNA přímé, 69 STR viz mikrosatelit srrcptavidin, 23, 155 STS viz místo se sekvenční adresou 188 REJSTŘÍK Svedberg, 11 SYBR, 14 SYBR* Green, 80 systém kvasinkový dvouhybridní, 148 T4-DNA-ligáza, 18 T4-polynukleotidkináza, 18 TAS viz amptífikační systém transkripční technologie sondy cirkulující, 108 teplota pro připojení (hybridizaci) primerů, 75 teplota Ta, 75 teplota Tn,, 75 terminálni deoxyribonukJeotidyítransferáza, 18 terminátory značené barevně, 64 termocykler, 74 test jednohybridní, 134 test ochrany před účinkem RNázy, / 22 test ochrany před účinkem RNázy A, 152, 155 test prodloužení primeru, 126 Thertnus aquaticus, 73,107 Thermus thermophillus, 79 TK, 115 TMA, 104 transfekce, lil transformace, 33 transgen, 113 transkriptom, 121 trichostatin A., 117 tymidinkináza, 115 typizace binární, 99 typizace DNA, 54 umělý bakteriální chromozom, 39 umělý chromozom odvozený z bakteriofága Pl, 39 umělý kvasinkový chromozom, 39 uracil-N-glykosyláza, 77 vazba příměrů, 74 vazba příměrů nespecifická, 75 vektor expresní, 36 vektor inzerční, 36 vektor klonovací, 29, 32 vektor kyvadlový, 36 vektor odvozený z bakteriofága lambda, 36 vektor odvozený z bakteriofága Ml3, 38 vektor plazmidový, 32 vektor rekombinantní, 32 vektor substituční, 36 vyhledávám genů, 42, 170 vyhledávání v databázích, 163 X-gal, 34 YAC viz umělý kvasinkový chromozom zebularin, 117 zhášeč, 79 značení in silu zprostředkované příměrem, 98 značení sond, 22, 23 značeni transkripcí in viíro, 24 zpětná transkriptáza, 18 zpětná transkriptáza viru AMV, 90 zpětná transkriptáza viru M-MuLV, 90 zrychlení odstředivé, 11